吳玲玲,李彩蓉**,王 靜

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院;3.咸寧市第一人民醫(yī)院)

糖尿病腎病(diabetes nephropathy,DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一[1],占糖尿病發(fā)病率的15%～40%,其中一部分最終會發(fā)展為終末期腎臟病[2-3]。雖然通過口服降糖藥聯(lián)合降壓藥的方法來治療DN在臨床上被證明是有效的,但是治療效果有限,并且對于提高患者的生存率沒有明顯的影響。中藥由于其多成分、多靶點、多通路且副作用小的作用特點,在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛。有研究發(fā)現(xiàn),中藥及其活性成分可以調(diào)節(jié)DN的多種發(fā)病機制,在腎功能保護方面有著可觀的臨床效應(yīng)[4]。因此,研究中藥治療DN的相關(guān)機制是非常有必要的。

人參為五加科植物人參的干燥根和根莖,據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載人參“味甘微寒,主補五臟,安精神,定魂魄,止驚悸,除邪氣”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[5]發(fā)現(xiàn),人參具有抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等藥理活性。由于中藥具有多成分、多靶點、多通路聯(lián)合發(fā)揮作用的特點,且目前對于人參治療DN的機制尚不夠明確,而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被認為是一種合適的研究中藥作用機制的方法[6]。因此,本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對人參治療DN的機制進行了研究。

1 資料與方法

1.1 人參有效成分篩選及靶點預(yù)測

以“人參”為關(guān)鍵詞,在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP,ttps://tcmspw.com/tcmsp.php)進行搜索,并設(shè)置類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,篩選人參有效成分和其對應(yīng)的靶點,再利用uniprot數(shù)據(jù)庫將篩選得到的靶點名稱轉(zhuǎn)換為基因名稱,得到人參的靶點。

1.2 疾病靶點的篩選

以“Diabetic Nephropathy”為關(guān)鍵詞,利用Genecards(https://www.genecards.org/,5.8版)和在線孟德爾人類遺傳(OMIM,https://omim.org/)兩個數(shù)據(jù)庫篩選DN的疾病靶點,將從兩個數(shù)據(jù)庫篩選得到的靶點進行合并,刪除重復(fù)靶點,最后再進行2次中位數(shù)篩選,最終將中位數(shù)≥2.7的靶點作為DN的疾病靶點。

1.3 人參與DN交集靶點的預(yù)測

將篩選得到的人參的靶點和DN的疾病靶點同時輸入軟件Veeny 2.1中,繪制韋恩圖,得到人參與DN的交集靶點。

1.4 藥物-化合物-靶點網(wǎng)路預(yù)測

將人參的活性成分和其對應(yīng)的靶點輸入軟件Cytoscape-v3.8.2中得到藥物-化合物-靶點網(wǎng)路圖。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及核心靶點篩選

將篩選得到的人參與DN的交集靶點上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/,版本11.5),設(shè)定物種為“Homo Spiens”,評分條件設(shè)置為>0.40,接著將network display options設(shè)定為“disable structure previews inside network bubbles”刪除離散的點,得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。將從STRING數(shù)據(jù)庫獲取的PPI網(wǎng)絡(luò)圖的“TSV”格式上傳到軟件Cytoscape-v3.8.2,應(yīng)用CytoNCA插件計算各個節(jié)點BC、CC、DC和EC值,得到核心靶點。

1.6 GO生物功能和KEGG通路富集分析

將人參和DN的交集靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifc rf.gov/,6.8版)進行GO生物功能和KEGG通路富集分析,設(shè)定P<0.05進行校正,獲取GO生物功能和KEGG通路富集分析數(shù)據(jù),選取最顯著的前10條通路的數(shù)據(jù)輸入微生信(https://www.bioinformatics.com.cn)在線分析平臺,進行GO和KEGG結(jié)果可視化分析。

1.7 人參與靶蛋白分子對接

分別以PTGS2、IL-1β、TNF-α和AKT1作為對接受體,以山萘酚作為配體,采用AUTODOCKTOOLS對接。以對接評分AFFINITY來篩選結(jié)合活性較好的靶點,結(jié)合能<-5KJ/mol,被認為具有較強的結(jié)合力。從PubChem數(shù)據(jù)庫獲取山萘酚的3D結(jié)構(gòu),從RCSB PBD數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)獲取最佳的蛋白結(jié)構(gòu)。利用Pymol軟件移除溶劑分子與配體,使用AutoDock TOOLs 1.5.7軟件進行分子對接,最后使用Pymol軟件繪制靶點蛋白受體和山萘酚之間的結(jié)合模式圖。

2 結(jié) 果

2.1 人參有效成分篩選

TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選到22種人參的有效成分,按照度值(Degree)由大到小排列的化合物依次為山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)和人參皂苷(Rhginsenoside rh2)等,見表1。Degree值越高說明成分越重要。

表1 人參中的有效成分

2.2 人參有效成分的靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到人參的有效成分有22種,對應(yīng)的靶點有112個,接著利用Uniprot數(shù)據(jù)庫為篩選得到的靶點進行基因名匹配。

2.3 人參-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建藥物有效成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖,如圖1所示,可見人參的22種有效化合物,對應(yīng)112個靶點,其中黃色的點代表人參,粉色的點代表人參的22種有效化合物,綠色的點代表化合物對應(yīng)的112個靶點,粉色圖形越大,代表Degree值越大,可以看出排名靠前的有效成分有山奈酚和β-谷甾醇,說明這2種化合物與靶點的關(guān)聯(lián)比較高。

圖1 人參-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 人參與DN的交集靶點

以“Diabetic nephropathy”為關(guān)鍵詞,通過Genecards和OMIM兩個數(shù)據(jù)庫收集DN相關(guān)的基因,其中,在Genecards數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果中,保留RelevanceScore值大于中位數(shù)的靶基因。最后將從Genecards和OMIM數(shù)據(jù)庫得到的數(shù)據(jù)合并,刪除重復(fù)的結(jié)果,將篩選得到的1832個DN的疾病靶點和112個人參靶點同時輸入venny 2.1軟件,得到人參與DN靶點的63個交集靶點(圖2)。

圖2 人參與DN交集靶點

2.5 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)和核心靶點

將人參與DN的63個交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),結(jié)果顯示,PPI網(wǎng)絡(luò)包含了63個節(jié)點、409條邊,平均節(jié)點為13,63個節(jié)點代表人參作用于DN的63個靶點,409條邊代表63個靶點蛋白之間存在409條關(guān)聯(lián)信息,平均節(jié)點13代表有效成分靶點-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)中的每個節(jié)點平均相連13條邊(圖3A)。將在STRING數(shù)據(jù)庫得到的PPI網(wǎng)絡(luò)圖的“TSV”格式上傳到y(tǒng)toscape-v3.8.2軟件,并應(yīng)用CytoNCA插件計算各個節(jié)點BC、CC、DC和EC值,最后得到8個核心靶點,分別是AKT1、TNF、PTGS2、IL-1β、PPARG、CASP3、NOS3和NFKBIA(圖3B)。

圖3 人參與DN交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO生物功能富集分析

將人參和DN的63個交集靶點輸入DAVID平臺進行GO生物功能富集分析,結(jié)果顯示了377個BP條目,42個CC條目,62個MF條目,將所得的數(shù)據(jù)以P<0.05的條件進行篩選并將結(jié)果按照由小到大進行排序,選取P值靠前的10個條目進行圖形展示。結(jié)果顯示,BP富集結(jié)果主要集中在對脂多糖反應(yīng)、脂多糖介導(dǎo)的信號通路、缺氧反應(yīng)等;CC富集結(jié)果主要集中在細胞外空間、細胞外區(qū)域等;MF富集結(jié)果主要集中在RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子的活性、配體激活的序列特異性DNA結(jié)合等(圖4)。

圖4 人參對DN治療靶點的GO富集分析

2.7 KEGG通路富集分析

將人參和DN的交集靶點輸入DAVID平臺進行KEGG分析,得到135條通路,按照P值從小到大排列,選取排名前20的通路進行圖形展示,如圖可見KEGG通路主要富集在脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、弓形蟲、糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路和癌癥通路等(圖5)。

圖5 人參對DN治療靶點的KEGG富集分析

2.8 分子對接

將人參治療DN的核心成分山萘酚和核心靶點PTGS2、IL-1β、TNF-α和AKT1分別進行分子對接,根據(jù)閾值大小得到4個結(jié)果,設(shè)定結(jié)合能≤-5 KJ/mol為條件來篩選結(jié)合活性較好的靶點。結(jié)果顯示,山萘酚與PTGS2、IL-1β、TNF-α和AKT1的結(jié)合能分別為7.31KJ/mol、7.38KJ/mol、6.13KJ/mol和6.43KJ/mol(圖6)。因此,山萘酚與核心靶點PTGS2、IL-1β、TNF-α和AKT1均具有較好的結(jié)合活性。

A.為山萘酚與PTGS2分子對接圖;B.為山萘酚與IL-1β分子對接圖;C.為山萘酚與TNF-α分子對接圖;D.為山萘酚與AKT1分子對接圖。圖6 人參治療DN的核心成分和核心靶點分子對接可視化圖

3 討 論

研究[7]發(fā)現(xiàn)人參通過調(diào)節(jié)胰島素分泌、葡萄糖攝取、抗氧化應(yīng)激和抗炎發(fā)揮抗糖尿病的作用。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析了人參治療DN的主要活性成分和可能的作用機制。

通過藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)山萘酚和β-谷甾醇是人參的核心成分。山萘酚即不僅可以抑制炎癥反應(yīng)[8],還可以抑制DN大鼠腎臟氧化應(yīng)激[9]。而β-谷甾醇可以通過下調(diào)IKKβ/NF-κB和JNK信號通發(fā)揮抗炎作用[10]。而炎癥和氧化應(yīng)激已經(jīng)被證實是DN發(fā)病的重要機制之一。因此,我們認為,山奈酚和β-谷甾醇可能是人參治療DN的核心成分。

本研究共發(fā)現(xiàn)63個蛋白與人參治療DN相關(guān)聯(lián)。進一步通過GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),這63個蛋白富集于脂質(zhì)、動脈粥樣硬化、弓形蟲和AGE-RAGE等信號通路。脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路中的主要通路包括PI3K/Akt、TNF、JNK和ERK[11]。上調(diào)PI3K/Akt通路,可以抑制STZ誘導(dǎo)的NF-κB炎癥通路的激活,從而發(fā)揮腎臟保護作用[12]。此外,下調(diào)JNK通路可以緩解高糖導(dǎo)致的線粒體損傷,從而改善腎功能[10]。由此可見,人參可以通過作用于多條信號通路和多種生物學(xué)過程發(fā)揮抗DN的作用。

通過PPI和分子對接發(fā)現(xiàn)人參治療DN的核心靶點有8個(AKT1、TNF、TNF、PTGS2、IL-1β、PPARG、CASP3、NOS3和NFKBIA),其中PTGS2、IL-1β、TNF-α、AKT1與核心成分山萘酚間具有較好的結(jié)合活性。PTGS2(又稱為COX2),在腎小球足細胞和系膜細胞以及腎小管細胞中的高表達,會加快DN的發(fā)病[13]。IL-1β和TNF-ɑ表達增加會導(dǎo)致腎小球足細胞損傷,引起血流動力學(xué)異常,導(dǎo)致腎功能受損和腎臟組織病理損傷[14]。AKT1與腎臟纖維化、腎小管損傷有關(guān)[15]。以上結(jié)果表明,人參抗DN的作用是通過多靶點發(fā)揮作用的。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接發(fā)現(xiàn)人參通過多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用發(fā)揮治療DN的作用,為后續(xù)人參治療DN的藥理學(xué)機制提供了理論依據(jù)。本研究的不足之處在于沒有進行體外和體內(nèi)實驗進行進一步的探討和驗證。