鄧玲玉，朱 華，許立拔，謝鳳鳳，羅 靜，平靜云，農(nóng)麗珍，李茵蘭，曾艷芳，陳雅玲，岑 思

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，南寧 530200）

發(fā)熱，即體溫升高超出正常范圍，是一種機(jī)體警示多種因素所致疾病發(fā)生發(fā)展的重要信號(hào)，如組織損傷、感染、腫瘤或移植排斥等［1］。維持體溫恒定可維持機(jī)體新陳代謝和正常生命活動(dòng)，但人體高熱狀態(tài)下，不及時(shí)降溫，易發(fā)生腦組織損傷、缺氧等，引發(fā)抽搐、脫水、昏厥等高危癥候，危及生命［2-4］。嬰幼兒大腦體溫調(diào)節(jié)中樞尚未發(fā)育成熟，高溫刺激易導(dǎo)致其損傷，出現(xiàn)危重癥狀或留下危重后遺癥［2，3］。中醫(yī)記載發(fā)熱始見于《內(nèi)經(jīng)》《素問》等，記為“病熱”“身熱”，中醫(yī)認(rèn)為誘發(fā)發(fā)熱病因眾多，是機(jī)體正邪相爭(zhēng)或陰陽失調(diào)的表現(xiàn)，發(fā)熱類型有微熱、壯熱、潮熱、骨蒸煩熱、惡寒發(fā)熱和往來寒熱等［5］。

LPS 是革蘭陰性菌釋放的脂多糖，是一種外源性致熱源。LPS 進(jìn)入機(jī)體可導(dǎo)致多組織器官產(chǎn)生氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，加速多種組織器官纖維化進(jìn)程，如肺纖維化、肝纖維化等，刺激多種炎癥因子水平升高，如前列腺素E2（PGE2），PGE2是刺激大腦體溫調(diào)控中樞升高體溫的主要因子［6，7］。

人體血液內(nèi)LPS 的主要來源是腸道，正常情況下，LPS 不透過腸壁或稍有透過，透過腸道入血的少量LPS 可與抗-LPS-抗體或高密度脂蛋白（HDL-C）形成復(fù)合物，或被肝、脾的單核巨噬細(xì)胞吞噬而清除。而高溫、疾病等刺激誘發(fā)機(jī)體高溫，可使腸道腸系膜通透性增加，腸源性LPS 入血濃度增加，外源性致熱源如內(nèi)毒素（LPS）進(jìn)入機(jī)體，直接或間接作用于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，分泌內(nèi)生致熱原物質(zhì)，刺激體溫調(diào)節(jié)中樞調(diào)高體溫調(diào)定點(diǎn)，引起發(fā)熱［8，9］。血液LPS 濃度過高，還會(huì)引發(fā)休克、彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）和多器官功能障礙綜合征等［10］。高溫是腸源性LPS 入血的主要原因，故解熱降溫是相應(yīng)治療藥物的直接藥效指標(biāo)之一。

解熱試驗(yàn)常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是家兔或大鼠，其中家兔對(duì)LPS 敏感，易復(fù)制發(fā)熱模型，且發(fā)熱持續(xù)時(shí)間長，故解熱試驗(yàn)首選家兔。通過檢測(cè)體溫變化可以簡單評(píng)價(jià)疾病所致的機(jī)體病理學(xué)改變和預(yù)后［11］。但目前LPS 復(fù)制家兔發(fā)熱模型受試驗(yàn)環(huán)境的影響，滿足試驗(yàn)要求的LPS 造模濃度各不相同。

呂邵娃等［2］建立家兔發(fā)熱模型，采用家兔耳緣靜脈注入LPS 溶液，濃度為20 μg/mL，劑量為20 μg/kg；鄭晨等［12］、周彥希等［13］建立家兔發(fā)熱模型，采用家兔耳緣靜脈注入LPS 溶液，濃度為2 μg/mL，劑量為2 μg/kg；周茜雅等［14］、徐志勇等［15］建立家兔發(fā)熱模型，采用家兔耳緣靜脈注入LPS溶液，濃度為0.2 μg/mL，劑量為0.2 μg/kg；馬中女等［16］建立家兔發(fā)熱模型，采用家兔耳緣靜脈注入LPS溶液，濃度為0.5 μg/mL，劑量為0.5 μg/kg；巴圖德力根等［17］建立家兔發(fā)熱模型，采用家兔耳緣靜脈注入LPS 溶液，濃度為0.75 μg/mL，劑量為0.75 μg/kg；李雪苓等［18］建立家兔發(fā)熱模型，采用家兔耳緣靜脈注入LPS 溶液，濃度為2.5 μg/mL，劑量為3.75 μg/kg?？梢姡囼?yàn)前探索適合本試驗(yàn)條件下LPS 致家兔發(fā)熱模型建立的LPS 濃度非常有必要，成功的LPS 致家兔發(fā)熱模型應(yīng)該滿足體溫在規(guī)定時(shí)間內(nèi)升高到規(guī)定的體溫，并具有可控性，即有合適的陽性對(duì)照藥可以拮抗LPS 的升溫作用。只有模型方法認(rèn)證成功才能用于藥物的解熱作用研究。

臨床常用解熱藥物有阿司匹林、對(duì)乙酰氨基酚［19］、布洛芬、水楊酰胺、撲熱息痛及非那西丁等［20］，應(yīng)用此類藥進(jìn)行治療可達(dá)到解熱的效果，但造成的副反應(yīng)較多［19］，如對(duì)血液系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，包括引起再生貧血、粒細(xì)胞及血小板計(jì)數(shù)減少等；對(duì)消化系統(tǒng)的不良影響包括惡心、嘔吐、腹痛等；對(duì)泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生最多的不良反應(yīng)有血尿、急性腎功能衰竭等；產(chǎn)生過敏反應(yīng)包括過敏性皮疹、哮喘以及過敏性休克，嚴(yán)重者可能造成患者死亡［21］。壯瑤醫(yī)藥是壯瑤族人民在漫長的生產(chǎn)生活及同疾病斗爭(zhēng)中形成和發(fā)展起來的，是國內(nèi)中醫(yī)藥的重要組成部分。壯瑤藥狗肝菜具有清熱、涼血、解毒作用［22］；拳卷地錢清熱利濕、解毒斂瘡［23］；鐵皮石斛微寒，益胃生津，滋陰清熱［24］；白子菜清熱解毒，涼血止血［25］；火炭母清熱解毒，利濕消滯［26］；旱田草理氣活血，解毒消腫［27］；蘭香草疏風(fēng)解表，祛痰止咳，散瘀止痛［28］；蝴蝶草清熱涼血，消瘀腫［29，30］?？Х人?、原兒茶酸、丁香酸、槲皮素、綠原酸、木犀草素、山奈酚為上述壯瑤藥藥材的活性成分，因此，本研究對(duì)壯瑤藥單味藥提取物或單體進(jìn)行篩選，以期為壯瑤藥解熱藥物研發(fā)提供試驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境

新西蘭家兔45只，雄性，普通級(jí)，體重1.7～3.0 kg，購于廣西廣得生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK 桂2017-0001，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)兔房，溫度監(jiān)控室為功能實(shí)驗(yàn)室熱原室，符合普通級(jí)要求［31］，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（桂）2019-0001。

1.2 藥物及試劑

蝙蝠草（廣西壯族自治區(qū)柳州市鹿寨縣拉鉤鄉(xiāng)），為豆科蝙蝠草屬植物蝙蝠草［Christia vespertilionis（L.f.）Bahn.f.］的干燥全草；火炭母（廣西河池市大化縣巖灘鎮(zhèn)六甲村），為蓼科蓼屬植物火炭母（Polygonum chinenseL.）的干燥全草；蘭香草（廣西藥用植物園），為馬鞭草科蕕屬植物蘭香草［Caryopterisincana（Thunb.）Miq.］的全草；旱田草（南寧市上林縣），玄參科植物旱田草［Lindernia ruellioides（Colsm.）Pennell.］的全草；鐵皮石斛（南寧市江南區(qū)蘇圩鎮(zhèn)廣西弄峰山鐵皮石斛種植基地），為蘭科植物鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）的莖；狗肝菜（南寧市青秀區(qū)藥師山），為爵床科植物狗肝菜［Dicliptera chinensis（L.）Nees.］的全草；白子菜，菊科植物白背三七［Gynura divaricata（Linn.）DC.］的全草；拳卷地錢，地錢科地錢屬植物拳卷地錢（Marchantia convoiutaGao et Chang）的全草。以上植物經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)滕建北教授鑒定為正品，所用提取物由廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

內(nèi)毒素（LPS）（批號(hào)0000081275），美國Sigma 公司；NaCl 注射液（批號(hào)2020071911），江西東亞制藥有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（批號(hào)20151215），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；醫(yī)用乙醇（批號(hào)20150801），武漢市雪環(huán)醫(yī)用消毒用品有限公司；咖啡酸（批號(hào)110885-200102）、原兒茶酸（批號(hào)110809-201906）、槲皮素（批號(hào)100081-201610）、沒食子酸（批號(hào)110831-201906）、山奈酚（批號(hào)110861-202013）、木犀草素（批號(hào)111520-202006）、異槲皮苷（批號(hào)111809-201804）、茜草素（批號(hào)110884-201606）、橙皮苷（批號(hào)110721-202019）、對(duì)香豆酸（批號(hào)112037-201801）、川陳皮素（批號(hào)112055-202001）、甜菜堿（批號(hào)110894-201604）、醋酸氯已定（批號(hào)100183-201003），中國食品藥品檢定研究院；綠原酸（批號(hào)MUST-21070910），成都曼斯特生物科技有限公司；異綠原酸（批號(hào)RP190517），成都麥德生科技有限公司；丁香酸（批號(hào)17122703），成都菲爾德生物技術(shù)有限公司；金合歡素（批號(hào)20170612），上海詩丹德科技生物有限公司；紫云英苷（批號(hào)171205），成都瑞芬思生物科技有限公司。以上國家標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%。鞣花酸（批號(hào)G26J11L119602），上海源葉生物科技有限公司，經(jīng)HPLC 檢測(cè)鞣花酸含量為96.0%；芹菜素（批號(hào)C12462383），上海麥克林生化科技有限公司，經(jīng)高效液相色譜儀（HPLC）檢測(cè)芹菜素含量≥95.0%。

1.3 儀器

MP100K 型電子臺(tái)秤，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；ES 2220M 型電子天平（感量：1 mg），瑞士PRECISA；ZRY-2D 型智能熱原儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司；Direct-Q 5 UV-R 型超純水儀，美國Merck Millipore；DHG-9240A 型鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 試驗(yàn)環(huán)境

使用空調(diào)控制家兔體溫監(jiān)控室和飼養(yǎng)室的室溫差，不超過3 ℃，家兔體溫監(jiān)控室的室溫控制在22～25 ℃，試驗(yàn)期間室溫變化值不超過3 ℃。每1 h 記錄室溫1 次。

2.2 家兔的初篩

取家兔45 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，預(yù)編號(hào)，使用智能熱原儀初篩，30 min 記錄肛溫1 次，共8 次，肛溫均在38.0～39.6 ℃，且溫差不超過0.4 ℃被認(rèn)定是合格家兔，經(jīng)篩選，有43 只家兔符合要求，用于試驗(yàn)。

2.3 LPS 致家兔發(fā)熱模型的建立

試驗(yàn)前禁食24 h，造模前測(cè)定家兔肛溫2 次，間隔1 h，取2 次肛溫的均值作為基礎(chǔ)體溫，淘汰肛溫不在38.5～39.5 ℃或溫差大于0.4 ℃的家兔。隨機(jī)選取6 只家兔編入正常組，按1 mL/kg 于耳緣靜脈注射無菌生理鹽水，其余家兔按1 mL/kg 于耳緣靜脈注射LPS，LPS 劑量設(shè)置分別為0.2、2.0、4.0、20.0 μg/kg，濃度分別為0.2、2.0、4.0、20.0 μg/mL，每濃度6 只家兔［2，12-18］。記錄造模后1、2、3、4、5 h 的肛溫，每1 h 記錄1 次，共5 次，記錄各時(shí)間點(diǎn)肛溫、肛溫變化值（即肛溫與基礎(chǔ)體溫差值）。①50%或以上家兔造模后1 h肛溫升溫≥0.8 ℃；②各時(shí)間點(diǎn)肛溫、基礎(chǔ)體溫差值與正常對(duì)照組具有顯著性差異（P＜0.05）；③無死亡。

模型可控性認(rèn)證試驗(yàn)：取合格家兔6 只，耳緣靜脈注射符合①②③條件的LPS 劑量及LPS 濃度造模，造模后1 h，按0.5 mL/kg 灌胃給予布洛芬藥液（10 mg/kg）［32］后，記錄給藥后1、2、3、4 h 的肛溫，每1 h 記錄1 次，共4 次，應(yīng)至少1 個(gè)時(shí)間點(diǎn)肛溫或基礎(chǔ)體溫差值與正常對(duì)照組具有顯著性差異（P＜0.05），均則認(rèn)為該LPS劑量及LPS濃度適合用于藥物篩選。

肛溫變化率=100%×（造模后1 h 肛溫-給藥后時(shí)間點(diǎn)肛溫）/造模后1 h 肛溫增長量。

2.4 八種有解熱功效壯瑤藥的提取物對(duì)LPS 致發(fā)熱家兔影響的研究

2.4.1 劑量設(shè)計(jì) 8 種有解熱功效的壯瑤藥提取物劑量均設(shè)定為200 mg/kg，按5 mL/kg 給藥?；鹛磕复继嵛锏酶嗦蕿?1.26%，1 g 浸膏=8.88 g 原藥材。蝙蝠草醇提物得膏率為9.88%，1 g 相當(dāng)于原藥材10.12 g。蘭香草水提物得膏率為14.33%，1 g 相當(dāng)于原藥材6.98 g。旱田草4 個(gè)部位提取物：石油醚部位得膏率為0.71%，1 g 相當(dāng)于原藥材140.8 g；水部位得膏率為12.66%，1 g 相當(dāng)于原藥材7.9 g；正丁醇部位得膏率為6.85%，1 g 相當(dāng)于原藥材14.6 g；乙酸乙酯部位得膏率為2.04%，1 g 相當(dāng)于原藥材49.0 g。鐵皮石斛榨汁，直接用于試驗(yàn)。白子菜水提物得膏率為14.33%，1 g 相當(dāng)于原藥材5.26 g。拳卷地錢醇提物得膏率為9.36%，1 g相當(dāng)于原藥材10.68 g。狗肝菜醇提物得膏率為10.29%，1 g相當(dāng)于原藥材9.71 g。2.4.2 供試品的配制 火炭母醇提物，蝙蝠草醇提物，旱田草石油醚部位、水部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位提取物，拳卷地錢醇提物，狗肝菜醇提物，加0.5%羧甲基纖維素鈉（0.5% CMC-Na）配制成40 mg/mL 混懸液，用于灌胃。蘭香草水提物、白子菜水提物加去離子水配制成40 mg/mL 藥液，用于灌胃。鐵皮石斛榨汁，取新鮮鐵皮石斛加去離子水榨汁，過濾成40 mg/mL 榨汁液，用于灌胃。所用布洛芬混懸液，布洛芬的含量為20 mg/mL，故無需配制，按0.5 mL/kg 直接用于灌胃，灌完后用2 mL 去離子水將藥液完全助推入胃內(nèi)。

2.4.3 造模、分組及給藥 試驗(yàn)前禁食24 h，造模前測(cè)定家兔肛溫2 次，間隔1 h，取2 次肛溫的均值作為基礎(chǔ)體溫，淘汰肛溫不在38.5～39.5 ℃或溫差大于0.4 ℃的家兔。合格家兔按1 mL/kg 于耳緣靜脈注射LPS（4 μg/kg）。LPS 注射1 h 后，選取肛溫升溫≥0.8 ℃的家兔13 只，分為模型組、火炭母醇提物組、蝙蝠草醇提物組、旱田草4 個(gè)部位組（石油醚部位、水部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位）提取物、拳卷地錢醇提物組、狗肝菜醇提物組、蘭香草水提物組、白子菜水提物組、鐵皮石斛榨汁組，所用供試品劑量均采用200 mg/kg，布洛芬組（10 mg/kg），每組1 只。供試品不同濃度的相應(yīng)藥液按5 mL/kg 灌胃給藥，布洛芬混懸液按0.5 mL/kg 灌胃給藥。記錄給藥后1、2、3、4 h 肛溫，每1 h 記錄1 次，共4 次。記錄各時(shí)間點(diǎn)肛溫、肛溫變化值，并計(jì)算肛溫變化率和解熱積分。解熱積分評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：肛溫變化率下降＜25%，計(jì)0 分；25%≤肛溫變化率下降＜50%，計(jì)1 分；50%≤肛溫變化率下降＜75%，計(jì)2 分；75%≤肛溫變化率下降＜100%，計(jì)3 分；100%≤肛溫變化率下降，計(jì)4 分。

2.5 有解熱功效壯瑤藥的20 種活性單體對(duì)LPS 致發(fā)熱家兔的影響

2.5.1 劑量設(shè)計(jì)、供試品溶解度及給藥途徑的確定 18 種有解熱功效壯瑤藥活性單體，為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)品，20 mg/瓶，統(tǒng)一使用NaCl 注射液配制成5 mL 藥液（4 mg/mL），按2 mL/kg 腹腔注射或靜脈注射，劑量為8 mg/kg。其中咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異槲皮苷、茜草素、橙皮苷、金合歡素、醋酸氯已定、對(duì)香豆酸、紫云英苷、川陳皮素、異綠原酸不能完全溶解、微溶或不溶，不適合用于靜脈注射，故采用腹腔注射給藥（i.p）；綠原酸、沒食子酸、甜菜堿能完全溶解，故采用靜脈注射給藥（i.v）；2 種有解熱功效壯瑤藥化合物單體芹菜素和鞣花酸，量大，適合用于灌胃（i.g），芹菜素（20 mg/kg）和鞣花酸（50 mg/kg）按5 mL/kg 給藥。

2.5.2 造模、分組及給藥 試驗(yàn)前禁食24 h，造模前測(cè)定家兔肛溫2 次，間隔1 h，取2 次肛溫均值作為基礎(chǔ)體溫，淘汰肛溫不在38.5～39.5 ℃或溫差大于0.4 ℃的家兔。合格家兔按1 mL/kg 于耳緣靜脈注射LPS（4 μg/kg）。LPS 注射1 h 后，選取肛溫升溫≥0.8 ℃的家兔22 只，適合腹腔注射的標(biāo)準(zhǔn)品單體，按2 mL/kg 腹腔注射；適合靜脈注射的標(biāo)準(zhǔn)品單體按2 mL/kg 靜脈注射；適合灌胃的單體按5 mL/kg 灌胃給藥。另設(shè)模型組、布洛芬組（10 mg/kg），每組1 只。記錄給藥后1、2、3、4 h 肛溫，每1 h 記錄1 次，共4 次。記錄各時(shí)間點(diǎn)肛溫、肛溫變化值，并計(jì)算肛溫變化率和解熱積分。解熱積分評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)同“2.4.3”，肛溫變化率計(jì)算公式同“2.3”。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以x±s表示，P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量數(shù)據(jù)需滿足正態(tài)分布和方差齊性，整體數(shù)據(jù)先進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA Test），若無差異，則結(jié)束，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，下一步進(jìn)行LSD Test 分析；非正態(tài)數(shù)據(jù)或方差不齊的數(shù)據(jù)，先進(jìn)行Kruskal-Wallis Test 分析，若無差異，則結(jié)束，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，下一步進(jìn)行Mann-Whitney U Test 分析。肛溫變化率采用卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異性。

3 結(jié)果與分析

3.1 LPS 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)家兔肛溫的影響

由表1、表2 可知，與對(duì)照組比較，LPS 0.2 μg/kg劑量組造模后4 h 肛溫顯著增加，4 h 和5 h 肛溫增長量差異顯著或極顯著；LPS 2.0 μg/kg 劑量組造模后，除4 h 肛溫增長量差異不顯著外，其余時(shí)間點(diǎn)肛溫及肛溫增長量差異均顯著或極顯著；LPS 4.0 μg/kg 劑量組造模后，各時(shí)間點(diǎn)肛溫及肛溫增長量差異均極顯著；LPS 20.0 μg/kg 劑量組造模后，除3 h 肛溫和肛溫增長量差異不顯著外，其余時(shí)間點(diǎn)肛溫及肛溫增長量差異均顯著或極顯著。LPS 2.0、4.0、20.0 μg/kg劑量組均可滿足造模后1 h 肛溫增長量大于0.8 ℃的要求，但20.0 μg/kg 劑量組3 h 后出現(xiàn)2 只家兔死亡，死亡率為33.33%，有死亡風(fēng)險(xiǎn)，不利于試驗(yàn)順利進(jìn)行，故不適合用于造模；LPS 2.0、4.0 μg/kg 劑量組均適合用于試驗(yàn)，但4.0 μg/kg 劑量組肛溫及肛溫增長更穩(wěn)定，故每1 h 記錄肛溫1 次，共5 次經(jīng)模型可控性認(rèn)證試驗(yàn)。

表1 LPS 對(duì)家兔不同時(shí)間點(diǎn)肛溫的影響

表2 LPS 對(duì)家兔不同時(shí)間點(diǎn)肛溫增長的影響

由表3 可知，與基礎(chǔ)肛溫比較，造模1、4 h 后，布洛芬組家兔肛溫顯著增加。給藥后，降溫效果維持2 h，3 h 后出現(xiàn)升溫，說明布洛芬給藥后3 h 可能對(duì)LPS 抑制作用減弱；與造模后肛溫及肛溫增長比較，藥后各時(shí)間點(diǎn)肛溫及肛溫增長均顯著減少，說明LPS 4.0 μg/kg 劑量適合用于造模，且具有可控性。

表3 布洛芬對(duì)LPS 所致發(fā)熱家兔不同時(shí)間點(diǎn)肛溫增長的影響

3.2 八種有解熱功效壯瑤藥的提取物對(duì)LPS 致發(fā)熱家兔的影響

由表4 可知，造模后，模型組家兔肛溫持續(xù)升高，且維持高溫狀態(tài)，未見明顯降溫趨勢(shì)；而布洛芬組家兔給藥后1 h 肛溫明顯降低，與模型組比較，給藥后1～4 h 各時(shí)間點(diǎn)肛溫變化率均極顯著降低，最大肛溫變化率為131.3%；給藥后，除狗肝菜醇提物外，其余7 種有解熱功效壯瑤藥的提取物均有1 個(gè)或以上時(shí)間點(diǎn)肛溫變化率均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），按解熱積分大小排序表現(xiàn)為蝙蝠草醇提物（11）＞旱田草水部位提取物（10）＞白子菜水提物（9）＞火炭母醇提物（8）＞旱田草石油醚部位提取物（7）＞拳卷地錢醇提物（6）＞蘭香草水提物（4）＞旱田草正丁醇部位提取物（2）＞鐵皮石斛榨汁（1）＞旱田草乙酸乙酯部位提取物（0），狗肝菜醇提物（0），其中，給藥后4 h 內(nèi)最大肛溫變化率下降超50%的提取物有蝙蝠草醇提物、旱田草水部位提取物、白子菜水提物、火炭母醇提物、旱田草石油醚部位提取物、拳卷地錢醇提物、蘭香草水提物，最大肛溫變化率分別下降120.0%、112.5%、140.0%、83.3%、91.7%、84.6%、81.3%。

表4 八種有解熱功效壯瑤藥的提取物對(duì)LPS 所致發(fā)熱家兔不同時(shí)間點(diǎn)肛溫的影響

3.3 有解熱功效壯瑤藥的20 種活性單體對(duì)LPS 致發(fā)熱家兔的影響

由表5 可知，造模后，模型組家兔肛溫持續(xù)升高，且維持高溫狀態(tài)；而布洛芬組家兔給藥后1 h 肛溫明顯降低，與模型組比較，給藥后4 h 內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)肛溫變化率均極顯著降低，最大肛溫變化率為89.5%；給藥后，除咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸，異綠原酸外，其余16 種有解熱功效的壯瑤藥活性單體均有1 個(gè)或以上時(shí)間點(diǎn)肛溫變化率顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），按解熱積分大小排序表現(xiàn)為山奈酚（13）＞川陳皮素（12）＞橙皮苷（10）＞異槲皮素（9）、芹菜素（9）＞槲皮素（8）、紫云英苷（8）、沒食子酸（8）＞醋酸氯己定（7）、鞣花酸（7）＞綠原酸（6）、木犀草素（6）、金合歡素（6）＞茜草素（2）＞對(duì)香豆酸（1）＞咖啡酸（0）、原兒茶酸（0）、丁香酸（0）、異綠原酸（0）、甜菜堿（0），其中，給藥后4 h 內(nèi)最大肛溫變化率下降超50%的提取物有山奈酚、川陳皮素、橙皮苷、異槲皮素、芹菜素、槲皮素、紫云英苷、沒食子酸、醋酸氯己定、鞣花酸、綠原酸、木犀草素、金合歡素，最大肛溫變化率分別下降116.7%、100.0%、107.7%、100.0%、133.3%、77.8%、72.7%、80.0%、88.2%、145.5%、64.7%、58.3%、68.8%。

表5 有解熱功效壯瑤藥的20 種活性單體對(duì)LPS 所致發(fā)熱家兔不同時(shí)間點(diǎn)肛溫的影響

4 討論

發(fā)熱病病機(jī)復(fù)雜，最常見為外感發(fā)熱。持續(xù)高熱，特別是患兒的體溫長期維持在38.5 ℃以上，易出現(xiàn)糖代謝障礙，甚至嚴(yán)重破壞血腦屏障［33］。且持續(xù)高熱加快人體耗氧量和各種營養(yǎng)素的代謝，使機(jī)體抵抗力下降，增加感染機(jī)會(huì)［34］。

祖國醫(yī)學(xué)早在五千年前就有了外感發(fā)熱的記載，《素問》篇章《熱論》《刺熱》《評(píng)熱病論》及《靈樞·熱病》篇章《熱病》中均有外感風(fēng)熱的描述，如《素問·熱論》曰：“今膚熱病，皆傷寒……人之傷于寒也，則為病熱”。發(fā)熱被壯醫(yī)命名為“勒爺發(fā)得”，認(rèn)為“病從毒起”，其中“毒”分為外生之毒和內(nèi)生之毒，邪毒阻滯人體“三道兩路”，使氣血臟腑神經(jīng)等功能紊亂而發(fā)病，故發(fā)熱當(dāng)以祛毒、調(diào)氣為先［35，36］。

壯醫(yī)認(rèn)為“陰陽為本、三氣同步”，蓄毒與祛毒均與“三道兩路”相關(guān)，即“三道兩路”皆可蓄毒與祛毒。“三道兩路”又隱喻為“外道內(nèi)路”。三道與自然相通，即谷道、水道、氣道。谷道對(duì)應(yīng)人體從自然獲取和排泄?fàn)I養(yǎng)精微的一切通道，不僅包括消化道和臟腑，如食道、胃腸和肝、膽、胰等；水道對(duì)應(yīng)人體從自然獲取和排泄滋陰物質(zhì)（不只是水）的一切通道，不僅包括腎、膀胱，排泄滋陰物質(zhì)也包括汗、尿等；氣道對(duì)應(yīng)人與自然交換和排泄與生命相關(guān)氣體（不只是空氣）的一切通道，不僅是肺、毛孔等；兩路與人體生命活動(dòng)相關(guān)，即龍路和火路，龍路又名血脈、龍脈，是人體內(nèi)與生命相關(guān)物質(zhì)運(yùn)行的通道，包括血脈、淋巴管脈、體液脈絡(luò)等；火路是人體內(nèi)傳遞與生命相關(guān)信息的通道，如感覺、電波、音波、聲波等［35-38］。壯醫(yī)的“三道兩路”區(qū)別于傳統(tǒng)中醫(yī)，即三道兩路是無形的，是壯醫(yī)藥發(fā)展的信息集合體。

發(fā)熱病從毒起，又分外生之毒和內(nèi)生之毒，故發(fā)熱當(dāng)以祛毒為先?！巴獾漓疃尽?，即通過辨證論治，讓毒通過三道而解。若毒生于谷道，即致熱性營養(yǎng)精微攝入過多或排泄不暢，則應(yīng)停止攝入或增加排泄；若毒生于水道，即滋陰性物質(zhì)攝入不足或排泄過多，不足以滿足陰陽平衡的生命運(yùn)行狀態(tài)，則應(yīng)增加攝入或減少排泄；若毒生于氣道，即六淫（風(fēng)、寒、暑、濕、燥、火）之邪氣和疫疬之氣侵襲過盛，如天氣過熱而產(chǎn)生機(jī)體中暑，邪蘊(yùn)體內(nèi)而致病，當(dāng)使用醫(yī)學(xué)手段啟動(dòng)人體衛(wèi)氣、營氣、元?dú)?，祛邪外出或滅邪于體內(nèi)?！皟?nèi)路祛毒”，即通過辨證論治，讓毒通過兩路而解。若因龍路運(yùn)行失調(diào)而導(dǎo)致毒蘊(yùn)體內(nèi)或排毒不暢，則應(yīng)使用醫(yī)學(xué)手段啟動(dòng)增強(qiáng)龍路運(yùn)行，滅毒于體內(nèi)或驅(qū)毒外出；若因火路傳遞信息受阻或傳遞異常信息而導(dǎo)致毒蘊(yùn)體內(nèi)或排毒不暢，則應(yīng)疏通信息脈絡(luò)（如針灸、泡浴等），向大腦中樞傳遞正確信息，利用三道和龍路滅毒于體內(nèi)或驅(qū)毒外出［35-38］。

廣西是少數(shù)民族集聚地，其中壯瑤藥對(duì)廣西人民身體健康影響深遠(yuǎn)。具有退熱功效的壯瑤藥是研發(fā)解熱新藥的寶庫。有研究表明，壯藥制劑香茅退熱外洗方［39］、救必應(yīng)顆粒［40］、童熱清浴劑［41，42］、抗感清熱顆粒［43］和瑤藥“野葛花”［44］、美麗胡枝子［45］均具有良好的解熱功效。在壯醫(yī)理論的指導(dǎo)下，朱華等［30］編寫了《中國壯藥圖鑒》，記載了狗肝菜、拳卷地錢、鐵皮石斛、白子菜、火炭母、旱田草、蘭香草、蝴蝶草等均具有解熱功效，為本研究選取試材及其有效成分單體提供了實(shí)踐和理論依據(jù)。

家兔是解熱試驗(yàn)的首選動(dòng)物，且對(duì)LPS 敏感，但因環(huán)境不同發(fā)熱強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間均不相同［11］。為了確定本試驗(yàn)條件下可以滿足藥物評(píng)價(jià)的穩(wěn)定致熱家兔模型，進(jìn)行了LPS 致家兔發(fā)熱濃度及劑量考察，發(fā)現(xiàn)LPS 濃度為4.0 μg/mL，劑量為4.0 μg/kg 造模效果最佳，多次試驗(yàn)均可滿足家兔造模后5 h 內(nèi)維持高溫狀態(tài)，且該升溫作用可以被布洛芬所拮抗，滿足動(dòng)物模型復(fù)制臨床癥狀特征和可控性的藥物評(píng)價(jià)要求，說明LPS 誘導(dǎo)的家兔發(fā)熱模型復(fù)制成功。

本研究結(jié)果顯示，以給藥后4 h 內(nèi)肛溫變化率超50%為解熱效果陽性標(biāo)準(zhǔn)，8 種壯瑤藥有7 種滿足陽性結(jié)果評(píng)價(jià)要求，按解熱積分由大到小排序依次為蝙蝠草醇提物、旱田草水部位提取物、白子菜水提物、火炭母醇提物、旱田草石油醚部位提取物、拳卷地錢醇提物、蘭香草水提物、旱田草正丁醇部位提取物、鐵皮石斛榨汁，而旱田草乙酸乙酯部位提取物和狗肝菜醇提物被認(rèn)定為解熱無效物質(zhì)；20 種單體物質(zhì)有13 種滿足陽性結(jié)果評(píng)價(jià)要求，按解熱積分由大到小排序依次為山奈酚、川陳皮素、橙皮苷、異槲皮素、芹菜素、槲皮素、紫云英苷、沒食子酸、醋酸氯己定、鞣花酸、綠原酸、木犀草素、金合歡素，而7 種單體被認(rèn)定為解熱無效物質(zhì)，分別為茜草素、對(duì)香豆酸、咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸、異綠原酸、甜菜堿。其中旱田草有解熱作用的單體成分有芹菜素、木犀草素，無解熱作用的單體有咖啡酸［46］；白子菜有解熱作用的單體成分有槲皮素、山奈酚、異槲皮素、紫云英苷，無解熱作用的單體有對(duì)香豆酸［47］；火炭母有解熱作用的單體成分有槲皮素、異槲皮素、芹菜素、山奈酚、木犀草素、沒食子酸、鞣花酸，無解熱作用的單體有咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸［48］；拳卷地錢有解熱作用的單體成分有芹菜素、槲皮素、木犀草素［49］；蘭香草有解熱作用的單體成分有芹菜素、木犀草素、沒食子酸，無解熱作用的單體有原兒茶酸［50］；鐵皮石斛有解熱作用的單體成分有芹菜素、槲皮素、異槲皮素、山奈酚［51］。其中芹菜素、木犀草素、槲皮素、山奈酚為多種解熱壯瑤藥所共有的有效成分單體。

綜上，通過LPS 復(fù)制家兔發(fā)熱模型，用于評(píng)價(jià)壯瑤藥提取物及其有效成分單體的解熱作用，發(fā)現(xiàn)多種有解熱作用的提取物和有效解熱單體，但由于時(shí)間短、資金不足、且研究強(qiáng)度太大，每個(gè)供試品模型樣本量僅為1，不能滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，所得結(jié)果欠科學(xué)性，且所設(shè)置的供試品劑量和給藥途徑各不相同，不具有可比性，所用有效成分單體數(shù)量較少，不能代表所用壯瑤藥的有效成分，所得結(jié)果僅供參考，更多解熱作用模型和相關(guān)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)；有部分有效單體不是本試驗(yàn)所用壯瑤藥活性成分，因此后期可根據(jù)活性成分單體篩選出更多有解熱作用的壯瑤藥藥材；篩選出的芹菜素、木犀草素、槲皮素、山奈酚4 種共有的有效成分單體，下一步可以進(jìn)行更深入的解熱作用及機(jī)制研究。

5 小結(jié)

在本試驗(yàn)條件下，經(jīng)劑量和濃度考察，LPS 復(fù)制家兔發(fā)熱模型的最佳濃度為4.0 μg/mL，最佳劑量為4.0 μg/kg，該發(fā)熱模型用于壯瑤藥提取物及有效成分單體篩選，發(fā)現(xiàn)有解熱作用的有效提取物按解熱積分由大到小排序依次為蝙蝠草醇提物、旱田草水部位提取物、白子菜水提物、火炭母醇提物、旱田草石油醚部位提取物、拳卷地錢醇提物、蘭香草水提物、旱田草正丁醇部位提取物、鐵皮石斛榨汁；有解熱作用的有效成分單體按解熱積分由大到小排序依次為山奈酚、川陳皮素、橙皮苷、異槲皮素、芹菜素、槲皮素、紫云英苷、沒食子酸、醋酸氯己定、鞣花酸、綠原酸、木犀草素和金合歡素。