白首烏對(duì)干燥綜合征模型小鼠影響的實(shí)驗(yàn)研究

張霞，雷紫琴，秦甜甜，祁琥，曾南

白首烏為蘿藦科(Asclepiadaceae)鵝絨藤屬(CynanchumLinn. )植物，是耳葉牛皮消(Cynanchum auriculatumRoyle ex Wight.)、隔山牛皮消(Cynanchumwilfordii Hemsl.)和戟葉牛皮消(Cynanchum bungeiDecne.)的塊根[1]。該藥材具有補(bǔ)肝腎、益精血、強(qiáng)筋骨、健脾消食、解毒療瘡功效[2]，用于肝腎陰虛所致頭昏眼花、腰膝酸軟、須白、體虛多夢(mèng)、失眠健忘、皮膚瘙癢等多種疾病[3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)白首烏化學(xué)成分豐富，其中最重要的有C21甾體苷類、多糖類、苯酮類等活性成分，與白首烏的多種藥理活性密切相關(guān)[4]。

干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome, SS)是外分泌腺的一種慢性自身免疫性疾病，以唾液腺和淚腺的高度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為特征[5,6]。臨床常見眼睛干燥、口腔干燥，且常引起與外分泌腺相連的其他表皮干燥，嚴(yán)重時(shí)可引起臟器功能受損[7]。SS近年來發(fā)病率持續(xù)升高，因發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床治療多依賴于糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等全身免疫調(diào)節(jié)藥物治療，但治療療效只限定于活動(dòng)期的系統(tǒng)受累的干燥綜合征患者，且用藥引起的副作用令人擔(dān)憂[8]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在緩解干燥綜合征患者口眼干燥及其他臨床癥狀時(shí)，與西藥治療相比，被發(fā)現(xiàn)其作用范圍較廣，且臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明中藥對(duì)SS患者口、眼干燥的臨床癥狀和SS小鼠的唾液分泌量、頜下腺損傷指數(shù)以及局部免疫炎癥微環(huán)境有明顯的改善作用，尤其是輕型干燥綜合征患者，可采用單純中藥治療[9,10]。本實(shí)驗(yàn)基于前期研究基礎(chǔ)[11]，采用同種小鼠自身抗原誘導(dǎo)造模的方法建立SS小鼠模型，觀察白首烏對(duì)SS小鼠頜下腺功能障礙的影響及其影響CHRM3的作用機(jī)制，為白首烏用于SS的治療及今后的深入研究提供初步的藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

白首烏飲片（Cynanchum auriculatumRoyle ex Wight.，批號(hào)：20200715）由瀘州品創(chuàng)科技有限公司提供，并由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院嚴(yán)鑄云教授鑒定。硫酸羥氯喹（批號(hào)：210360，上海上藥中西制藥有限公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性C57BL/6小鼠（6周齡，20±2 g）購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（北京）2019-0010。動(dòng)物在成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物觀察室飼養(yǎng)，許可證號(hào)SYXK（四川）2020-124。給藥前適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，恒溫25±1℃、相對(duì)濕度40%～60%、12 h光暗交替，自由進(jìn)食、飲水。所有動(dòng)物研究均按照成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的指南（編號(hào)20200320）進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（Cat: RE-03014成都福際生物技術(shù)有限公司），F(xiàn)astKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑（Cat: KR118-02，天根生化科技（北京）有限公司），SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版（Cat: FP205-02，天根生化科技（北京）有限公司），RIPA裂解液（Cat: P00138，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Cat: P0012，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），CHRM3（Cat: bs-1289R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），β-actin Rabbit mAb（Cat:AF7018，Affinity Antibody公司），HRP-羊抗兔IgG（Cat: BM3894，武漢博士德生物工程有限公司），UltraSignal 超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物（Cat: 4AW011-100，北京四正柏生物科技有限公司），抗SSA抗體ELISA試劑盒(Cat: JM-12306M1, 江蘇晶美生物科技有限公司) ，抗SSB抗體ELISA試劑盒(Cat: JM-12312M1, 江蘇晶美生物科技有限公司)。

1.4 儀器與設(shè)備

Nanodrop 2000分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司），3001型高級(jí)多功能酶標(biāo)儀、ST16R 低溫高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，KZ-II 高效組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司），Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.5 方法

1.5.1 白首烏醇提物的制備 白首烏飲片與75%乙醇以料液比1:10的比例采用加熱回流法回流提取2 h，減壓抽濾后殘?jiān)孟嗤姆椒ㄔ偬崛?次，合并3次提取液，真空濃縮，收集，冷凍干燥后備用。

1.5.2 小鼠干燥綜合征（SS）模型的建立 抗原制備：低溫條件下，無菌取出同種小鼠兩側(cè)頜下腺，剔除包膜、結(jié)締組織及淋巴結(jié)等附著物，剪碎，按20 mg腺體組織加入0.2 mL生理鹽水的比例制備頜下腺組織勻漿，4℃低溫離心機(jī)中以3000 r·min-1速度離心15 min，將上層脂質(zhì)吸除，余下上清液作為抗原備用。BCA法測(cè)定蛋白含量，PBS緩沖液將上述制備抗原稀釋到蛋白濃度為5.0 mg·mL-1，加入同體積弗氏完全佐劑，調(diào)配成蛋白濃度為2.5 mg·mL-1的注射用抗原。

采用制備好的抗原隨機(jī)在小鼠背部多點(diǎn)注射，每只小鼠注射總量為0.1 mL，并在初次免疫后的第3、7天分別用相同劑量和濃度的免疫原足墊以及背部皮下多點(diǎn)注射以加強(qiáng)免疫；第14、21天，用不完全弗氏佐劑將頜下腺抗原調(diào)整蛋白濃度為2.5 mg·mL-1，以同樣方式注射小鼠。正常組小鼠背部隨機(jī)多點(diǎn)注射等體積生理鹽水。

1.5.3 分組及給藥 72只SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠按體重分層隨機(jī)分成6組，每組12只，即空白組，模型組，白首烏醇提物低、中、高劑量組（0.4、0.8、1.6 g·kg-1）[12]和羥氯喹組（0.03 g·kg-1）。首次免疫當(dāng)天小鼠開始給藥，空白組和模型組給予等量生理鹽水。造模周期為60天。

1.5.4 唾液分泌量與飲水量測(cè)定 小鼠飼養(yǎng)過程中每隔3天稱量小鼠體重并按體重的變化重新計(jì)算灌胃劑量，每天定時(shí)稱重每籠小鼠剩余水量。并分別在第0天（造模前）、第30天、第60天測(cè)量各組小鼠唾液分泌量，檢測(cè)方法：將已稱量過初始重量的干棉球放入小鼠的頰部采集唾液，3分鐘后取出放置分析天平上稱重，即小鼠唾液分泌量(mg)=棉球濕重(mg)-棉球干重(mg)。

1.5.5 自身抗體測(cè)定 取各組小鼠血液樣品于室溫靜置2 h，以3500 rpm離心15 min，分離血清于一次性EP管中，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。ELISA法檢測(cè)血清中抗SSA和抗SSB抗體水平。

1.5.6 免疫組化、 Western Blot檢測(cè)頜下腺CHRM3的表達(dá)量 無菌條件下剖取頜下腺，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片；脫蠟，浸洗，抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷，血清封閉；兔抗CHRM3按1:200稀釋，然后4℃孵育過夜；酶標(biāo)二抗37℃孵育30 min；加DAB顯色液，復(fù)染細(xì)胞核，脫水，封片；顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

將各組小鼠頜下腺組織樣品切碎，用含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的裂解液勻漿，然后用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。調(diào)節(jié)各樣本總蛋白至等濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，一抗（1:5000）孵育過夜，二抗（1:5000）中孵育反應(yīng)1.5 h，β-actin作為內(nèi)參。最后，使用ChemiDocTM成像系統(tǒng)顯影。

1.5.7 RT-PCR測(cè)定CHRM3 mRNA表達(dá)水平 根據(jù)說明書要求，收集小鼠頜下腺組織并使用動(dòng)物總RNA分離試劑盒提取總RNA。然后，檢測(cè)總RNA濃度和純度，并使用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，引物序列見表1，2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5.8 統(tǒng)計(jì)分析 原始記錄由紙質(zhì)書寫和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)同時(shí)記錄。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，以±s表示，計(jì)量數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布的采用單因素方差分析（one-way ANOVA）或t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)者則采用非參數(shù)檢驗(yàn)法分析，各組所得數(shù)據(jù)均與模型組比較，P＜0.05為兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 白首烏醇提物對(duì)SS模型小鼠飲水量和唾液分泌量的影響

造模之后，小鼠的日均飲水量和唾液分泌量均發(fā)生明顯變化。如圖1所示，與模型組比較，白首烏醇提物各劑量組和羥氯喹組小鼠日均飲水量明顯降低。如圖2所示，分別在第0天（造模前）、第30天、第60天測(cè)量各組小鼠唾液分泌量，從的結(jié)果來看，各給藥組小鼠唾液分泌量在第30、60天均顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

圖1 白首烏對(duì)SS模型小鼠日均飲水量的影響

圖2 白首烏對(duì)SS模型小鼠唾液分泌量的影響

2.2 白首烏醇提物對(duì)SS模型小鼠自身抗體水平的影響

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組小鼠血清中抗SSA和抗SSB抗體水平均顯著升高（P＜0.001），提示造模成功。與模型組比較，白首烏醇提物各劑量組和羥氯喹組小鼠血清中抗SSA與抗SSB抗體水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），提示藥物對(duì)模型具有對(duì)抗作用。見表2、圖3。

圖3 白首烏對(duì)SS模型小鼠血清中抗SSA和抗SSB抗體水平的影響

表2 白首烏對(duì)SS模型小鼠血清中抗SSA和抗SSB抗體水平的影響(±s)

表2 白首烏對(duì)SS模型小鼠血清中抗SSA和抗SSB抗體水平的影響(±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

抗SSB抗體（ng·mL-1）空白組——283.75±20.93*** 144.24±8.59***模型組——370.89±16.29193.14±19.41白首烏醇提物0.4339.83±9.92*163.43±6.86**白首烏醇提物0.8294.72±12.44*** 149.12±8.82***白首烏醇提物1.6270.47±3.50*** 143.72±7.89***羥氯喹組0.03277.87±25.76*** 154.72±11.96**組別劑量（g·kg-1）抗SSA抗體（ng·mL-1）

2.3 白首烏醇提物對(duì)SS模型小鼠頜下腺CHRM3表達(dá)的影響

I H C 結(jié)果顯示，模型組小鼠頜下腺組織中CHRM3陽性表達(dá)較空白組顯著減弱（P＜0.05），而白首烏醇提物各劑量組和羥氯喹組小鼠頜下腺組織中CHRM3陽性表達(dá)較模型組顯著增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），見圖4。

圖4 白首烏對(duì)SS模型小鼠頜下腺組織CHRM3陽性表達(dá)的影響（IHC法）

如圖5所示，模型組小鼠頜下腺組織中CHRM3蛋白表達(dá)量較空白組顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，白首烏醇提物高劑量組和羥氯喹組小鼠頜下腺組織中CHRM3蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.001，P＜0.05）。

圖5 白首烏對(duì)SS模型小鼠頜下腺組織中CHRM3蛋白表達(dá)量的影響（WB法）

2.4 白首烏醇提物對(duì)SS模型小鼠頜下腺CHRM3 mRNA表達(dá)的影響

PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠頜下腺組織中CHRM3 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，白首烏醇提物高劑量組小鼠頜下腺組織中CHRM3 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.001）。見表3、圖6。

表3 白首烏對(duì)SS模型小鼠頜下腺組織CHRM3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響(±s)

注：與模型組比較， ***P＜0.001

組別劑量（g·kg-1）△CT空白組——1.00±0.00***模型組——0.08±0.01白首烏醇提物1.61.20±0.25***羥氯喹組0.030.08±0.03

3 討論

典型的SS臨床表現(xiàn)是以外分泌腺淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的口干眼干，在疾病進(jìn)展期間，患者可能出現(xiàn)其他一些臨床病變，如關(guān)節(jié)炎、疲勞、皮膚血管炎、肺間質(zhì)疾病、周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)病變、腎衰竭、胃腸道疾病等[13]。研究認(rèn)為，抗SSA和抗SSB抗體均是診斷該病的特異性抗體，SS患者體內(nèi)抗SSA抗體、抗SSB抗體的陽性率更高[14,15]。本實(shí)驗(yàn)研究觀察到SS模型小鼠血清中抗SSA抗體、抗SSB抗體水平，與空白組比較均顯著升高，提示模型的成功建立，而白首烏醇提物各劑量組和羥氯喹組小鼠血清中兩種抗體水平較模型組顯著降低，表明藥物能改善模型小鼠免疫功能的異常。此外，飲水量及唾液分泌量是反映唾液腺功能的客觀指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，造模前各組小鼠飲水量和唾液分泌量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，造模后可見模型組小鼠飲水量較空白組顯著增加，唾液分泌量則顯著減少，表明SS模型小鼠唾液腺分泌功能較正常小鼠明顯減弱，進(jìn)一步提示模型的成功建立。亦可發(fā)現(xiàn)，隨著疾病的進(jìn)展SS模型小鼠飲水量逐漸增多，唾液分泌量則逐漸下降，而白首烏醇提物同步給藥防治后能有效控制飲水量的增加，并增強(qiáng)唾液分泌能力，對(duì)唾液腺的功能有一定保護(hù)作用。

在基本明確了白首烏對(duì)SS模型小鼠的改善作用后，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化、RT-PCR、Western Blot法觀察了白首烏醇提物對(duì)SS模型小鼠頜下腺組織毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3（Muscarinic acetylcholine receptor M3，CHRM3）表達(dá)的影響，以期初步揭示其作用機(jī)制。毒蕈堿型乙酰膽堿受體M，是一種單鏈跨膜糖蛋白，在體內(nèi)主要參與肌肉收縮調(diào)節(jié)、呼吸、運(yùn)動(dòng)、體溫調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)、記憶等重要生理功能[16]。CHRM3為該家族成員之一，主要分布在唾液腺和淚腺等外分泌腺，通過副交感神經(jīng)調(diào)節(jié)影響外分泌腺體的分泌功能，即在腺體分泌中起關(guān)鍵作用[17]。研究證實(shí)，CHRM3參與SS的發(fā)病，抗CHRM3抗體的存在與SS患者分泌功能障礙具有直接關(guān)聯(lián)性[18]，SS患者自身產(chǎn)生抗CHRM3抗體，可能誘導(dǎo)CHRM3異位表達(dá)于導(dǎo)管，引起頜下腺受損血流反應(yīng)和唾液輸出量減少[19]，阻斷乙酰膽堿對(duì)M3受體的激活，能干擾乙酰膽堿能神經(jīng)信號(hào)的有效傳遞，損傷頜下腺、減少唾液分泌量；并可激活磷脂酶C信號(hào)傳導(dǎo)通路，增加腺體局部NO水平，破壞涎腺組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致唾液、淚液分泌減少，從而引起口干眼干等SS癥狀[20,21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠頜下腺組織CHRM3 的mRNA、蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，提示SS小鼠頜下腺功能出現(xiàn)障礙，白首烏醇提物能上調(diào)CHRM3 mRNA和蛋白表達(dá)，表明白首烏能通過影響CHRM3的基因與蛋白表達(dá)，發(fā)揮對(duì)SS小鼠頜下腺功能改善的作用。

綜上，本研究結(jié)果表明白首烏醇提物對(duì)SS模型小鼠具有干預(yù)作用，下調(diào)特征性抗體水平，改善唾液腺分泌功能，有效緩解SS癥狀，作用機(jī)制與上調(diào)CHRM3功能有關(guān)。此外，白首烏作為一種提高機(jī)體免疫功能的藥材，而SS的發(fā)病機(jī)制與機(jī)體免疫功能紊亂有關(guān)，因此今后研究中可從影響免疫功能角度開展其干預(yù)SS的作用。