賈興，黃凱，李紅園★，耿智霞，瞿紅穎，劉靜，宋婷婷，鄧彥宏

（1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，河北石家莊 050041；2.河北省獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心，河北石家莊 050041；3.石家莊市獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心，河北石家莊 050041；4.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130000）

1 引言

近年來， 喹諾酮藥物長(zhǎng)期使用導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生耐藥性[1-3]。 馬波沙星是動(dòng)物專用的氟喹諾酮類抗菌藥，在歐盟、新西蘭等國家應(yīng)用廣泛，用于治療豬乳房炎-子宮炎-無乳綜合征（MMA）以及牛的呼吸道感染和由大腸桿菌引起的乳腺炎[4]。馬波沙星在體內(nèi)吸收迅速，分布廣泛，生物利用度高，具有抗菌譜廣、活性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及支原體都具有很強(qiáng)的抗菌活性[5]。 國內(nèi)批準(zhǔn)的馬波沙星注射液可用于豬的臨床疾病的治療，僅有法國詩華進(jìn)口注冊(cè)的馬波沙星注射液課用于靶動(dòng)物牛。 本試驗(yàn)建立了一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定馬波沙星的檢測(cè)方法，可用于牛組織中馬波沙星殘留量的檢測(cè)。

2 材料與方法

2.1 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（島津，LCMS-8045）；電子天平（賽多利斯，QUINTIX125D-1CN）；高速組織均質(zhì)機(jī) （安徽博進(jìn)化工機(jī)械有限公司，BRS500）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，H1850R）；旋渦混合器（其林貝爾，XW-80A）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮，RE-52AA）。

2.2 藥品與試劑

馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（批號(hào)H0801511，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher 公司）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher 公司）；甲酸（色譜純，Merck）；水（GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.3 試液配制

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 取馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)品10毫克，精密稱定，用乙腈溶解并定容于50 毫升棕色容量瓶中，置冰箱中避光保存。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液 精密量取馬波沙星儲(chǔ)備溶液5 毫升于100 毫升棕色容量瓶中， 用乙腈溶液溶解并定容至刻度，置冰箱中避光保存。

2.3.3 樣品溶解液 乙腈溶液+0.1%甲酸的水溶液。

2.3.4 空白樣品基質(zhì)溶液 采用不含待測(cè)組分的空白樣品制備。

2.4 方法

2.4.1 樣品前處理

取組織樣品約20 克，完全切碎后經(jīng)高速均質(zhì)機(jī)搗碎，用四分法縮分出適量試樣，稱取2 克試樣（冷凍試樣應(yīng)解凍至室溫），加乙腈-10%三氯乙酸溶液10 毫升，10000 轉(zhuǎn)/分鐘勻漿3 分鐘， 用樣品提取液5 毫升洗刀頭和勻漿杯，合并樣液，漩渦30 秒，4℃條件下10000 轉(zhuǎn)/分離心6 分鐘，上清液用10 毫升水稀釋備用。

SPE 柱經(jīng)甲醇3 毫升活化， 水3 毫升平衡。將備用液過柱，樣液過柱速度約為1 毫升/分鐘。經(jīng)10%甲醇3 毫升淋洗，負(fù)壓抽干，甲醇3 毫升洗脫，抽干。洗脫液于60℃氮?dú)饬鞔蹈?，?.0 毫升乙腈-0.1%甲酸水溶液溶解殘?jiān)?混勻，4℃條件下12000 轉(zhuǎn)/分離心6 分鐘， 取適量溶液經(jīng)0.22 微米濾膜過濾至樣品瓶中，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2.4.2 液相色譜條件

色譜柱為C18（125×2.0 毫米，3.0 微米）；流動(dòng)相：0.1%甲酸/乙腈溶液+0.1%甲酸/水溶液，梯度洗脫（梯度洗脫時(shí)間表見表1）； 流速：0.3 毫升/分；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 微升。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

2.4.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描； 檢測(cè)方式： 多反應(yīng)監(jiān)測(cè) （MRM）；DL 溫度：350℃； 檢測(cè)器電壓：2.0 千伏； 加熱器流量：600升/小時(shí)；霧化氣流量：500 升/小時(shí)；干燥氣流量：500 升/小時(shí)；MRM 參數(shù)（見表2）。

表2 MRM 參數(shù)列表

2.5 方法確證

2.5.1 特異性

分析不同來源空白牛組織（牛肌肉、肝臟、腎臟、脂肪）樣品（n=20），觀察在藥峰出現(xiàn)的區(qū)域是否有干擾信號(hào)。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別設(shè)置6 個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，依次為5、10、20、50、100 和200 納克/毫升，依據(jù)設(shè)定濃度加入標(biāo)準(zhǔn)品，將所得峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與相關(guān)系數(shù)。

2.5.3 方法的準(zhǔn)確度與精密度

通過添加回收試驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度與精密度，分別用回收率和變異系數(shù)表示準(zhǔn)確度和精密度。 選擇以10、50、100 納克/毫升進(jìn)行添加回收。每批3 個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度5 個(gè)平行樣品，重復(fù)3 批，分別計(jì)算回收率、批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 特異性

在上述色譜工作條件下， 分析不同來源的空白牛肌肉、肝臟、腎臟、脂肪組織樣品，目標(biāo)化合物的保留時(shí)間附近沒有雜質(zhì)干擾，馬波沙星的色譜峰保留時(shí)間為4.0 分鐘左右。

3.2 重復(fù)性

選擇10 納克/毫升濃度做重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，每個(gè)組織樣品重復(fù)測(cè)6 次。 得到牛肌肉組織中馬波沙星含量測(cè)定重復(fù)性保留時(shí)間RSD 值為1.265%，峰面積的RSD 值為2.290%；牛肝臟組織中馬波沙星含量測(cè)定重復(fù)性保留時(shí)間RSD 值為0.264%，峰面積的RSD 值為0.806%；牛腎臟組織中馬波沙星含量測(cè)定重復(fù)性保留時(shí)間RSD值為0.138%，峰面積的RSD 值為0.658%；牛脂肪組織中馬波沙星含量測(cè)定重復(fù)性保留時(shí)間RSD 值為0.117%，峰面積的RSD 值為2.279%。均小于5%。 系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

3.3 測(cè)定低限

測(cè)得牛奶中馬波沙星的測(cè)定低限為10.0 微克/千克。

3.4 線性范圍

在10～200 納克/毫升的濃度范圍內(nèi)，方法的線性關(guān)系良好，牛肌肉組織、肝臟組織、腎臟組織、 脂肪組織基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù) （R）≥0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如表3 所示。

表3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)

3.5 準(zhǔn)確度和精密度

馬波沙星的添加回收率和精密度見表4 和表5。 從表4、表5 中可得出，牛肌肉組織中在10、50、100 納克/毫升濃度的回收率在77.1%～101.4%；批內(nèi)變異系數(shù)均小于2.16%，批間變異系數(shù)均小于9.77%；牛肝臟組織中在10、50、100納克/毫升濃度的回收率在81.2%～100.3%；批內(nèi)變異系數(shù)均小于2.01%， 批間變異系數(shù)均小于2.29%；牛腎臟組織中在10、50、100 納克/毫升濃度的回收率在83.8%～97.0%；批內(nèi)變異系數(shù)均小于1.41%，批間變異系數(shù)均小于3.80%；牛脂肪組織中在10、50、100 納克/毫升濃度的回收率在80.3%～107.6%；批內(nèi)變異系數(shù)均小于5.63%，批間變異系數(shù)均小于11.53%。

表4 不同批次牛肌肉、肝臟組織樣品中添加馬波沙星的回收率和變異系數(shù)

表5 不同批次牛腎臟、脂肪組織樣品中添加馬波沙星的回收率和變異系數(shù)

4 討論

近年來，隨著氟喹諾酮類藥物的普遍使用，其殘留檢測(cè)技術(shù)已被國內(nèi)外廣泛研究，目前的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法、 液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫法等[6]。 本實(shí)驗(yàn)建立了牛肌肉、肝臟、腎臟、脂肪組織中馬波沙星殘留液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，方法專屬性良好，空白基質(zhì)中目標(biāo)化合物的保留時(shí)間附近沒有雜質(zhì)干擾。 方法在牛肌肉、肝臟、腎臟、脂肪組織中的測(cè)定低限可設(shè)定為10.0 微克/千克；基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為10～200 納克/毫升， 相關(guān)系數(shù)＞0.998；在牛的肌肉、肝臟、腎臟及脂肪組織樣品中， 馬波沙星在10、50、100 納克/毫升濃度的平均回收率在70%～120%， 批內(nèi)變異系數(shù)CV≤10% ， 批間變異系數(shù) CV ≤15%。 結(jié)果表明該方法的重復(fù)性、 靈敏度、線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度能夠滿足殘留檢測(cè)要求。

5 結(jié)論

本研究針對(duì)新獸藥馬波沙星注射液應(yīng)用后在牛組織中的殘量檢測(cè)，建立了高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法。 該方法可用于檢測(cè)牛肌肉、 肝臟、腎臟及脂肪等多種組織中馬波沙星藥物的殘留量，并且經(jīng)試驗(yàn)研究驗(yàn)證，該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度與精密度均良好。

（支持項(xiàng)目： 河北省省級(jí)科技計(jì)劃資助（21322601D））