基于 HPLC 指紋圖譜和化學模式識別的黃芩湯制備過程質(zhì)量評價研究

袁星，陳卓平，何沁蔓，鄭夏杰，鄭勇鳳

中藥復(fù)方制劑是以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)，按照“君臣佐使”的組方原則，由兩味及以上藥組成，根據(jù)臨床用藥需求，匹配適宜的制備及成型工藝制作而成的一類制劑。中藥復(fù)方不僅一定程度體現(xiàn)了中醫(yī)辨證施治的思想，代表了傳統(tǒng)中醫(yī)藥學的精華，還融合了現(xiàn)代生產(chǎn)技術(shù)，已成為中藥現(xiàn)代化發(fā)展中不可或缺的一部分。但因藥味繁多、成分復(fù)雜、有效成分種類和含量不夠清晰，對中藥復(fù)方的質(zhì)量控制和評價研究隨應(yīng)用的日益廣泛而愈發(fā)重要。目前中藥復(fù)方的質(zhì)量評價存在標準不科學、溯源性差等技術(shù)瓶頸[]，且制劑過程是影響復(fù)方質(zhì)量評價的重要環(huán)節(jié)。如何做到“遵古而不泥古”，即既要以古代醫(yī)籍文獻的記載為基礎(chǔ)，同時還需考慮現(xiàn)代制劑的科學性和合理性，實現(xiàn)古法制備與現(xiàn)代工藝之間的轉(zhuǎn)化，是中藥復(fù)方質(zhì)量研究的關(guān)鍵[]。指紋圖譜的發(fā)展、“一測多評”方法的應(yīng)用、中藥質(zhì)量標志物的提出，建立以關(guān)鍵質(zhì)量屬性辨識為核心的過程質(zhì)量控制體系，為中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量評價帶來了新思路。

黃芩湯，始載于張仲景《傷寒論》，由黃芩、芍藥、甘草、大棗4味藥組成，仲景原文記載以“黃芩三兩、甘草(炙)二兩、 芍藥二兩、大棗十二枚，水一斗(今2000毫升)，煮取三升(今600毫升)，去滓”制得，具有清熱止痢、和中止痛之功效[]，是治療熱性痢疾的祖方?，F(xiàn)臨床廣泛用于潰瘍性結(jié)腸炎[]、胃癌[]、肝癌[1]、結(jié)腸癌[]等消化系統(tǒng)疾病的治療，組方精簡，效專力宏，具備較好的開發(fā)前景。目前，關(guān)于黃芩湯的研究多集中于藥效學機制研究和臨床療效觀察，其制備過程的質(zhì)量控制研究報道較少。故本文在古籍溯源和遵古宜今的思路下，建立3組各12批不同制備方法、不同產(chǎn)地批次黃芩湯樣品的指紋圖譜，結(jié)合化學模式識別探討煎煮次數(shù)和冷凍干燥對黃芩湯質(zhì)量的影響，并挖掘影響其質(zhì)量的標志性差異物質(zhì)，為其制備過程質(zhì)量控制的指標選擇和二次開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

LC-16島津高效液相系統(tǒng)（賽默飛世爾科技有限公司）；DL-720D數(shù)控超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；SCIENTZ-10N冷凍干燥機（寧波新芝生物科技有限公司）；UPK-I-10T優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；SHB-IIIA循環(huán)水式真空泵（北京中興偉業(yè)有限公司）；DD5臺式大容量低速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

1.2 試藥

對照品黃芩苷（批號wkq21030302，質(zhì)量分數(shù)≥98%），黃芩素（批號wkq21030203，質(zhì)量分數(shù)≥98%），芍藥苷（批號wkq21041203，質(zhì)量分數(shù)≥98%），甘草苷（批號wkq21021901，質(zhì)量分數(shù)≥98%），甘草酸（批號wkq21012606，質(zhì)量分數(shù)≥98%）；乙腈、磷酸為色譜純，購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

試驗藥材購自康美藥業(yè)有限股份公司，4種藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學中藥鑒定方向劉曉芬老師鑒定，黃芩為唇形科黃芩屬黃芩Scutellaria baicalensis Georgi.的干燥根經(jīng)凈制和切制而成，白芍為毛茛科芍藥屬芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根經(jīng)凈制和切制而成，甘草為豆科甘草屬甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖經(jīng)凈制、切制和蜜炙而成，大棗為鼠李科棗屬棗Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果實經(jīng)凈制而成。經(jīng)4因素3水平的正交試驗設(shè)計，得到12批藥材混合投料情況如表1所示。黃芩經(jīng)凈制和切制而成黃芩片，白芍經(jīng)凈制和切制而成白芍片，甘草經(jīng)凈制、切制和蜜炙而成甘草片，大棗經(jīng)凈制而成大棗飲片，用于煎煮。

表1 黃芩湯藥材混合投料批次表Table 1 Batch table of Huangqin Decoction pieces

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液的配制 參考《傷寒論》原文記載及近現(xiàn)代度量衡換算（黃芩：芍藥：甘草：大棗=3∶2∶2∶2），稱取飲片黃芩30 g、芍藥20 g、甘草20 g、大棗20 g、加8倍量水浸泡30 min。查閱文獻[7-10]，按下述操作制備3組各12批黃芩湯供試品溶液。

A組（一次煎煮組）：沸騰后武火煎煮25min，轉(zhuǎn)文火煎煮35min，濾過后取濾液4 mL以超純水稀釋到10mL（生藥含量0.2 g/mL），4000 r/min離心20 min，按表1飲片產(chǎn)地批號組合制得A1～A12，共12批次樣品。

B組（二次煎煮組）：沸騰后武火煎煮25 min，轉(zhuǎn)文火煎煮35 min，濾過，濾液備用。重復(fù)上述煎煮操作，取二煎濾液液4 mL與一煎濾液4 mL混合，加超純水稀釋定容至10 mL（生藥含量0.2 g/mL），4000 r/min離心20 min，按表1飲片產(chǎn)地批號組合制得B1～B12，共12批次樣品。

C組（冷凍干燥組）：取B組試液5 mL于10 mL西林瓶中預(yù)凍48 h，于冷凍干燥機中凍干48 h。凍干粉加超純水溶解并定容至5 mL（生藥含量0.2 g/mL）。上清液0.22 μm微孔濾膜濾過，與B1～B12對應(yīng)制得C1～C12，共12批次樣品。

2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取黃芩苷、黃芩素、芍藥苷、甘草苷、甘草酸對照品，于5個容量瓶中，加甲醇配制成質(zhì)量濃度依次為2.013、0.608、0.448、0.413、0.429 mg/mL的對照品儲備液。

2.1.3 混合對照品溶液的配制 取2.1.2項下5種對照品儲備液適量，加入10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得含黃芩苷、黃芩素、芍藥苷、甘草苷、甘草酸質(zhì)量濃度依次為0.4026、0.1520、0.0896、0.0826、0.0858mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

色譜柱為Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～13 min，6%～17%乙腈；13～15 min，17%～20%乙腈；15～50 min，20%～30%乙腈；50～60 min，30%～38%乙腈；60～70 min，38%～45%乙腈；70～80 min，45%～70%乙腈；體積流量為1.0 m L/min；柱溫為35 ℃；進樣量為20 μL；檢測波長276 nm。

取“2.1.1”項下供試品溶液、“2.1.3”項下混合對照品溶液及溶劑各適量，分別按“2.2”項下色譜條件進樣20 uL測定，記錄色譜圖。5個成分的色譜峰分離度均較好，空白溶液無干擾，理論塔板數(shù)大于3000，系統(tǒng)適應(yīng)性良好，結(jié)果見圖1。

圖1 a：空白溶劑對照 b：混合對照品 c:樣品1：芍藥苷 2：甘草苷 3：黃芩苷 4：黃芩素 5：甘草酸Fig 1 A: Blank solvent control B: Mixed reference C: sample1: paeoniflorin 2: licorice 3: baicalin 4: baicalein 5: glycyrrhizic acid

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度實驗 取第1批次藥材組合制得的同一供試品溶液按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣，測定6次。記錄峰面積和保留時間，6次連續(xù)實驗測得各峰保留時間及峰面積的RSD均小于1.00%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性實驗 取第1批次藥材組合制得的同一供試品溶液按“2.2”項下色譜條件分別在0、2、4、8、16、24 h進樣，測得各時間點各峰保留時間及峰面積的RSD均小于2.00%，表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性實驗 取第1批次藥材組合制得的供試品溶液6份，按“2.2”項下色譜條件進樣，6份平行制備樣品測得各峰保留時間及峰面積的RSD均小于2.00%，表明該方法具有可重復(fù)性。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度計算

按“2.1.1”項下方法制備3組各12批次共36個樣品的供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件于高效液相色譜系統(tǒng)中進樣檢測，生成色譜圖分組導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件。A、B、C各組樣品指紋圖譜信息如圖2。采用中位數(shù)法，時間窗設(shè)置為 0.1 min，經(jīng)多點校正和Mark峰匹配生成對照圖譜，共標定13個共有峰。通過與混合對照品色譜比對，指認5個特征峰，分別為4號峰（芍藥苷）、5號峰（甘草苷）、8號峰（黃芩苷）、12號峰（黃芩素）、13號峰（甘草酸）。以出峰穩(wěn)定分離度較好的黃芩苷峰為參照，計算各共有峰峰面積平均RSD值介于8.79～19.78（表2）。以生成的對照圖譜為比照，計算各圖譜相似度介于0.881～0.997（表3），各共有峰平均RSD值，不同產(chǎn)地批次黃芩湯樣品之間質(zhì)量存在差異但不顯著。計算各組共有峰總面積，B組與C組面積相近，且均大于A組。B組與A組質(zhì)量差異較大，而與C組差異較小，說明冷凍干燥過程較好地保留了主要物質(zhì)群（表4）。

圖2 a：一次煎煮組 b：二次煎煮組 c：冷凍干燥組Fig 2. A: one-time decocting group B: Two-time decocting group C:Freeze-drying group

表2 黃芩湯3組樣品共有峰平均峰面積RSD值Table 2 Average peak area RSD values of common peaks of the three groups of samples in Huangqin Decoction

表3 黃芩湯3組樣品指紋圖譜相似度計算結(jié)果Table 3 Fingerprint similarity calculation results of three groups of samples of Huangqin Decoction

表4 黃芩湯3組樣品共有峰面積總和Table 4 Total peak areas of three groups of samples of Huangqin Decoction

2.5 化學模式識別研究

2.5.1 系統(tǒng)聚類分析（HCA） 將黃芩湯樣品共有峰面積量化處理后，生成36×13的階數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SPSS 24.0軟件，采用組間連接方法，以平方歐氏距離為測量區(qū)間，Z得分作為標準化轉(zhuǎn)換值，對A、B、C 3組36個樣品進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果以譜系圖表示（圖3）[]。當平方歐氏距離為25時，36批黃芩湯樣品可分為2類，A1～A12為一類，B1～B12、C1～C12為一類，說明煎煮次數(shù)對質(zhì)量的影響大于藥材產(chǎn)地批次的影響。

圖3 系統(tǒng)聚類分析譜系圖Fig 3 Pedigree of systematic cluster analysis

2.5.2 主成分分析（PCA） 將樣品13個共有峰面積階數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SPSS 24.0軟件，檢驗KMO值為0.805，大于0.5，模型可靠，各變量相關(guān)性好?；谔卣髦荡笥?作降維分析，提取3個主成分，輸出碎石圖（圖4）。第一、二、三主成分斜率較大，提取的主成分可最大程度地代表黃芩湯樣品的整體質(zhì)量；以最大方差法旋轉(zhuǎn)相關(guān)矩陣，輸出旋轉(zhuǎn)后矩陣圖及各變量對因子貢獻率圖表（表5、6，圖5）。3個主成分的累積方差貢獻率為81.831%，可以代表指紋圖譜中13個共有峰的大部分信息。主成分1主要反映5、8、9、10號峰的信息，主成分2主要反映1、2、3、4、6、13號峰的信息，主成分3主要反映7、11、12號峰的信息。量化數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，建立PCA模型并繪制主成分PCA得分圖（圖6），分類結(jié)果與主成分分析一致[]。

圖4 公因子碎石圖FIG. 4 Common factor lithotripsy diagram

圖5 旋轉(zhuǎn)后主成分空間圖Fig. 5 Principal component space map after rotation

圖6 PCA得分圖Fig. 6 PCA score

表5 主成分指紋值及方差貢獻率Table 5 Principal component fingerprint value and variance contribution rate

表6 旋轉(zhuǎn)后因子載荷矩陣Table 6 Factor loading matrix after rotation

V70.5640.1830.410 V130.1050.895 V60.2890.8390.146 V10.2960.814 V30.2970.7670.270 V40.4860.6370.443 V20.4820.5720.491 V120.853 V110.1870.3560.778

2.5.3 偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA） 將樣品共有峰面積階數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SPSS 24.0軟件，建立PLS-DA模型[]。累計模型預(yù)測能力參數(shù)Q2=0.564，大于0.5；累計解釋能力參數(shù)R 2 X=0.7 4 2、R2Y=0.669，大于0.5，模型穩(wěn)定可靠。輸出PLS-DA得分圖級載荷圖（圖7、8），36個黃芩湯樣品被分為2類，其中B1～B12和C1～C12為一類，A1～A12為一類，分類結(jié)果與HCA及PCA分析一致。變量重要性投影（VIP）值是篩選差異性成分的重要指標，VIP值越高，成分對組間差異的影響越大。VIP值＞1的共有峰有4個（圖9），其大小相近，依次為10號峰、5號峰（甘草苷）、8號峰（黃芩苷）、9號峰，說明這4種成分可能為引起黃芩湯樣品組間差異及質(zhì)量穩(wěn)定性差異的主要因素，在制備過程中應(yīng)重點關(guān)注。

圖7 PLS-DA得分圖Fig7 PLS-DA score diagram

圖8 PLS-DA載荷圖Fig. 8 PLS-DA loading diagram

圖9 變量重要性投影圖Fig 9. Variable importance projection

2.5.4 綜合得分評價 以提取得的3個主成分為新變量，以綜合得分表達式

綜合得分=58.284/81.831*FAC1_1+13.665/81.831*FAC2_1+9.881/81.831*FAC3_1，

得到36批樣品綜合得分排序表（表7）。B組及C組整體得分高于一次煎煮組[]。提示黃芩湯在制備過程中煎煮2次較為適宜，且冷凍干燥能較好地保留煎液中的有效成分。

表7 樣品綜合得分排序表Table 7 Sample comprehensive score ranking table

C41.21084-1.23108 -0.601780.588 B41.01162-0.62363 -0.338310.589 B120.8975-0.15914 -0.319170.5710 B60.42318-0.167842.429980.5711 C80.723880.7463-0.634110.5612 C90.788920.40054-0.627430.5513 C30.71659-0.342510.426790.514 C20.377350.956670.174840.4515 C70.81093-0.19649 -0.822150.4516 B90.63280.35026-0.52790.4517 B20.145341.159651.096280.4318 B50.80529-0.39115 -0.856220.419 B80.608780.50128-1.062440.3920 B110.241381.68865-1.075390.3221 C110.264841.60843-1.12770.3222 C50.532830.43508-1.129170.3223 B70.54240.19189-0.896190.3124 A1-0.8363-1.092611.6175-0.5825 A10-1.264810.337980.69083-0.7626 A3-0.98609 -0.795230.17148-0.8127 A5-1.362050.90672-0.1336-0.8328 A12-1.184950.08717-0.07972-0.8429 A2-1.711520.792311.84871-0.8630 A4-1.08712 -0.727280.16942-0.8831 A8-1.378460.86587-0.38914-0.8832 A9-1.464490.520960.01699-0.9533 A6-1.19817-0.76130.11026-0.9734 A7-1.387870.29908-0.3999-0.9935 A11-1.485150.68983-0.77584-1.0436

3 討論

課題組前期研究對比了分別以乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%磷酸、乙腈-1.0%磷酸作為流動相的實驗結(jié)果，顯示乙腈-0.1%磷酸的分離效果和峰形最佳；比較了不同柱溫（30 ℃、35 ℃、40 ℃）對結(jié)果的影響，最終選定柱溫為35 ℃；考察了不同波長（254 nm、260 nm、270 nm、276 nm、280 nm），結(jié)果顯示檢測波長為276 nm時，出峰數(shù)量多，峰面積大且峰形較好；并對分段梯度進行了優(yōu)化以改善各成分的分離度。

煎煮次數(shù)是影響中藥湯劑質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。文獻資料整理可知秦漢時期湯劑均為煎煮1次，至晉代《肘后備急方》始載二煎。黃芩湯出處《傷寒論》載湯劑102首，所有湯劑煎煮次數(shù)均為1次[]。而現(xiàn)代湯劑煎煮工藝中除具備特殊理化性質(zhì)的藥材外，則多為煎煮2次[]?！夺t(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[2]及《方劑學》教材[]中建議每劑藥煎煮2次，將頭煎、二煎兌合服用。相關(guān)文獻報道，一煎煎出率約為30%，二煎40-50%，兩次合并約為70-80%[]。為了探討二煎之法是否有違古人之意，能否提高有效成分在黃芩湯煎液中的溶出率，本研究對黃芩湯就一次煎煮及二次煎煮進行了比較，初步證實了二次煎煮的合理性及冷凍干燥法對二煎合并液成分的保留效果。誠然，在制備過程中影響復(fù)方質(zhì)量的因素還有很多，如飲片炮制方法、煎煮時間等具體參數(shù)的優(yōu)化、單煎與合煎的合理性比較、過濾與濃縮的方法選擇等，后期將設(shè)置試驗一一進行探討。

指紋紋圖譜相似性分析及峰面積RSD值計算顯示產(chǎn)地對黃芩湯質(zhì)量有一定影響，為今后黃芩湯制備的藥材選擇提供參考；聚類分析清晰將樣品劃為2類，冷凍干燥組及二次煎煮組同為一類，一次煎煮組單獨為一類，故煎煮次數(shù)對黃芩湯的質(zhì)量影響較產(chǎn)地更為直接；冷凍干燥組與二次煎煮組指紋圖譜較高的相似度提示冷凍干燥對黃芩湯化學物質(zhì)群的影響較小，故對貯藏時間有要求的前提下可優(yōu)先選擇冷凍干燥制備黃芩湯凍干粉備用。后續(xù)將進一步對比從飲片到煎液到凍干粉各成分的保留與損失。

PLS-DA是找出導(dǎo)致藥材及復(fù)方質(zhì)量差異因素的常用方法。本研究通過變量投影重要值篩選的4個差異標志物（5號峰、8號峰、9號峰、10號峰）因其特殊理化性質(zhì)引起樣品的批間差異，是影響黃芩湯質(zhì)量穩(wěn)定性的關(guān)鍵性成分，可作為黃芩湯制備過程質(zhì)量評價的指標。其中，8號峰（黃芩苷）是方中君藥黃芩抗炎、止瀉、抑菌等藥理作用的主要成分[]，5號峰（甘草苷）則是甘草抗炎、保肝、調(diào)和諸藥等藥理作用的主要成分[]。根據(jù)中藥質(zhì)量標志物的基本條件“5要素”[]（特有性、可測性、有效性、傳遞性、中醫(yī)藥理論關(guān)聯(lián)性），初步可確定為黃芩湯的質(zhì)量差異標志物，將結(jié)合血清藥物化學、網(wǎng)絡(luò)藥理學等技術(shù)予以驗證。因?qū)嶒炛芷谙拗?，未能明確9號峰及10號峰的化學成分信息。根據(jù)文獻查閱及物質(zhì)極性大小推測，可能為去甲漢黃芩素（9號峰）、千層紙素A-苷（10號峰）[]，后續(xù)將采取UPLC-Q/TOFMS/MS等技術(shù)進一步辨識其質(zhì)控關(guān)鍵成分。

近年來，我國頒布了《中華人民共和國中醫(yī)藥法》，形成了《古代經(jīng)典名方目錄》（第一批）《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息考證》《中藥注冊分類及申報資料要求》等代表性政策法規(guī)文件，進一步規(guī)范經(jīng)典名方的研究。然而經(jīng)典名方研發(fā)中制劑過程的質(zhì)量控制等關(guān)鍵環(huán)節(jié)仍面臨許多挑戰(zhàn)。黃芩湯作為組方精煉、療效明確、有一定現(xiàn)代研究基礎(chǔ)的中藥復(fù)方，具備經(jīng)典名方再開發(fā)的潛力。然而其系統(tǒng)深入的研究較少、低水平重復(fù)的研究較多是黃芩湯制劑過程研究中存在的普遍現(xiàn)象。以質(zhì)量控制為核心，以全過程質(zhì)量控制為導(dǎo)向，以“精細制造”為宗旨，開展芍藥基原考證和甘草飲片炮制研究，明確活性成分、關(guān)鍵質(zhì)量屬性和關(guān)鍵工藝參數(shù)，積極開展功效成分群相關(guān)研究，加強制劑安全性研究，以保證成藥質(zhì)量的均一、穩(wěn)定、可控。

綜上所述，本課題建立了黃芩湯的指紋圖譜，結(jié)合化學模式識別研究與多成分含量測定對黃芩湯制備過程的質(zhì)量控制與評價進行了初步探討。課題組后期將對制備工藝的參數(shù)進行更具體的優(yōu)化，完善本草考證、飲片炮制與量值傳遞研究，并結(jié)合血清藥物化學、轉(zhuǎn)錄組學與代謝組學等進一步分析黃芩湯的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。