黃小宸, 李科林, 吳雨霏, 蘇文龍

(中南林業(yè)科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 湖南 長沙 410004)

0 引言

近年來,水環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了不同程度的抗生素殘留[1],其中就包含我國常用抗生素中的氧氟沙星(Ofloxacin,簡稱OFL)[2],OFL的自然降解能力有限,人和動物使用后大部分排出體外,在水體中不斷遷移積累,不僅威脅水生生物的生存,還會損害微生物的生態(tài)平衡.市政廢水[3]和醫(yī)院出水中[4]OFL的檢出濃度在ng/L到μg/L,制藥廠出水中[5]甚至達到mg/L.

目前去除抗生素的方法有物理法、化學(xué)法和生物法.物理法通常只是抗生素的物理轉(zhuǎn)移,抗生素分子結(jié)構(gòu)基本沒有發(fā)生變化,無法起到真正的去除作用.化學(xué)法造價高,對技術(shù)與環(huán)境要求極高,在反應(yīng)過程中易產(chǎn)生毒性副產(chǎn)物.生物法中的微生物處理是去除廢水中抗生素的常用工藝,主要依靠微生物新陳代謝分解抗生素,但抗生素對微生物存在一定的抑制作用,只要保證微生物不被直接殺滅,微生物處理法將是最佳選擇[6],因此篩選抗生素優(yōu)勢降解菌株的研究被提出.

Prieto等[7]發(fā)現(xiàn)白腐真菌能夠利用漆酶降解環(huán)丙沙星和諾氟沙星;Erickson等[8]發(fā)現(xiàn)牛腸分離物蠟樣芽孢桿菌P41可以降解頭孢噻呋;郭夏麗等[9]對黃孢原毛平革菌進行固定化培養(yǎng)后用來降解磺胺甲惡唑,其去除率高達100%;沈東升等[10]發(fā)現(xiàn)高效降解葡萄球菌能夠提升豬糞中土霉素約20%的去除效率;馬玉龍等[11]從長期堆放泰樂菌素藥渣的土壤中篩選出的無丙二酸檸檬酸桿菌與越南伯克霍爾德菌,二者均能夠?qū)μ肪剡M行有效去除;付泊明等[12]從醫(yī)藥廠廢水中分離得到一株諾氟沙星降解菌NOR36,去除率最大可達92.6%.由此可見,篩選優(yōu)勢降解菌株以消除抗生素污染具有巨大的潛力.

本研究從污水廠剩余活性污泥中馴化篩選出了一株OFL降解菌并考察了其去除性能,對于有效治理水體中殘留的OFL有著一定意義及價值,為降解菌的工程化應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ).

1 實驗部分

1.1 實驗材料

活性污泥取自長沙某城市污水廠剩余污泥池.OFL標準品純度98%,產(chǎn)自麥克林生化科技公司.

富集培養(yǎng)基:CH3COONa 1.5 g,NH4Cl 2 g,K2HPO41.5 g,KH2PO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 1.0 g,超純水補足1 000 mL,pH 7.0.

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,超純水補足1 000 mL,pH 7.2.

無機鹽培養(yǎng)基:NH4Cl 2 g,K2HPO41.5 g,KH2PO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 1.0 g,超純水補足1 000 mL,pH 7.0.

固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入2.0%的瓊脂.

1.2 實驗方法

1.2.1 降解菌的篩選

在2 000 mL燒杯中投加1 500 mL的活性污泥,污泥沉降比約10%,加入OFL使其初始濃度約為500 mg/L,曝氣馴化48 h.取10 mL馴化后的污泥轉(zhuǎn)接至富集培養(yǎng)基(含有5 mg/L OFL),30 ℃、160 rpm搖床培養(yǎng)10天后再取10 mL污泥轉(zhuǎn)接至新的富集培養(yǎng)基,按濃度梯度(5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L)依次增加OFL.連續(xù)轉(zhuǎn)接4次后,取1 mL富集液進行10-2～10-8梯度稀釋,分別取0.1 mL涂布于LB固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h,待平板長出菌落后,挑取單菌落劃線分離,純化得到單菌落,挑取已純化的菌株轉(zhuǎn)接至無菌的含有OFL的富集培養(yǎng)基中進行篩選降解實驗,使用分光光度計檢測細菌生物量,高效液相色譜儀(HPLC)檢測OFL濃度,液質(zhì)聯(lián)用儀(HPLC-MS)檢測分析降解產(chǎn)物.

1.2.2 菌株的微生物學(xué)實驗方法

將降解菌涂布于LB固體培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落形態(tài)特征.

參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》與《伯杰氏細菌鑒定手冊》,開展生理生化鑒定實驗[13].

1.2.3 菌株測序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

委托專業(yè)公司對菌株進行16SrDNA測序以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建.

1.2.4 菌株種子液的制備

挑取LB固體平板上的單菌落,接種至LB液體培養(yǎng)基擴培,30 ℃、160 rpm搖床培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600 nm=0.6)時,離心棄去上清液,用生理鹽水洗滌菌體2次,重懸于等體積的無菌超純水中作為種子液.

1.2.5 菌株生物量的檢測

菌株生物量的檢測,可參考文獻[14]進行.

1.2.6 OFL含量的測定

OFL含量的測定,可參考文獻[15]進行.

1.2.7 降解菌的生長降解曲線

在OFL濃度為10 mg/L的富集培養(yǎng)液中以10%(v/v)的接種量接入種子液,在30 ℃,160 rpm搖床培養(yǎng)箱中進行降解實驗,每日定時取樣檢測,采用分光光度法測定菌株生物量OD600 nm,高效液相色譜法測定OFL殘留含量.做3組平行試驗.

1.2.8 環(huán)境因子對菌株去除性能的影響

選擇接種量(0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%,v/v),初始OFL濃度(1 mg/L、 5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L),溫度(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃),溶液pH(5、6、7、8、9、10),碳源(空白對照、葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、碳酸鈉,濃度均為5 g/L),鹽濃度(0 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L)6個主要環(huán)境因子,考察對降解菌去除性能的影響.將種子液轉(zhuǎn)入無菌的富集培養(yǎng)基中進行降解實驗,160 rpm搖床培養(yǎng),采用HPLC測定OFL殘余的含量.除接種量實驗外細菌接種量均為10%(v/v),除初始濃度實驗外OFL濃度均為10 mg/L,除溫度實驗外培養(yǎng)溫度均為30 ℃,除pH實驗外培養(yǎng)基pH均為7,除碳源實驗外碳源均為乙酸鈉,除鹽濃度實驗外鹽濃度均為5 g/L,所有實驗均在無菌且避光的條件下完成,每組進行3組平行試驗.

1.2.9 正交試驗

依據(jù)單因素試驗的結(jié)論,設(shè)置三因素三水平來探究對OF01去除性能的影響.通過對正交試驗和極差的分析得到OF01菌株的最佳降解條件,三因素對OF01菌株去除性能影響的主次順序.

2 結(jié)果與討論

2.1 降解菌的篩選

篩選得到一株對OFL有去除效果的菌株,命名為OF01,去除效率為63.79%.

降解菌OF01在LB固體平板上呈現(xiàn)較小的圓形灰白色不透明菌落,質(zhì)地濕潤粘稠、不易被挑起,邊緣不規(guī)則、有褶皺,內(nèi)部扁平,如圖 1所示.

生理生化鑒定結(jié)果:革蘭氏染色為陰性,氧化酶陽性,接觸酶陽性,淀粉水解陰性,脲酶實驗陰性,吲哚實驗陰性,H2S實驗陰性,明膠液化陰性.具體如表 1所示.

OF01菌株形態(tài)與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的產(chǎn)堿桿菌科形態(tài)描述較為相同,并且生理生化特征與賀海燕等[16]發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)堿桿菌屬細菌的生理生化實驗結(jié)果基本吻合.

OF01菌株經(jīng)測序后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 2所示.結(jié)果顯示OF01與Alcaligenes(產(chǎn)堿桿菌屬)同源性達到99%以上,鑒定OF01菌株屬于Alcaligenes(產(chǎn)堿桿菌屬).

2.2 OFL降解菌的去除性能

2.2.1 降解菌OF01的生長降解曲線

降解菌OF01去除OFL的生長降解曲線如圖 3所示.由圖3可知,菌株在接種2 d后開始迅速增長,進入對數(shù)生長期,此時OFL濃度也開始快速下降;7 d時菌株進入穩(wěn)定期,第10 d達到生物量最大值,OFL去除率達到最大值為63.79%,此后OFL去除率基本保持不變,這和菌株的生長受到抑制相關(guān).江紫薇等[17]從土壤中分離得到的1株二甲四氯降解菌的降解特性研究中也出現(xiàn)了同樣趨勢的生長降解曲線,細菌對有機物的利用速率一般與生長所處時期相關(guān),說明OF01菌株對OFL有一定去除能力.

2.2.2 細菌接種量對OF01去除性能的影響

OF01菌株在不同接種量條件下對OFL的去除效率如圖 4所示.由圖4可知,無細菌作用時OFL的自分解能力非常弱,細菌接種量的增加對OFL去除效率沒有十分明顯的影響(P>0.05),但對去除率的影響大致呈現(xiàn)出先增后減的小幅變化,30%(v/v)接種量的結(jié)果增高不排除為實驗誤差.這與張衛(wèi)[18]提取的阿維菌素降解菌的特性相似,推測可能是因為在相對的生長環(huán)境下碳源有限,降解菌生長到一定數(shù)量后所需碳源不足.在實際含OFL廢水處理過程中,為了保證經(jīng)濟實用,細菌接種量越少,成本也就相對越低,因此最佳接種量為10%(v/v).

2.2.3 初始OFL濃度對OF01去除性能的影響

OF01菌株在不同初始OFL濃度下對OFL的去除效率如圖 5所示.由圖5可知,各處理之間差異性顯著(P<0.05),在初始OFL濃度1 mg/L到25 mg/L范圍內(nèi),去除效率先升高后降低,初始濃度為15 mg/L時,去除率達到最大,為65.16%;OF01菌株能夠利用OFL作為碳源和能源,對于OFL濃度高的廢水有一定耐受性.一定條件下,初始OFL濃度的增大可提高菌株的生長和去除效果,但是當OFL濃度超過細菌的耐受能力時,細菌生長受到抑制,去除性能隨之減弱,與李麗[19]分離得到的氯嘧磺隆高效降解菌的生物學(xué)研究特性一致.因此最佳初始OFL濃度為15 mg/L.

2.2.4 溫度對OF01去除性能的影響

OF01菌株在不同溫度條件下對OFL的去除效率如圖6所示.由圖6可知,25 ℃與30 ℃之間、25 ℃與35 ℃之間無顯著性差異(P>0.05),其余各處理之間差異性顯著(P<0.05).隨著溫度增高,去除效率先升高后降低,溫度為30 ℃時,去除效率達到最大63.92%.低溫使細菌代謝能力減弱、生長速度下降.溫度升高增加了OF01菌株與OFL之間的粒子碰撞,從而增大OF01菌株與OFL之間的接觸面積.細菌代謝需要酶來催化完成,細菌體內(nèi)的酶活性在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而增加,而各種酶只有在最適宜的溫度范圍內(nèi)活性才最強,酶促反應(yīng)速度才最大,溫度過高或過低都會影響酶的活性.因此最佳溫度為30 ℃.

2.2.5 溶液pH對OF01去除性能的影響

OF01菌株在不同溶液pH條件下對OFL的去除效率如圖 7所示.由圖7可知,pH對OF01的去除效果差異性顯著(P<0.05),當pH小于6大于8時,去除性能受到明顯抑制,pH范圍在6～8之間可有效去除OFL,pH為7時去除效率最大為63.17%,OF01菌株可耐受弱酸性和弱堿性條件,在中性條件下的去除性能最強.OFL是兩性化合物,分子結(jié)構(gòu)中存在羧基與哌嗪基[20],極性極強(酸性與堿性),此表現(xiàn)對OFL生物降解的有效性起著決定作用,即除去兩性基團的位置.pH過大過小都會影響細菌細胞膜所帶電荷的狀態(tài),改變細胞膜的通透性,干擾細菌吸收營養(yǎng)物質(zhì)和排泄代謝產(chǎn)物,還會影響OFL的解離,阻礙細菌吸收利用OFL.因此最佳pH為7.

2.2.6 不同碳源對OF01去除性能的影響

OF01菌株在不同碳源條件下對OFL的去除效率如圖 8所示.由圖8可知,各處理間差異性顯著(P<0.05),不投加碳源時,OFL作為唯一碳源,去除效率最低;分別投加蔗糖、葡萄糖時,去除效率比較低;分別投加碳酸鈉、乙酸鈉時,去除效率比較高.說明額外投加碳源,形成碳源-OFL共碳源降解機制時,能顯著提高OFL的去除性能,額外的碳源還可以誘導(dǎo)一些非特異性酶參與共代謝[21].Reis等[22]發(fā)現(xiàn)添加琥珀酸鹽作為共代謝碳源能夠顯著提高降解菌 Achromobacter denitrificans PR1對磺胺甲惡唑的去除效率,Liao等[23]發(fā)現(xiàn),從自來水生物過濾器中富集的微生物菌群,能夠以環(huán)丙沙星為碳源進行生物降解,并且添加碳源可以促進環(huán)丙沙星的降解.因此,最佳外加碳源應(yīng)是乙酸鈉.

2.2.7 鹽濃度對OF01去除性能的影響

OF01菌株在不同鹽濃度條件下對OFL的去除效率如圖9所示.由圖9可知,當鹽濃度為5 g/L時菌株對OFL的去除效率最大,0 g/L次之且無顯著性差異(P>0.05),其它鹽濃度去除效率差異性顯著(P<0.05).OF01菌株鹽度耐受范圍廣,在0～20 g/L均能較好地生長降解,是因為OF01菌株能夠在鹽濃度環(huán)境中積累鹽離子和相容性溶質(zhì),通過分泌相容性溶質(zhì)實現(xiàn)菌體、EPS和環(huán)境之間的滲透壓平衡,以適應(yīng)相應(yīng)鹽度環(huán)境,但在0～20 g/L范圍內(nèi),隨著鹽濃度升高,細菌的新陳代謝能力逐漸降低,導(dǎo)致去除效率在此范圍內(nèi)逐漸降低;鹽濃度在高于20 g/L時OF01菌株的去除性能受到明顯抑制,酶的活性受到影響,新陳代謝逐步變得遲緩.因此最佳鹽濃度為5 g/L.

2.2.8 正交試驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇影響去除效率最突出的初始OFL濃度、溫度與溶液pH作為研究的三個因素.三因素三水平的正交試驗設(shè)計如表 2所示,正交試驗結(jié)果極差分析如表 3所示.由表 3可知,當初始氧氟沙星濃度為15 mg/L,溫度為30 ℃,pH為7時,去除效率可以達到最大值,因此上述組合是去除效果最佳的組合.根據(jù)極差分析結(jié)果,可知三因素對OF01菌株去除性能影響的主次順序為pH>溫度>初始氧氟沙星濃度.

表2 正交試驗設(shè)計方案

表3 正交試驗極差分析結(jié)果

2.2.9 降解菌OF01的優(yōu)勢對比

Cvancarova M等[24]發(fā)現(xiàn)Panus tigrinus、Dichomitus squalens和Pleurotus ostreatus三種真菌對OFL的去除率為28%、44%和36%.Shu等[25]從制藥廠活性污泥中分離出一株可降解OFL的Tepidiphilus sp.M4 降解菌,在添加電子受體的條件下達到53.1%的OFL去除率.相比于以上幾種降解菌,OF01對OFL的去除效果有著顯著的優(yōu)勢,具有更好的應(yīng)用前景.

2.3 菌株OF01對OFL的降解機制

通過HPLC-MS可檢測出三種主要降解產(chǎn)物,檢測結(jié)果如表4所示.由此推測降解過程是OFL哌嗪環(huán)斷裂,脫去-C2H2-,生成產(chǎn)物1,產(chǎn)物1哌嗪環(huán)上的甲基被羥基取代生成產(chǎn)物2,產(chǎn)物2的側(cè)鏈斷裂脫去烷基,最終生成產(chǎn)物3.降解機制為哌嗪環(huán)的裂解與轉(zhuǎn)化,未涉及喹諾酮主環(huán).降解途徑如圖10所示.

表4 OFL主要降解產(chǎn)物

圖1 OF01在LB平板上的菌落照片

圖2 OF01的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 OF01菌株去除OFL的生長降解曲線

圖4 細菌接種量對去除OFL的影響

圖5 初始濃度對去除OFL的影響

圖6 溫度對去除OFL的影響

圖7 pH對去除OFL的影響

圖8 碳源對去除OFL的影響

圖9 鹽濃度對去除OFL的影響

圖10 OFL的降解途徑

3 結(jié)論

(1)從城市污水廠剩余污泥池的活性污泥中篩選出一株能有效去除氧氟沙星的菌株,命名為OF01,鑒定為Alcaligenes(產(chǎn)堿桿菌屬).OF01菌株在接種2 d后進入對數(shù)生長期,3～6 d生長速率最快,去除OFL能力強,第7 d進入穩(wěn)定期,第10 d達最大生物量,OFL去除率達到最大.

(2)OF01菌株去除OFL的最佳條件是:細菌接種量為10%(v/v)、初始OFL濃度為15 mg/L、溫度為30 ℃、pH為7、投加乙酸鈉為碳源、鹽濃度為5 g/L,其去除率達到最大65.16%.

(3)OF01降解OFL過程生成三種降解產(chǎn)物,主要降解過程為哌嗪環(huán)裂解氧化,羥基取代甲基,并持續(xù)被氧化直到哌嗪環(huán)被完全去除.