甜菜BES1基因家族鑒定與生物信息學(xué)分析

劉云赫,石 晶,耿 貴,王宇光

(黑龍江大學(xué)現(xiàn)農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院,哈爾濱 150080)

0 引言

油菜素內(nèi)酯(BRs)是一種甾醇類激素在植物體內(nèi)廣泛分布,主要存在于花和未成熟的種子中,在植物一系列生理調(diào)控以及生物和非生物脅迫反應(yīng)中起至關(guān)重要作用[1,2,3]。BES1是介導(dǎo)油菜素內(nèi)酯 (BRs) 反應(yīng)基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[4]。BES1、BZR1及四種BES1/BZR1同源物(BEH1-BEH4)共同組成BES1/BZR1基因家族[5]。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中BES1與其同源蛋白BZR1的序列相似度高達(dá)88%,分別具有抑制和激活轉(zhuǎn)錄的作用[6]。在對BR信號通路成員進(jìn)行鑒定的過程中,人們發(fā)現(xiàn)擬南芥bzr1-1D突變體與BRs缺失突變個體在性狀上一致,經(jīng)染色體分析發(fā)現(xiàn)其中包含4個已被注釋的開放閱讀框,突變發(fā)生在擬南芥第1號染色體的體臂底端,基因序列中一個單堿基對的變化導(dǎo)致翻譯后的氨基酸由脯氨酸變?yōu)榱涟彼?將這個基因命名為BZR1[7]。后續(xù)人們又從其抑制突變體bes1-D中分離得到BZR1的高度同源蛋白并命名為BES1[8]。BES1蛋白由三個結(jié)構(gòu)域組成,包括油菜素內(nèi)酯不敏感磷酸化結(jié)構(gòu)域2(BIN2)、氨基末端結(jié)構(gòu)域和羧基末端結(jié)構(gòu)域[9,10,11],具有識別并結(jié)合DNA的能力,BES1轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄因子來參與植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)[12]。由于測序技術(shù)的不斷發(fā)展,很多物種的全基因組數(shù)據(jù)已經(jīng)被鑒定出來,到目前為止已在擬南芥[5]、高粱[13]、水稻[14]、大豆[15]和白菜[16]等多個植物中鑒定出BES1蛋白,然而對甜菜BES1家族基因的認(rèn)識顯然不足。

甜菜(BetavulgarisL.)二年生草本植物,是制糖的重要原料,可被食用和飼用[17,18]。甜菜制糖的副產(chǎn)物糖蜜還可以用來生產(chǎn)丙酮、甲醇、乙醇、甘油和甜菜堿等化學(xué)物質(zhì)[19]。除此之外,制糖廢料濾泥還可以作為肥料中和土壤中的游離酸等物質(zhì)[20]。提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的兩個主要目標(biāo),在至關(guān)重要的植物甾醇類激素中,BRs參與多種細(xì)胞反應(yīng)通過這些反應(yīng)可以提高作物產(chǎn)量,在甜菜葉叢快速生長期以及糖貯藏期,BRs可以通過提高甜菜葉綠素含量、葉片的凈光合速率和氣孔導(dǎo)度最終提高甜菜產(chǎn)量[21]。盡管已經(jīng)在甜菜中研究了許多種轉(zhuǎn)錄因子,但對甜菜中的BES1家族的研究較少,本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對甜菜BES1基因家族進(jìn)行全面研究,并從基因結(jié)構(gòu)、蛋白理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、序列特征、染色體定位和啟動子順式作用元件等方面進(jìn)行分析,旨在為后續(xù)研究甜菜BES1基因家族生物學(xué)功能和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的潛在應(yīng)用提供借鑒參考,為鑒定和表征其他物種的BES1基因提供了基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 BvBES1基因家族的鑒定

從NCBI 網(wǎng)站(https://ncbi.nlm.nih.gov/)和Pfam網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/)中獲取甜菜的蛋白組數(shù)據(jù)和BES1結(jié)構(gòu)域的隱馬爾科夫文件(PF05687),利用HMMER軟件篩選出甜菜基因組中潛在的BES1蛋白,將這些篩選結(jié)果提交至SMART在線網(wǎng)站(https://smart.embl.de/)以確認(rèn)保守結(jié)構(gòu)域的具體組成,并進(jìn)一步驗(yàn)證篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性,最后在 NCBI 網(wǎng)站中提取已鑒定的BvBES1蛋白對應(yīng)的基因組序列及CDS序列。

1.2 BvBES1基因家族的分析

1.2.1 蛋白理化性質(zhì)分析

利用在線程序ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對目標(biāo)基因的基本理化特性進(jìn)行分析,對BvBES1蛋白的蛋白長度、分子量及等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。利用Wolf PSORT在線網(wǎng)站(https://wolfpsort.hgc.jp/)來預(yù)測BvBES1蛋白的亞細(xì)胞定位信息,并從NCBI網(wǎng)站中獲取染色體位置信息。

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MEGA5軟件對擬南芥AtBES1、波菜SpBES1、大豆GmBES1、水稻OsBES1及甜菜BvBES1蛋白的序列進(jìn)行多序列比對,基于比較結(jié)果,采用最大簡約法(Maximum-parsimony),并將Bootstrap數(shù)值設(shè)定為1000以此來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,然后使用iTOL在線網(wǎng)站(https://itol.embl.de/)來對系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行美化處理。

1.2.3 基因結(jié)構(gòu)及蛋白Motif分析

將BvBES1基因家族的基因組序列和CDS序列輸送到GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)在線軟件中,以此觀察BvBES1基因的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)。利用MEME在線軟件(http://alternate.meme-suite.org/tools/meme)對BvBES1蛋白的保守基序進(jìn)行深入分析,設(shè)定10個預(yù)測值。接著利用TBtools軟件對保守基序進(jìn)行可視化處理,并據(jù)此生成了相應(yīng)的圖片[22]。

1.2.4 基因家族啟動子分析

提取BvBES1基因CDS序列上游2000bp的序列片段,并將其上傳到PlantCARE在線網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/h-tml/),以獲取上游啟動子功能元件的數(shù)量及種類信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 BvBES1家族基因定位及蛋白理化性質(zhì)

通過比對篩選,共鑒定出7個甜菜BES1基因,根據(jù)這些基因在基因組中的位置對其進(jìn)行排序。分別命名為BvBES1-001-BvBES1-007(表1),其中BvBES1-001定位于甜菜1號染色體;BvBES1-002被定位于甜菜4號染色體;BvBES1-003、BvBES1-004、BvBES1-005三個基因位于甜菜5號染色體上;BvBES1-006和BvBES1-007分別被定位在甜菜6號和8號染色體上(圖1)。蛋白理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果顯示7個蛋白的長度在147.00-703.00 aa之間,BvBES1-003蛋白最短、BvBES1-001蛋白最長,相對分子質(zhì)量范圍為16.25-78.63 kDa、等電點(diǎn)范圍為5.62-9.40。Wolf PSORT網(wǎng)址預(yù)測的蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果表明除BvBES1-003和BvBES1-004蛋白位于細(xì)胞質(zhì)以外,其余5個蛋白均位于細(xì)胞核內(nèi)。

圖1 BvBES1基因染色體定位Fig.1 Chromosomal localization of theBvBES1 gene

表1 BvBES1基因家族基本信息Tab.1 Basic information about the BvBES1 gene family

2.2 BvBES1蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

基于7個甜菜BvBES1蛋白、6個波菜SpBES1蛋白、6個水稻OsBES1蛋白、11個大豆GmBES1蛋白和8個擬南芥AtBES1蛋白共38個蛋白,利用MEGA5軟件構(gòu)建蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。如圖2所示,參照擬南芥AtBES1蛋白家族分類將38個BES1蛋白分為5組,其中A組共7個成員包括2個擬南芥AtBES1蛋白、B組6個成員BvBES1-006蛋白和2個擬南芥AtBES1蛋白歸于這組,C組最大共15個成員包含2個擬南芥AtBES1蛋白和BvBES1-002、BvBES1-007蛋白。D組同樣包含7個成員2個擬南芥AtBES1蛋白和2個甜菜BvBES1-001、BvBES1-005蛋白,最后最小的E組只有3個成員BvBES1-003和BvBES1-004及1個波菜SpBES1蛋白。一個分支中包含多個物種,而同一物種的蛋白分散在不同分支中,說明BES1蛋白具有一定的多樣性,推測BES1蛋白的分化過程發(fā)生在菠菜、水稻、大豆、擬南芥和甜菜的進(jìn)化之前。

圖2 BES1家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic evolutionary tree of BES1 family proteins

2.3 BvBES1基因結(jié)構(gòu)和蛋白Motif分析

由基因結(jié)構(gòu)分析(圖3B)可知,BvBES1家族7個基因結(jié)構(gòu)差異較大,結(jié)合蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果,發(fā)現(xiàn)BvBES1-001和BvBES1-005、BvBES1-002和BvBES1-007進(jìn)化距離較近其基因結(jié)構(gòu)除長度外也基本相同。而進(jìn)化距離相對較遠(yuǎn)的蛋白其基因結(jié)構(gòu)也有著明顯的差異,如BvBES1-003和BvBES1-006。說明BvBES1家族具有一定的特異性。為了解BES1蛋白結(jié)構(gòu)的多樣性,采用MEME分析預(yù)測甜菜BES1家族蛋白的保守基序結(jié)果如圖3B,其中motif1(圖4)在全部7個基因中均存在,表明其具有相似的功能,推測為BvBES1家族的保守序列(圖3C)。

圖3 BvBES1基因家族基因結(jié)構(gòu)圖A 啟動子順式元件分析圖;B BvBES1蛋白保守基序分析圖;CBvBES1基因結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Gene structure of theBvBES1 gene familyA promoter cis-element analysis; B BvBES1 protein conserved motif analysis; C BvBES1 gene structure diagram

圖4 蛋白保守Motif1序列圖Fig.4 Sequence map of the protein conserved Motif1

2.4 BvBES1順式元件分析

使用PlantCARE分析了翻譯起始位點(diǎn)上游約2000bp的序列預(yù)測結(jié)果如圖3A?？偣舶l(fā)現(xiàn)了 66個順式作用元件,其中與激素響應(yīng)相關(guān)的元件數(shù)量最多共25個,其次是脅迫響應(yīng)元件23個,而光響應(yīng)元件最少只有3個,說明BvBES1基因家族參與激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)及光響應(yīng)等生命過程。每個基因不僅擁有不同數(shù)量的順式作用元件,而且在元件的具體類型上也存在的差異。在對BvBES1家族成員啟動子中的激素響應(yīng)元件類型進(jìn)行更深入的分析后共識別出赤霉素、水楊酸、茉莉酸和脫落酸四種不同類型的激素響應(yīng)元件。其中,赤霉素主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)和促進(jìn)植株生長,而其他三種則主要負(fù)責(zé)促進(jìn)植株成熟。

3 討論

BRs作為一種近幾十年來發(fā)現(xiàn)的植物激素,被稱為繼生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯之后的第六種激素,BRs密切參與植物生長和各種應(yīng)激反應(yīng)[23]。BES1轉(zhuǎn)錄因子對BR信號的調(diào)控過程已被證明與植物脅迫響應(yīng)有關(guān),如水分脅迫、熱脅迫、冷脅迫等,BES1還在植物生長和發(fā)育的多個方面起著至關(guān)重要的作用[24]。本研究利用生物信息學(xué)方法共鑒定出7個甜菜BES1基因。為更好地了解不同物種之間的進(jìn)化聯(lián)系將擬南芥、菠菜、水稻和大豆蛋白加入到系統(tǒng)進(jìn)化樹中,38個BES1蛋白共分5組,7個甜菜BES1蛋白分別劃分在B、C、D、E四組中,這與前人研究的結(jié)果一致[25]。結(jié)果顯示BES1蛋白在不同物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較近,而同一物種中的進(jìn)化關(guān)系相對較遠(yuǎn),這表明BES1蛋白本身具有一定的多樣性,該蛋白的分化過程遠(yuǎn)在菠菜、水稻、大豆、擬南芥和甜菜的進(jìn)化之前,BES1基因在擬南芥、波菜、水稻、大豆和甜菜可能具有不同的作用。

通過分析甜菜BES1家族的基因結(jié)構(gòu)、序列特征、染色體定位、啟動子順式作用元件等。發(fā)現(xiàn)甜菜BES1蛋白都包含典型的BES1_N結(jié)構(gòu)域具有高度特異性與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果一致。同時(shí)不同基因擁有不同數(shù)量不同種類的順式作用元件,在多種脅迫及激素反應(yīng)過程中具有潛在的生物學(xué)作用,推斷不同BES1基因在甜菜中具有不同的作用。前人基于全基因組序列,分別在擬南芥、波菜、水稻和大豆中鑒定出8、6、6和11個BES1基因,相較下甜菜BES1基因家族包含的成員要少得多。小麥中共鑒定出23個TaBES1家族成員,研究發(fā)現(xiàn)TaBES1-3B2、TaBES1-3D2和TaBES1-6D可能是干旱脅迫相關(guān)基因。此外,TaBES1-3B2和TaBES1-3D2還可能在低溫誘導(dǎo)的雄性不育信號通路中發(fā)揮作用[26]。在黃瓜基因組中鑒定出6個CsBES1基因家族成員,根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹將其劃分為3個分支,相比較下甜菜BES1家族成員數(shù)量與之相近但分類更為豐富。黃瓜CsBES1基因?qū)に卣T導(dǎo)有反應(yīng)、對大多數(shù)脅迫表現(xiàn)出顯著的響應(yīng)、CsBZR6在各種黃瓜組織中高表達(dá),可能是調(diào)控黃瓜生長發(fā)育的重要基因[27]。BES1在不同葡萄器官中的表達(dá)也存在差異,在鹽脅迫和熱脅迫下,BES1在不同葡萄品種中表達(dá)存在差異,葡萄VvBES1的表達(dá)也隨著鹽脅迫處理時(shí)間的延長而變化[28],在甜菜BES1基因中也發(fā)現(xiàn)了響應(yīng)脅迫的順式作用元件,推測BES1基因在甜菜多種脅迫中也扮演重要的角色。本研究結(jié)果為揭示該家族在甜菜BRs信號通路中的功能和調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為該家族在其他物種中的研究提供了建議。