林 旻，楊紹華，林 艷，王 月，胡太蛟，宋亞娜，潘雷博，陳在杰*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所/福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點實驗室,福建 福州 350003; 2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350002)

得益于生物信息學(xué)、基因組學(xué)、表型組學(xué)、芯片技術(shù)等發(fā)展，水稻迎來了智能育種4.0時代。對育種家來說，數(shù)字技術(shù)的應(yīng)用可顯著提升作物新品種的選育效率。近年來，基于高通量測序及DNA芯片技術(shù)的第三代SNP(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)蓬勃發(fā)展，包括：基于競爭性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)、TaqMan、半熱不對稱逆向PCR(Semi-Thermal Asymmetric Reverse PCR，STARP)等類型的分子標(biāo)記檢測技術(shù)。其中，STARP標(biāo)記由于其低成本、高通量、多平臺兼容性好的特點，目前已在水稻[1]、小麥[2]等作物中大量應(yīng)用，是基因型鑒定的重要手段。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的檢測對象是大批量遺傳分離群體，所以高通量、低成本、高質(zhì)量的DNA提取方法是關(guān)鍵，直接影響分子標(biāo)記篩選效率。

目前，水稻分子檢測的DNA來源多為葉片。常規(guī)的DNA提取方法中TPS法[3]可滿足快速、高通量提取水稻葉片中的DNA。大規(guī)模群體篩選時，采取水稻葉片需要單株單葉標(biāo)記，操作煩瑣、容易出錯；受水稻生長階段的限制，獲得分子檢測結(jié)果后，再結(jié)合表型開展后續(xù)篩選，費時費事費地。而“先篩后種”可以大大提高育種規(guī)模與基因資源的挖掘利用效率，同時加快育種進程。從水稻種子中提取DNA用于分析，在育苗前完成鑒定，可以有效解決上述問題，但水稻種子中80%的成分都是淀粉，采用TPS法無法快速提出高質(zhì)量的DNA。因此，急需開發(fā)一種適用于高通量基因分型的高質(zhì)量水稻切片種子DNA提取制備技術(shù)。

利用磁珠法[4]中超順磁性納米粒子在一定環(huán)境下與核酸結(jié)合，通過淀粉酶解與4輪洗滌步驟可以去除水稻種子中大量的淀粉、蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)。鑒于該法以上特點，本研究提出96孔板結(jié)合磁珠法，采用自動化核酸提取工作站提取水稻種子切片DNA，通過對比TPS法提取水稻葉片DNA及96孔板結(jié)合磁珠法提取切片種子DNA的純度和濃度，進一步采用STARP標(biāo)記檢測驗證96孔板結(jié)合磁珠法提取水稻切片種子DNA的質(zhì)量，以期獲得一種96孔板結(jié)合磁珠法提取DNA的高通量基因分型操作流程，可為大規(guī)模水稻樣品檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來自福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點實驗室收集保存且已完成基因組測序樣品：長粒香、特青、粵農(nóng)絲苗、水源377、TN05、野豐占、金優(yōu)1號等119份優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。

1.2 儀器和試劑

1.2.1樣品前處理與核酸提取設(shè)備 自動種子切片機(北京金標(biāo)記生物科技有限公司 CGMB-20R)、超高通量組織研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司JXFSTPRP-576)、臺式離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司H2100R)、8道自動移液工作站(蘇州中析儀器有限公司SC9300)、全自動核酸提取儀(杭州奧盛儀器有限公司Auto-Pure 96)、超微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司Nano-500)。

1.2.2高通量基因分型設(shè)備 高通量基因分型系統(tǒng)(成都翰辰光翼科技有限責(zé)任公司GeneMatrix)由反應(yīng)板制備儀MatrixArrayer、高通量水浴熱循環(huán)儀MatrixCycler與高速熒光掃描儀MatrixScanner三臺設(shè)備及HC-master基因分型數(shù)據(jù)處理軟件組成。

1.2.3主要試劑 TPS緩沖液：10 mL 1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、2 mL 0.5 mol·L-1EDTA(pH 8.0)、7.45 g KCl，用純水定容至100 mL；裂解液Ⅰ：10 mL 1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、3 mL 1 mol·L-1NaCl、2 mL 0.5 mol·L-1EDTA、5 g SDS，用純水定容至100 mL；酶處理液：中溫α-淀粉酶水溶液；裂解液Ⅱ：70.92 g異硫氰酸胍、7.5 mL 1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、3 g月桂酰基氨酸、6 mL 0.5 mol·L-1EDTA，用純水定容至100 mL；TE緩沖液：0.12114 g Tris、200 μL 1 mmol·L-1EDTA，用純水定容至100 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1TPS法和96孔板結(jié)合磁珠法提取水稻DNA步驟

TPS法。(1)15 mg葉片研磨成粉，加入TPS提取液300 μL；(2)70℃水浴45 min，其間每隔10 min上下顛倒搖勻1次；(3)放置室溫后4000 r·min-1離心15 min，取上清至新的深孔板；(4)加入無水乙醇(上清∶無水乙醇=1∶2.5)，-20℃冰箱冰凍30 min以上；(5)4000 r·min-1離心15 min，棄上清，加入75%乙醇300 μL，振蕩懸浮液，4000 r·min-1離心15 min，棄上清，待干燥后加入100 μL TE緩沖液，即獲得DNA溶液。

96孔板結(jié)合磁珠法。(1)將水稻種子脫殼得到糙米，使用自動種子切片機或手工將糙米對等切分成兩半，不帶胚的切片放入96深孔板供DNA提取使用，含胚切片放入96孔育苗盤留作發(fā)芽成苗；(2)將含有不帶胚切片研磨成勻漿后的96深孔板(B1)置于8道自動移液工作站，向每個樣本加入120 μL裂解液Ⅰ，溫控振蕩儀65℃、800 r·min-1裂解15 min；(3)使用8道自動移液工作站向B1中加入10 μL酶處理液，70℃消化15 min；(4)將B1使用4000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心15 min后，使用全自動移液工作站吸取上清到新的96孔提取板(B2)，將B2使用全自動移液工作站加入180 μL裂解液Ⅱ后，置于溫控振蕩儀65℃、800 r·min-1裂解15 min；(5)使用8道自動移液工作站向B2依次加入480 μL異丙醇、40 μL磁珠、200 μL TE緩沖液，獲得DNA混合液；(6)放入全自動核酸提取儀，配置程序，按如下板位放置96深孔板進行DNA提取，板位1：磁棒套；板位2：DNA混合液；板位3：每孔400 μL異丙醇；板位4：每孔400 μL80%乙醇；板位5：每孔400 μL異丙醇；板位6：每孔400 μL80%乙醇；板位8：每孔200 μLTE緩沖液，板位8獲得的就是純化后的樣品DNA溶液。

1.3.2提取水稻葉片和切片種子DNA質(zhì)量和濃度測定 隨機選取32個不同品種水稻，分別用TPS法提取水稻苗期葉片DNA及96孔板結(jié)合磁珠法提取水稻切片種子DNA。每個品種的兩種方法各提取3個重復(fù)。核酸的濃度和純度通過ODA260、ODA280和ODA230值分析[5]，ODA260/A230的比值用于評價DNA多糖、鹽離子等雜質(zhì)的污染程度；ODA260/A280的比值用于評價蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)的污染程度。理想狀態(tài)ODA260/A230的比值應(yīng)大于2.00，ODA260/A280的比值低于1.60表明含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染，高于2.00表明含有RNA等雜質(zhì)污染。

吸取1～2 μLDNA原液，使用超微量分光光度計分別測定TPS法、96孔板結(jié)合磁珠法提取的DNA樣品濃度和純度(在230、260和280 nm波長處的吸光值)，每個方法隨機抽取檢測8個品種(長粒香、特青、粵農(nóng)絲苗、水源377、TN05、野豐占、金優(yōu)1號和農(nóng)香32)并使用0.5% DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品核酸的完整度和質(zhì)量(100 V、20 min)。

1.3.3STARP標(biāo)記檢測驗證 利用STARP技術(shù)對兩個水稻優(yōu)異基因進行分子標(biāo)記檢測，以驗證96孔板結(jié)合磁珠法提取水稻切片種子DNA的質(zhì)量。本研究針對粒型基因GS3[6]、米質(zhì)基因Wx[7]分別進行基因分型。PCR擴增體系參考Long等[1]，根據(jù)引物接頭的不同，擴增產(chǎn)物中長粒型等位基因gs3為HEX信號，而短粒型等位基因GS3為FAM信號；高直鏈淀粉等位基因Wxa為FAM信號，低直鏈淀粉等位基因Wxb為HEX信號，STARP反應(yīng)體系見表1所示。由高通量基因分型系統(tǒng)的Matrix Arrayer自動化構(gòu)建獲得384孔的PCR擴增板，之后放入水浴熱循環(huán)儀Matrix Cycler中進行擴增。

表1 PCR反應(yīng)體系

水浴PCR反應(yīng)程序為，94℃ 3 min變性；第一階段循環(huán)為94℃ 20 s，56℃退火延伸2 min，每個循環(huán)降低1℃，共6個循環(huán)，第2個階段循環(huán)為94℃ 20 s，62℃退火延伸90 s，42個循環(huán)；最后62℃延伸2 min。在高速熒光掃描儀Matrix Scanner上讀取熒光信號值，通過HC-master基因分型軟件自動分析基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

由圖1可知，經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測，96孔板結(jié)合磁珠法提取的DNA條帶可以清晰、明亮的目的條帶，而TPS法提取的DNA大多降解呈現(xiàn)彌散帶。

注：a)為96孔板結(jié)合磁珠法提取水稻切片種子DNA；b)為TPS法提取水稻葉片DNA；1～8分別代表長粒香、特青、粵農(nóng)絲苗、水源377、TN05、野豐占、金優(yōu)1號和農(nóng)香32。圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis

2.2 核酸提取結(jié)果與分析

由表2可知，96孔板結(jié)合磁珠法提取DNA濃度為46～102 ng·μL-1，TPS法提取核酸濃度為49～81 ng·μL-1，二者沒有明顯的差別。但TPS法提取的葉片DNA溶液ODA260/A230在1.22～1.62，ODA260/A280在1.63～1.88，96孔板結(jié)合磁珠法提取的水稻切片種子DNA溶液ODA260/A230在1.60～1.90，ODA260/A280在1.73～1.90，每一組樣品的均值均高于TPS法提取的葉片DNA溶液，說明TPS雖然快速簡便但存在多糖等雜質(zhì)，純度低。以上結(jié)果表明96孔板結(jié)合磁珠法提取水稻種子切片DNA的質(zhì)量明顯優(yōu)于TPS法提取水稻葉片DNA的質(zhì)量。

表2 不同提取方法的DNA濃度、質(zhì)量

2.3 STARP標(biāo)記檢測驗證結(jié)果

由圖2a可知，GS3基因分型結(jié)果顯示95份樣品分為3種基因型，其中短粒型10份，長粒型66份，雜合型19份；由圖2b可知，Wx基因分型結(jié)果顯示94份樣品分為2個不同類群(圖2b)，其中低直鏈淀粉型79份，高直鏈淀粉型15份。由表3可見，兩種優(yōu)異功能基因分型結(jié)果和各品種已知測序基因型完全一致，表明使用本方法提取水稻切片種子DNA可適用于GS3、Wx的STARP標(biāo)記基因分型。

注：a)為GS3基因分型，長粒型等位基因為HEX信號(黃)，短粒型等位基因為FAM信號(紅)，雜合型為綠；b)為Wx基因分型，低直鏈淀粉等位基因為HEX信號(黃)，高直鏈淀粉等位基因為FAM信號(紅)圖2 水稻種質(zhì)資源GS3、Wx基因STARP標(biāo)記分析Fig.2 STARP marker analysis of GS3 and Wx genes in rice germplasm resources

表3 水稻種質(zhì)資源GS3、Wx基因型鑒定結(jié)果

2.4 96孔板結(jié)合磁珠法提取DNA的高通量基因分型流程

應(yīng)用自動種子切片機，8 h可完成4000粒水稻種子切片與自動分裝；配合超高通量組織研磨儀、8道自動移液工作站及全自動核酸提取儀，采用96孔板結(jié)合磁珠法DNA提取方法，可實現(xiàn)高通量水稻切片種子樣本核酸的自動化提??；結(jié)合高通量基因分型設(shè)備可實現(xiàn)每日數(shù)萬個基因分型數(shù)據(jù)點的檢測通量。高通量分型操作流程如圖3所示。

圖3 高通量基因分型流程示意圖Fig.3 Schematic diagram of the high-throughput genotyping

3 討論與結(jié)論

本研究兩種方法提取的DNA溶液ODA260/A280的范圍都在1.60～2.00，均可用于后續(xù)分子檢測試驗，但從DNA瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果看，膠孔存在微弱條帶說明都有存在少量蛋白質(zhì)污染，出于成本與時間考慮，兩種方法都沒有添加去除蛋白質(zhì)的試驗步驟，而磁珠納米粒子在吸附DNA同時有部分蛋白質(zhì)也會裹挾在納米粒子表面，但是不會對STARP標(biāo)記結(jié)果產(chǎn)生影響。

目前水稻分子標(biāo)記快速檢測主要使用TPS法提取水稻葉片核酸，該方法雖然簡單、快速，但是提取的核酸純度較低，存在蛋白質(zhì)及多糖的污染，完整性差、保存時間短，不利于多批次多位點的檢測。本研究利用水稻切片種子作為DNA抽提材料，相比于從葉片提取DNA的方法，不受育苗場地與苗期的時間限制，可提高基因分型的靈活性與效率。本研究采用高通量種子切片機，基于96孔板提取水稻切片種子核酸，操作簡單，省時高效，一人一天可以提取4000份以上的樣品。

分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)使育種家可以根據(jù)地域、飲食偏好有針對性的選育聚合不同優(yōu)異功能單倍型的水稻新品種。例如粒型不僅是外觀品質(zhì)性狀，也是影響米質(zhì)的關(guān)鍵基因，對提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)至關(guān)重要[8]。粒型的改變甚至可以提高水稻產(chǎn)量和外觀品質(zhì)，培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的水稻品種。Liu等[9]通過聚合GS3、LGY3與直立密穗基因DEP1這3個基因的特定單倍型，提高水稻籽粒的長度、改善水稻籽粒的長寬比，達到同時改良水稻產(chǎn)量性狀與品質(zhì)性狀的目的，在顯著提升稻米品質(zhì)的基礎(chǔ)上還可使其產(chǎn)量增加7%以上。水稻直鏈淀粉是評價水稻蒸煮食味品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，針對不同的用途其對直鏈淀粉的高低需求也不同。本研究96孔板結(jié)合磁珠法提取的核酸用STARP標(biāo)記分型進行驗證，對控制粒型基因GS3、直鏈淀粉含量基因Wx進行鑒定，其結(jié)果與各品種重測序基因型一致，說明本法提取出的核酸純度高、可用于育種群體的高通量基因分型，也為大規(guī)模水稻樣品檢測提供技術(shù)支持。