魏林艷，樊佳星，張 敏，王進(jìn)蘭，謝鴻光，魏毅東，張建福*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/水稻國家工程實(shí)驗(yàn)室, 福建 福州 350003;2.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 福建 福州 350002)

糯稻(glutinous rice)作為中國重要的農(nóng)作物之一，因其米粒含有糯性淀粉而備受青睞。糯稻不僅是許多地區(qū)的傳統(tǒng)主食，還可以制作出粽子、酒釀、湯圓等多種傳統(tǒng)小吃。目前，抗瘟糯稻新品種相對匱乏，據(jù)2022、2023年福建省初審?fù)ㄟ^主要農(nóng)作物品種目錄可知，糯稻新品種的僅2個(gè)、且都不抗稻瘟病。因此，需要?jiǎng)?chuàng)制抗瘟糯稻新種質(zhì)來應(yīng)對不斷變化的生態(tài)環(huán)境和生產(chǎn)環(huán)境。糯稻一般指胚乳直鏈淀粉含量低于2%的水稻[1]，而顆粒結(jié)合淀粉合酶(Granule-Bound Starch Synthase，GBSS)基因Waxy(Wx)是控制直鏈淀粉含量的主效基因[2]。因此，Wx基因的多態(tài)性在很大程度上決定了直鏈淀粉含量的多樣性[3]。過去的研究發(fā)現(xiàn)存在多種Wx自然等位基因，這些基因控制著水稻直鏈淀粉含量從低于2%到高于25%的范圍[3-5]。其中，Wx基因的缺失突變體Wx導(dǎo)致直鏈淀粉下降到2%以上，是稻米糯性的主要效應(yīng)基因[6-7]。

CIRPSR/Cas9系統(tǒng)是近年來迅速發(fā)展的高效、準(zhǔn)確、便捷的基因編輯技術(shù)。與轉(zhuǎn)基因不同，基因編輯技術(shù)可以在不引入外源基因的情況下對目標(biāo)基因進(jìn)行敲除突變，可用于水稻品種的精確改良。福香占(閩審稻20200011)是福建省農(nóng)科院水稻研究所于2020年新育成的優(yōu)質(zhì)、抗瘟、長粒秈型常規(guī)稻品種，具有較好的推廣潛力。本研究的目標(biāo)是利用基因編輯技術(shù)快速創(chuàng)制福香占糯稻材料，為抗瘟病糯稻育種提供新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

CRISPR/Cas9敲除載體PHUE411由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院陳其軍教授惠贈(zèng)；農(nóng)桿菌菌株EHA105由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻國家工程實(shí)驗(yàn)室保存；受體材料秈稻福香占由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻國家工程實(shí)驗(yàn)室提供。所有轉(zhuǎn)基因材料種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)基地，采用常規(guī)種植與水肥管理。

1.2 載體構(gòu)建

將Wx基因的登錄號(hào)LOC_Os06g04200在CRISPR-PLANT(https://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，選擇內(nèi)含子與外顯子交界處的靶點(diǎn)作為候選位點(diǎn)，設(shè)計(jì)該靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9敲除引物(Wx-sgRNA-F：AATAATGGTCTCAGGCGAGCCTCGAGTGCTGC-CTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC，Wx-sgRNA-R:ATTATTGGTCTCTAAACGCAGGCAGCACTCGAGGCTCGCTTCTTGGTGCC)隨后以sgRNA質(zhì)粒元件pCBC-MT1T2為模板PCR擴(kuò)增目的片段，采用KOD-FX高保真酶(東洋紡生物科技有限公司)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系見表1。

表1 PCR擴(kuò)增體系及流程

隨后將產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測并回收，將產(chǎn)物與敲除載體PHUE411通過金門法進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，所用T4連接酶以及BsaI內(nèi)切酶購自New England Biolabs(NEB)，連接步驟見表2。獲得最終有正確敲除片段的重組質(zhì)粒后，利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后用于水稻轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化法參照本實(shí)驗(yàn)室建立體系進(jìn)行[8]。

表2 金門連接反應(yīng)體系

1.3 基因編輯載體的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株分子檢測

基因編輯載體的遺傳轉(zhuǎn)化采用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，具體參考文獻(xiàn)[9]。剪取樣品幼嫩葉片，用CTAB法提取DNA。針對Wx基因突變型分析，采用PCR擴(kuò)增子測序的方法，引物采用Wx基因靶點(diǎn)側(cè)翼引物Wx-seq-F：CCTGGTAGGAGATGTTGTGGATG和Wx-seq-R：AGGTTTTTCCATTGCTACAAGCGT，所得產(chǎn)物大小735 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 ：DNA模板50 ng，2×TaqPCR Mix 12.5 μL，10 mmol·L-1引物各 1 μL ，Nuclease-Free Water 定容至 25 μL。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃ 5 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)(94℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s)。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后送測序公司(鉑尚生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行測序。測序結(jié)果利用SnapGene軟件進(jìn)行初步比對，雜合體測序雙峰采用DSDecodeM[10]進(jìn)行解析。

1.4 突變體植株田間農(nóng)藝性狀調(diào)查

田間材料按照《國家水稻品種試驗(yàn)觀察記載項(xiàng)目、方法標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行株高、分蘗數(shù)、株高、千粒重等農(nóng)藝性狀調(diào)查進(jìn)行考查，每個(gè)株系重復(fù)5～8個(gè)單株，獲得數(shù)據(jù)通過Graphpad進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 突變體株系稻米淀粉含量測定

總淀粉含量按國標(biāo) GB5006-1985《谷物籽粒粗淀粉測定法》所述方法進(jìn)行，直鏈淀粉含量測定依據(jù)國標(biāo)GB7648-87《水稻、玉米、谷子籽粒直鏈淀粉測定法》所述方法進(jìn)行，所有樣品測定3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)采用Graphpad進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 突變體株系稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病抗性鑒定選擇福建省上杭縣稻瘟病高壓病圃中進(jìn)行，每個(gè)品種按小區(qū)播種，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，四周設(shè)置感病誘發(fā)行。在苗期觀察并記錄苗瘟發(fā)病情況，將存活植株移栽到大病圃種植至成熟，其間觀察葉瘟和穗瘟的發(fā)生情況。苗瘟、葉瘟和穗頸瘟分級(jí)按國際水稻所0～9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因編輯載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

通過靶點(diǎn)在線評估以及突變類型分析，選取Wx編碼區(qū)第5外顯子上游邊界區(qū)域作為CRISPR靶點(diǎn)(圖1A)，設(shè)計(jì)通過金門連接法將Wx的基因編輯靶點(diǎn)串聯(lián)重組至CRISPR/Cas9載體PHUE411上(圖1B)。通過農(nóng)桿菌的水稻轉(zhuǎn)化法將Wx基因編輯載體轉(zhuǎn)入受體福香占，共獲得T0代獨(dú)立克隆12個(gè)(圖2)。

注：A為Wx基因結(jié)構(gòu)圖，白色部分為非翻譯區(qū)，綠色部分為編碼區(qū)，折線部分為內(nèi)含子區(qū)，紅色三角形標(biāo)注為本研究設(shè)計(jì)的Wx靶點(diǎn)。B為Wx敲除載體結(jié)構(gòu)圖，LB/RB為T-DNA的左/右臂，OsU3p/TaU3p為U3啟動(dòng)子區(qū)，藍(lán)色區(qū)域?yàn)楹蠾x靶點(diǎn)的sgRNA序列，U3t為終止子區(qū)，Cas9/HygR分別表示Cas9蛋白/潮霉素抗性蛋白表達(dá)盒圖1 Wx基因基因編輯載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of Wx Genome Editing Vector

注：M1～12為12個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化克隆圖2 Wx基因編輯T0代材料Fig.2 T0 Generation Materials of Wx Genome Editin

2.2 利用基因編輯獲得Wx基因突變植株

提取T0植株DNA進(jìn)行靶點(diǎn)突變分析，結(jié)果表明12個(gè)克隆均檢測到編輯事件(圖3)，其中雙等位突變10株，單等位突變2株。詳細(xì)的堿基變異見(表3)，由于所選靶點(diǎn)位于外顯子和內(nèi)含子交界處，根據(jù)突變類型不同，可能會(huì)形成Wx基因內(nèi)含子滯留或者編碼區(qū)移碼兩種類型。通過突變類型分析，結(jié)合田間農(nóng)藝性狀觀察，確定了2個(gè)克隆M1和M9為后續(xù)研究材料。M1和M9在外顯子區(qū)分別插入和刪除了一個(gè)堿基“G”，屬于移碼突變，會(huì)形成無功能(Loss-of-function)的蛋白變體，可作為糯稻候選材料進(jìn)行種植。

注：參考序列為福香占Wx基因靶點(diǎn)周邊序列，藍(lán)色標(biāo)識(shí)為靶點(diǎn)PAM序列，紅色標(biāo)識(shí)為靶點(diǎn)區(qū)域，小寫字符為內(nèi)含子序列，大寫字符為外顯子序列，三角形標(biāo)注Cas9蛋白的切點(diǎn)(PAM序列上游-3/-4之間)；M1～3為3個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化克隆測序峰圖，紅色箭頭標(biāo)注出現(xiàn)突變的峰圖起始位點(diǎn)圖3 Wx基因編輯材料突變檢測Fig.3 Mutation Detection of Wx Genome Editing Materials

表3 T0代植株突變基因型

2.3 Wx基因編輯植株的表型鑒定

由于T0代植株為雙等位突變，為了獲得純合突變體植株，對T0代收獲的種子進(jìn)行了突變型分析，M1和M9移碼突變體都篩選到純合的無功能突變型種子(圖4)。將這些種子擴(kuò)繁提純后獲得兩個(gè)株系G-1(M1子代)和G-2(M9子代)，對突變體株系進(jìn)行農(nóng)藝性狀考查和糙米外觀品質(zhì)檢測，結(jié)果表明突變體株的抽穗期、株高、穗長與福香占相似，而產(chǎn)量性狀略有不同，其中G-1和G-2千粒重略有下降，G-1差異達(dá)到顯著水平，但兩個(gè)株系的總體產(chǎn)量與對照相比，無顯著差異(表4)。此外，通過外觀品質(zhì)可以看出福香占透明度較高，兩個(gè)基因編輯的株系的透明度較差，呈糊化狀態(tài)?？沙醪脚袛鄡蓚€(gè)株系均為糯稻材料(圖5)。

注：參考序列為福香占Wx基因靶點(diǎn)周邊序列，G-1和G-2純合突變體序列(上)和測序峰圖(下)。圖4 Wx純合缺失突變體基因型鑒定Fig 4 Genotype Identification of Wx Homozygous Deletion Mutants

注：FXZ為親本福香占，G-1和G-2為2個(gè)缺失突變株系，標(biāo)尺為1 cm。圖5 Wx缺失突變體糙米外觀形態(tài)Fig.5 Appearance of Wx knockout Mutant Brown Rice

表4 突變體株系農(nóng)藝性狀調(diào)查

2.4 Wx基因編輯植株的直鏈淀粉含量測定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證突變體植株的糯稻表型，測定了福香占和突變系G-1和G-2的稻米直鏈淀粉和總淀粉含量。由表5可知，親本福香占的直鏈淀粉含量為16.3%，2個(gè)純合株系的直鏈淀粉含量分別為1.64% 和1.81%，符合糯米國家標(biāo)準(zhǔn)的2%范圍內(nèi)。綜上所述，本試驗(yàn)通過基因編輯技術(shù)成功獲得福香占糯稻新材料。

表5 突變體株系淀粉含量測定

表6 福香占糯稻家系稻瘟病抗性鑒定

2.5 福香占糯稻材料的稻瘟病抗性鑒定

從G-1和G-2株系中各選了5個(gè)綜合性狀好的單株進(jìn)行擴(kuò)繁。福建稻瘟病高致病菌種對10個(gè)家系材料進(jìn)行稻瘟病接種鑒定。結(jié)果表明，10個(gè)株系均有稻瘟病抗性，其苗瘟和葉瘟均為 0～1級(jí)，株系G1-1/3/5、G2-1/2穗頸瘟 0～1 級(jí)，綜合抗性評價(jià)為抗稻瘟病，株系G1-2/4、G2-3/4/5穗頸瘟3級(jí)，綜合抗性評價(jià)為中抗稻瘟病(表 6)。以上結(jié)果表明，利用基因編輯改良福香占的糯性，能基本保持其稻瘟病抗性。

3 討論與結(jié)論

隨著近年來功能基因組學(xué)和基因編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，基因編輯已經(jīng)廣泛應(yīng)用于作物性狀改良和種質(zhì)創(chuàng)制，在品質(zhì)、株型、抗性等多個(gè)方面取得了顯著進(jìn)展[11-15]?；蚓庉嬜鳛橐环N不引入外源片段的靶向改良方法，具有后代遺傳穩(wěn)定和多性狀快速改良的優(yōu)勢[16]。在本研究中，我們選取了優(yōu)質(zhì)抗瘟常規(guī)稻福香占進(jìn)行基因編輯，通過田間的選擇，突變株系在株高、穗數(shù)、生育期等農(nóng)藝性狀方面沒有顯著差異。同時(shí)，這些突變體還保持了對稻瘟病的抗性特性，適合用于改良現(xiàn)有的潛力品種，避免了煩瑣的回交導(dǎo)入選育過程。

根據(jù)本研究的結(jié)果，Wx基因的敲除對性狀產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)并不顯著。然而，突變體中的千粒重大約降低了1.4%。這可能是由于Wx基因參與胚乳淀粉合成途徑的重要性，其突變會(huì)引起籽粒灌漿的生理和分子變化。此前的研究也觀察到敲除Wx基因后千粒重略微下降的現(xiàn)象[7]。然而，其他類似的Wx基因編輯研究中，大部分材料的千粒重沒有發(fā)生下降，甚至有些突變體略微升高[6，17-19]，這可能是由于不同遺傳背景產(chǎn)生的效應(yīng)差異。此外，福香占的突變系穗粒數(shù)略有升高，因此總體產(chǎn)量并沒有顯著變化。然而，要實(shí)現(xiàn)福香占糯稻種質(zhì)的真正育種應(yīng)用，還需要進(jìn)行一系列的工作：除獲得基因編輯的安全證書外，還需要對其環(huán)境適應(yīng)性、抗逆性和其他生產(chǎn)特性進(jìn)行全面評估，以更全面地評估Wx基因敲除的影響。

值得注意的是，隨著基因編輯技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，已經(jīng)開發(fā)出更先進(jìn)的工具，可以精確地降低或激活特定基因的表達(dá)，從而創(chuàng)制出目標(biāo)性狀梯度突變的材料。以Wx基因?yàn)槔?，通過對啟動(dòng)子和5′UTR區(qū)的定點(diǎn)突變，可以產(chǎn)生直鏈淀粉梯度變化的種質(zhì)，如高直鏈淀粉的米粉稻和松軟口感的軟米品種等，極大地?cái)U(kuò)展了基因編輯在育種上的應(yīng)用[20-22]。這些編輯位點(diǎn)同樣可以進(jìn)行編輯，創(chuàng)制出更豐富多樣的福香占抗瘟衍生系，以滿足不同市場需求。在未來的研究中，我們將繼續(xù)探索基因編輯技術(shù)在水稻種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用，推動(dòng)水稻生物育種的創(chuàng)新發(fā)展。