周麗鳳,蔣霞,張蓉蓉,王麗,梁巧梅

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科(湖南長(zhǎng)沙 410005); 2湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科(湖南長(zhǎng)沙 410005)

口腔上皮作為咀嚼黏膜、黏膜和特化黏膜的一部分,提供了將口腔軟組織與外界環(huán)境隔開的屏障,這一屏障是許多功能和結(jié)構(gòu)蛋白相互作用的結(jié)果,這些相互作用導(dǎo)致能夠?qū)υS多外源性(可能是有毒的)影響作出反應(yīng)[1]。上皮細(xì)胞能夠通過(guò)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子、黏附分子、生長(zhǎng)因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶對(duì)外界刺激做出反應(yīng)[2]。具核梭桿菌(Fn)是一種革蘭陰性專性厭氧細(xì)菌,屬于梭桿菌屬,通常寄生于口腔、泌尿生殖道、土壤、腸道和上消化道,但最常寄生于口腔菌斑中[3]。Fn一直被視為人體正常菌群的組成部分,由于從臨床樣本中連續(xù)分離出細(xì)菌,Fn引起了研究人員的關(guān)注,并被認(rèn)為是一種不容忽視的細(xì)菌[4]。研究顯示Fn是一種機(jī)會(huì)性病原體,具有很強(qiáng)的致病性,在口腔和全身感染中經(jīng)常檢測(cè)到Fn,它與各種人類疾病相關(guān),例如牙周炎、心絞痛、肺膿腫、慢性中耳炎、鼻竇炎、扁桃體周圍膿腫等[5]。不僅參與炎癥過(guò)程,而且還參與癌癥的進(jìn)展,其中包括口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC),結(jié)直腸癌(CRC),食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)和乳腺癌等[6]。對(duì)腫瘤內(nèi)核分枝桿菌與OSCC腫瘤之間的關(guān)系知之甚少。此外,據(jù)報(bào)道,Fn通過(guò)Toll樣受體(TLR)2-4信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)其他癌癥(主要是結(jié)直腸癌),特別是巨噬細(xì)胞和T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Tregs)的局部免疫力[7]。因此,本研究主要探索口腔上皮細(xì)胞具核梭桿菌預(yù)測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究招募了本院2018年12月至2022年4月151例OSCC患者,本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均書面同意參加本研究?；颊叩募{入標(biāo)準(zhǔn)為:所有患者均確認(rèn)了組織學(xué)診斷為OSCC;排除在治療開始前2周內(nèi)接受過(guò)抗生素治療;有急性牙周炎或口腔念珠菌病;在治療開始時(shí)有一個(gè)鼻胃管;以及患有免疫功能低下疾病(如糖尿病,艾滋病毒等)的患者。

1.2 基因組基因和總核糖核酸提取 在手術(shù)后立即將腫瘤樣品冷凍在冷凍管中的液氮中,并在溫度控制下儲(chǔ)存在-80℃。分別使用5～40 mg和10～50 mg的腫瘤片段進(jìn)行RNA提取,在4～5 μm冷凍切片上評(píng)估,并將腫瘤細(xì)胞少于50%的樣品排除在研究之外。根據(jù)以下方案在大解剖的腫瘤區(qū)域進(jìn)行核酸提取,蛋白酶K消化后,根據(jù)供應(yīng)商的建議,使用miRNeasy迷你試劑盒奇亞根提取總RNA。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR分析Fn狀態(tài) 定量值由開始檢測(cè)到熒光信號(hào)隨PCR產(chǎn)物指數(shù)增長(zhǎng)而增加的周期數(shù)(周期閾值,Ct值)獲得。檢測(cè)由ABI Prism 7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng)的激光探測(cè)器執(zhí)行,根據(jù)制造商手冊(cè)使用PE Biosystems分析軟件?；蚪MDNA的精確數(shù)量(基于光密度)及其質(zhì)量(即缺乏廣泛降解)都很難評(píng)估。在JUN含量的基礎(chǔ)上將Fn水平歸一化,用作人類二倍體對(duì)照。結(jié)果以Fn 16S rRNA基因拷貝數(shù)的n倍差異表示,稱為“Nfn”,確定為Nfn=2ΔCtsample,其中樣本的ΔCt值為Fn 16S rRNA基因的平均Ct值減去二倍體對(duì)照基因的平均Ct值。Fn Ct值<32為Fn陽(yáng)性,Fn Ct值>32為Fn陰性。對(duì)于Fn陽(yáng)性腫瘤,將Nfn值歸一化,使Ct值為32=1,即Fn 16S rRNA基因拷貝數(shù)的最小精確量化量。

利用Oligo 6.0計(jì)算機(jī)程序設(shè)計(jì)了Fn 16S rRNA基因DNA序列引物(Upper 5′-AGCGTTTGACATCTTAGGAATGA-3′和Lower 5′-GCCATGCACCACCTGTCTT-3′)和JUN (Upper 5′-CACGGCCAACATGCTCAGG-3′和Lower 5′-GCATGAGTTGGCACCTGT-3′)。Fn引物對(duì)的選擇是相對(duì)于梭桿菌種密切相關(guān)的家族成員16S rRNA基因序列唯一的。使用Power SYBR 綠色預(yù)混液進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR,熱循環(huán)條件是初始變性步驟在95℃下進(jìn)行10 min,后在95℃下循環(huán)50次,持續(xù)15 s,65℃/60℃循環(huán)1 min,分別進(jìn)行JUN/Fn,后進(jìn)行熔融曲線步驟。通過(guò)熔解曲線分析證實(shí)了擴(kuò)增特異性。

1.4 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR的免疫相關(guān)基因表達(dá)分析 RNA在20 μL含1X RT緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl (pH=8.3);75 mg氯化鉀;3 mmol/L MgCl2),10 mmol/L DTT,100單位RNase H活性降低的SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶),0.5 mmol/L每個(gè)dNTP,0.15 μg/μL隨機(jī)引物(Life Technologies),20單位RNasin核糖核酸酶抑制劑(Promeg),1μg總RNA)的最終體積中反轉(zhuǎn)錄,熱循環(huán)條件為隨機(jī)引物在25℃雜交10 min,42℃合成cDNA 30 min,99℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min,4℃冷卻。所有實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)均使用Power SYBR綠色預(yù)混液使用ABI棱鏡7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行。熱循環(huán)條件是在95℃下初始變性步驟10 min,然后在95℃下循環(huán)50次15 s,65℃下1 min,后是熔融曲線步驟。通過(guò)熔解曲線分析證實(shí)了擴(kuò)增特異性。

1.5 免疫組化 使用CD163和LPS抗體進(jìn)行免疫組化分析。最初診斷時(shí)獲得的石蠟包埋組織塊從居里研究所診斷和治療醫(yī)學(xué)系的檔案中檢索。用切片機(jī)從石蠟包埋的OSCCs組織塊中切割3 μm厚度的切片,組織切片通過(guò)二甲苯和乙醇洗滌進(jìn)行脫蠟和復(fù)水:(1)在0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中提取抗原,在高壓鍋中(4 min)。(2)將切片用3%過(guò)氧化氫甲醇浸泡15 min,后用清水和PBS沖洗,阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。(3)與靶向抗原的一抗孵育。(4)用識(shí)別兔和小鼠免疫球蛋白的生物素偶聯(lián)二抗配方進(jìn)行免疫檢測(cè),后用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素,并與兔生物素化抗小鼠免疫球蛋白G抗體(DAKO SA)連接。(5)用DAB顯色并用梅氏蘇木精26反染色。所有免疫染色均使用徠卡BOND RX研究自動(dòng)免疫染色裝置進(jìn)行處理,用半定量評(píng)分解釋抗lps抗體免疫染色(0=陰性,1=弱染色,2=中染色,3=強(qiáng)染色)。對(duì)腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞進(jìn)行半定量評(píng)價(jià)(0:無(wú)細(xì)胞,+:<5%,++:5～25%,+++:> 25%)。用抗cd163抗體免疫染色的巨噬細(xì)胞百分比也用以下評(píng)分進(jìn)行半定量評(píng)估:組織學(xué)評(píng)分(HS):HS 0:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞;Hs 1 (+):150%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,組間差異通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,采用Spearman秩相關(guān)非參數(shù)檢驗(yàn)確定Fn與免疫相關(guān)基因水平的關(guān)系。用Kaplan-Meier法估計(jì)存活分布,用log-rank檢驗(yàn)確定生存率差異的顯著性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué) 本研究共收集了151例OSCC患者,患者大多是男性(61.6%),中位年齡為57歲(范圍22～78歲),≥56歲占70.2%,不飲酒者占61.2%,但吸煙者占55.1%,HPV陰性者占97.4%,PN 0階段占53.6%,UICC第四階段腫瘤占42.4%。124個(gè)(82.1%)樣本Fn呈陽(yáng)性,與年齡較大(≥56歲:74.2%vs.51.9%,P=0.021)、飲酒者較少(34.9%vs.60.0%,P=0.034)和淋巴結(jié)受累頻率較低(PN 0階段,58.1%vs.33.3%,P=0.001 6)有關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué) 例(%)

2.2 Fn與OSCC總生存期(OS)的關(guān)系 為了獲得OSCC總生存期(OS),Fn陽(yáng)性腫瘤患者的結(jié)局明顯優(yōu)于27例Fn陰性腫瘤患者的結(jié)果(HR:0.51,P=0.009 4;5年OS 60.5%vs.37.7%,10年OS 47.9%vs.18.8%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

圖1 Fn與OSCC總生存期(OS)的關(guān)系

2.3 Fn與無(wú)復(fù)發(fā)(RFS)和無(wú)轉(zhuǎn)移生存期(MFS)的關(guān)系 為了獲得Fn與無(wú)復(fù)發(fā)(RFS)和無(wú)轉(zhuǎn)移生存期(MFS)的關(guān)系,本研究發(fā)現(xiàn)142例患者對(duì)疾病復(fù)發(fā)具有研究?jī)r(jià)值。Fn陽(yáng)性腫瘤患者(35.5%vs.51.8%,P=0.11)的疾病復(fù)發(fā)頻率降低的不顯著趨勢(shì),與Fn陰性腫瘤相比,局部區(qū)域性(70.5%vs.53.3%,P=0.041)與轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)相比更明顯,見表1。

根據(jù)Fn狀態(tài)的RFS和MFS曲線如圖2所示。與Fn陰性腫瘤相比,Fn陽(yáng)性腫瘤與顯著更長(zhǎng)的RFS(中位數(shù):7.06vs.2.11個(gè)月,P=0.009 1)和MFS(9.71vs.3.54個(gè)月,P=0.001 6)相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 Fn與無(wú)復(fù)發(fā)(RFS)和無(wú)轉(zhuǎn)移生存期(MFS)的關(guān)系

2.4 Fn與免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)的關(guān)系 為了探索Fn陽(yáng)性腫瘤良好預(yù)后的潛在機(jī)制,本研究觀察到Fn陽(yáng)性與B淋巴細(xì)胞(CD20,P=0.027),T輔助淋巴細(xì)胞(CD4,P=0.013),M2巨噬細(xì)胞(CD163,P=0.020)和成纖維細(xì)胞(PDGFRβ,P=0.006 7)的標(biāo)志物之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。Toll樣受體(TLR)4(P=0.020)和OX40配體(TNFSF4)(P=0.006 7)表達(dá)在Fn陽(yáng)性的腫瘤中顯著降低。TNFSF9受體(TNFRSF9)的表達(dá)隨著核細(xì)胞負(fù)荷的增加而增加,以及促炎細(xì)胞因子IL-1β(P=0.020)。Fn陽(yáng)性與TNFSF4、TNFSF9、IL1B 和 CD163 表達(dá)水平之間的相關(guān)性如圖所示。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),為了驗(yàn)證細(xì)菌和免疫細(xì)胞(尤其是巨噬細(xì)胞)之間的相互作用,進(jìn)行了免疫染色,以使用抗脂多糖(LPS)抗體和抗CD163標(biāo)記M2巨噬細(xì)胞來(lái)檢測(cè)細(xì)菌。結(jié)果表明具有高(或低)CD163和Fn RNA水平的腫瘤分別顯示高(或低)CD163和LPS表達(dá),CD163和LPS表達(dá)水平之間呈負(fù)相關(guān),見圖3、4。

注:A:CD163和LPS免疫染色在CD163高/LPS低病例,LPS:輕微表達(dá);Fn陰性;B:CD163低/LPS高病例,LPS:強(qiáng)表達(dá);Fn陽(yáng)性

圖4 Fn與免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)的關(guān)系

3 討論

口腔細(xì)菌菌群在維持健康的口腔生理環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用,口腔微生物組的變化與癌癥有關(guān),最近,已經(jīng)證明在腫瘤組織中也發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌,即所謂的“腫瘤內(nèi)”微生物群[2]。Fn是口腔的常見細(xì)菌之一,已被確定為口腔疾病(如牙周炎和口腔癌)的潛在病原細(xì)菌[8]。本研究在評(píng)估了腫瘤內(nèi)Fn與臨床病理特征以及OS,RFS和MFS在兩個(gè)獨(dú)立的OSCC患者隊(duì)列中的相關(guān)性,并探索了核福菌與眾所周知的免疫相關(guān)基因之間的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fn鑒定了OSCC的一個(gè)亞組,在年齡較大的不飲酒患者中更常見,與較低的淋巴結(jié)浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)相關(guān),Fn陽(yáng)性腫瘤患者的結(jié)局明顯優(yōu)于Fn陰性腫瘤患者,與RFS和MFS結(jié)果相關(guān)。

研究顯示Fn與生存率之間呈正相關(guān),因?yàn)榧?xì)菌通常與癌癥的預(yù)后不良有關(guān),特別是在結(jié)直腸癌中,Fn可調(diào)節(jié)癌癥的局部免疫力[9]。此外研究顯示Fn通過(guò)結(jié)合宿主受體,調(diào)節(jié)宿主信號(hào)通路和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)來(lái)黏附并侵入口腔上皮細(xì)胞,誘導(dǎo)宿主的炎癥環(huán)境并促進(jìn)炎癥因子和絲氨酸蛋白酶的分泌,破壞免疫炎癥平衡并破壞牙周組織,慢性感染與癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[10]。本研究評(píng)估了Fn與各種免疫相關(guān)基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián),以探索Fn陽(yáng)性腫瘤有利預(yù)后的潛在機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),具有高Fn的腫瘤顯示出低水平的M2巨噬細(xì)胞(CD163),CD4淋巴細(xì)胞,成纖維細(xì)胞(PDGFRβ),TLR4,OX40配體(TNFSF4)和TNFRSF9,以及高水平的TNFSF9和IL-1β。免疫組化分析證實(shí),革蘭氏陰性(LPS陽(yáng)性)細(xì)菌(包括Fn陽(yáng)性)與CD163陽(yáng)性細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。

在大多數(shù)研究中,Fn感染被證明可以擴(kuò)增骨髓來(lái)源的免疫細(xì)胞和Tregs,促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化,誘導(dǎo)促腫瘤炎癥,從而抑制T細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡,它還通過(guò)Fap2等蛋白質(zhì)直接抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性[11]。TLR是一系列受體,參與微生物制劑的檢測(cè),以誘導(dǎo)炎癥和抗菌先天免疫應(yīng)答的激活,TLR4是一種在巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的受體,并且參與了Fn的這些促炎/免疫抑制活性[12]。相關(guān)研究顯示在腸道炎癥的小鼠模型中,TLR2/TLR4敲除誘導(dǎo)核霉菌的定植增加和包括IL-1β在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[13]。在本研究中,觀察到Fn陽(yáng)性與低水平的TLR4和M2巨噬細(xì)胞有關(guān)。另一項(xiàng)研究表明,Fn增強(qiáng)了TNFSF9/IL-1β信號(hào)傳導(dǎo),誘導(dǎo)了M1巨噬細(xì)胞極化,M1極化缺乏影響可以通過(guò)伴隨TNFSF9受體的降低[14]。炎癥和M2浸潤(rùn)被發(fā)現(xiàn)與OSCC的預(yù)后不良有關(guān)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TNFSF9和IL-1β細(xì)胞因子的表達(dá)水平之間觀察到的核細(xì)胞負(fù)荷呈正相關(guān)。但該研究有以下局限性。本研究為單中心、小樣本研究,其結(jié)論需要在多中心、大樣本研究中得到證實(shí)。

綜上所述,Fn陽(yáng)性與年齡較大、較少飲酒和吸煙及較低的淋巴結(jié)侵犯頻率有關(guān),Fn陽(yáng)性腫瘤的復(fù)發(fā)率較低,與Fn陰性腫瘤相比,轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)較少,OS、無(wú)復(fù)發(fā)和無(wú)轉(zhuǎn)移生存期明顯更長(zhǎng)。免疫相關(guān)基因和免疫組化分析顯示Fn載量與M2巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。Fn相關(guān)OSCC具有特定的免疫微環(huán)境,在老年、不飲酒的患者中更常見,預(yù)后良好,為其治療提供了一定的指導(dǎo)意義。

利益相關(guān)聲明:本文所有作者聲明不存在任何利益沖突,本文中所有研究結(jié)果未在任何雜志發(fā)表過(guò)。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明:周麗鳳負(fù)責(zé)了論文的全部撰寫和進(jìn)行研究設(shè)計(jì);張蓉蓉、王麗、梁巧梅負(fù)責(zé)實(shí)施了本文中病例收集、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)等;蔣霞在論文撰寫修改、討論以及研究設(shè)計(jì)中都有巨大貢獻(xiàn)。