任 穎，楊小耿，孫美媛，張慧珠1,，蘭道亮，李 鍵，何翃閎*

（1.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)試驗(yàn)室，四川 成都 610041；3.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

近年來，隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)circRNA存在于哺乳動(dòng)物的胎盤和胚胎中[1]，甚至在某些物種的卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞中廣泛存在。迄今為止，人們已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種不同的circRNA[2-3]，其對(duì)哺乳動(dòng)物生殖發(fā)育過程的調(diào)控作用也有所不同。哺乳動(dòng)物的卵泡發(fā)育是一個(gè)高度復(fù)雜且受到多方面因素調(diào)控的精密過程[4]，在整個(gè)生理過程中，卵泡的發(fā)育會(huì)受到環(huán)境中各類因素的影響。大量研究發(fā)現(xiàn)，circRNA、miRNA和mRNA三者在卵泡和早期胚胎發(fā)育過程中存在串?dāng)_關(guān)系。circRNA作為一種非編碼RNA，可以充當(dāng)ceRNA，構(gòu)成circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)（ceRNA網(wǎng)絡(luò)），并通過該網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮其調(diào)控作用[5-6]，從而介導(dǎo)卵泡成熟過程中的相關(guān)信息通路以及參與調(diào)控早期胚胎的發(fā)育。因此，ceRNA網(wǎng)絡(luò)在哺乳動(dòng)物繁殖領(lǐng)域發(fā)揮著更為重要的作用[7]。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于circRNA的研究主要集中于其在不同組織中的表達(dá)規(guī)律以及在疾病發(fā)展過程中發(fā)揮的重要調(diào)控作用等方面，缺乏對(duì)ceRNA網(wǎng)絡(luò)在哺乳動(dòng)物繁殖領(lǐng)域潛在功能的深入探索[8]。本文主要梳理ceRNA網(wǎng)絡(luò)在哺乳動(dòng)物卵泡和早期胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的作用，為進(jìn)一步研究ceRNA網(wǎng)絡(luò)在哺乳動(dòng)物繁殖方面的潛在功能尋找新方向。

1 ceRNA網(wǎng)絡(luò)概述

1.1 circRNA

circRNA是一類特殊的非編碼RNA，由反向剪切產(chǎn)生，不存在5'和3'端，呈現(xiàn)封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶的影響，表達(dá)穩(wěn)定，不易降解[9]。大部分circRNAs主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，由外顯子環(huán)化形成；少部分circRNAs主要存在于細(xì)胞核中，由內(nèi)含子環(huán)化或者外顯子和內(nèi)含子共同環(huán)化形成。circRNA上含豐富的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用，可以與miRNA結(jié)合，進(jìn)而解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用。部分miRNA與某些生理過程相關(guān)，circRNA通過與miRNA之間的相互聯(lián)系在這些生理過程中起到重要作用[10]，但是如果考慮circRNA靶點(diǎn)數(shù)量問題，也有研究表明circRNA大多數(shù)很可能不是標(biāo)準(zhǔn)的miRNA海綿，其會(huì)在一個(gè)更大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，這也為ceRNA網(wǎng)絡(luò)的深入調(diào)查提供了背景。

1.2 miRNA

m i R N A 是研究最多的一類非編碼R N A 分子，它是參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的小ssRNA分子（18～23 nt）[11]。miRNA的生物發(fā)生是從初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄開始，由Drosha酶和Dicer酶加工為成熟的miRNA后，再被整合到RISC復(fù)合體中，與某些mRNA的3’UTR區(qū)域進(jìn)行結(jié)合，最終導(dǎo)致mRNA降解或翻譯受阻[12]。此外，一個(gè)miRNA可以靶向多個(gè)mRNA，一個(gè)mRNA可能包含多個(gè)miRNA的靶位點(diǎn)，這導(dǎo)致mRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)可能在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控和細(xì)胞生理學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，也為發(fā)現(xiàn)ceRNA網(wǎng)絡(luò)的其他功能奠定了基礎(chǔ)。

1.3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)串?dāng)_機(jī)制

ceRNA是一類獨(dú)特非編碼RNA，能夠與mRNA競爭以結(jié)合相同的miRNA[13]，構(gòu)成ceRNA網(wǎng)絡(luò)，其揭示了RNA間相互調(diào)控的新機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，ceRNA網(wǎng)絡(luò)在多種生理過程中廣泛存在，如ceRNA有長鏈非編碼RNA、circRNA、假基因、人工合成miRNA抑制劑及病毒miRNA抑制劑等。當(dāng)circRNA充當(dāng)ceRNA與mRNA競爭結(jié)合miRNA時(shí)，三者之間相互作用成為ceRNA串?dāng)_，但是一個(gè)miRNA可串?dāng)_多個(gè)不同circRNA和mRNAs，所以一個(gè)miRNA參與多個(gè)不同串?dāng)_，而由同一個(gè)miRNA介導(dǎo)的串?dāng)_，形成一個(gè)ceRNA網(wǎng)絡(luò)[14]。

2 ceRNA網(wǎng)絡(luò)在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育過程中的作用

2.1 circRNA調(diào)控生殖激素的合成

下丘腦和垂體是調(diào)節(jié)生殖相關(guān)激素分泌的關(guān)鍵內(nèi)分泌器官[15]。哺乳動(dòng)物下丘腦在一定條件下會(huì)釋放促性腺激素釋放激素，作用于腺垂體，使得垂體釋放出2種促性腺激素（促卵泡激素和促黃體激素，F(xiàn)SH和LH）進(jìn)入血液循環(huán)，促進(jìn)性腺中配子體結(jié)合和類固醇發(fā)生。有研究通過KEGG通路的分析表明，在高產(chǎn)量和低產(chǎn)量黑山羊卵泡期多種非編碼RNA（ncRNA）表達(dá)功能的比較中，發(fā)現(xiàn)circRNAs參與了與垂體功能直接相關(guān)的信號(hào)通路[16]，包括TGF-β信號(hào)通路[17]、MAPK信號(hào)通路[18]和FOXO信號(hào)通路[19]，其中MAPK8、MAPK1、BRAF和MAD1L1在孕激素介導(dǎo)的山羊垂體卵母細(xì)胞成熟過程中富集[20]，MAPK8、ADCY9、SRC、PLCB1和SOS2在GnRH信號(hào)通路中富集；在高產(chǎn)量和低產(chǎn)量黑山羊黃體期ncRNA表達(dá)功能的比較中，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)circRNA（Differential expression circRNA，DEcircRNA）主要參與GnRH信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路和催乳素信號(hào)通路，其中GNAO1、ADCY9、SRC、PLCB1和SOS2在雌激素信號(hào)通路中富集。由此可知，circRNA主要富集于促性腺激素釋放激素信號(hào)通路，通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控相關(guān)生殖激素的合成，這些激素的產(chǎn)生對(duì)于介導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟以及哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育具有重要作用。

2.2 ceRNA網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物卵泡成熟與閉鎖

大量研究結(jié)果表明，circRNA參與山羊、豬、鼠等哺乳動(dòng)物的卵泡發(fā)育過程[21-23]。chi_circ_0031209和chi_circ_0019448可以在黃體期通過影響高產(chǎn)和低產(chǎn)山羊泌乳素受體的表達(dá)而在繁殖中發(fā)揮重要作用；chi_circ_0014542則在卵泡期參與調(diào)控WNT5A的表達(dá)[16]，進(jìn)而調(diào)控哺乳動(dòng)物的卵泡發(fā)育。此外，有研究通過深度測序和生物信息學(xué)分析，分別在哺乳動(dòng)物卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞中鑒定了7 067個(gè)和637個(gè)circRNA。其中，DE circRNA的宿主基因顯著富集于與卵丘細(xì)胞功能和卵母細(xì)胞成熟相關(guān)的多種信號(hào)通路，分析表明circRNA的一個(gè)派系在特定的發(fā)育階段以特殊的方式進(jìn)行發(fā)育，并通過這種形式差異表達(dá)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了這一派系中母源表達(dá)的circARMC4，并認(rèn)為其是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟和發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子[20]，這一派系中結(jié)構(gòu)相似的其他circRNA的功能值得探索。有學(xué)者將101個(gè)miRNAs與哺乳動(dòng)物卵泡閉鎖和顆粒細(xì)胞凋亡的功能性miRNAs進(jìn)行比較，確定了16個(gè)功能性miRNAs，驗(yàn)證了卵泡閉鎖過程中存在miRNA-circRNA的相互關(guān)系，并且在其中發(fā)揮作用[24]。由此可知，ceRNA網(wǎng)絡(luò)參與卵泡閉鎖相關(guān)過程。還有研究結(jié)果表明circRNA在豬卵巢卵泡中廣泛存在，其主要參與豬卵泡的發(fā)育過程，并在卵泡閉鎖過程中具有調(diào)控作用，讓circINHA作為ceRNA競爭性結(jié)合miR-10a-5p用來上調(diào)CTGF表達(dá)以調(diào)控豬顆粒細(xì)胞的凋亡[25]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)宿主基因主要參與激素分泌、顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡發(fā)育[26]，而circRNA作為lncRNA的一種，其是否有相同的作用還有待研究。上述研究結(jié)果也提示哺乳動(dòng)物卵巢卵泡閉鎖過程中存在ceRNA網(wǎng)絡(luò)的潛在調(diào)控。

3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育中的作用

附植前胚胎的發(fā)育是生殖過程的重要環(huán)節(jié)之一，哺乳動(dòng)物早期發(fā)育過程伴隨著細(xì)胞的增殖、遷移以及細(xì)胞命運(yùn)的層級(jí)特化，在整個(gè)發(fā)育過程中受到母體內(nèi)多方面因素的影響[27]。其中，circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)對(duì)早期胚胎發(fā)育過程的影響已經(jīng)逐漸吸引研究者的目光[28]。

有研究通過高通量測序系統(tǒng)分析SSC和FGSC的circRNA和lncRNA表達(dá)譜，比較兩性生殖干細(xì)胞中circRNA和lncRNA表達(dá)的共同點(diǎn)和不同點(diǎn)，通過差異分析，得到性別特異性表達(dá)的921個(gè)circRNA和2 331個(gè)lncRNA。對(duì)這些性別特異性表達(dá)的circRNA和lncRNA靶基因或hosting基因的GO和Pathway分析，揭示了circRNA和lncRNA通過調(diào)控激素分泌和基因印記維持生殖干細(xì)胞向不同類型配子發(fā)育的潛能[29]，進(jìn)而提高兩性配子結(jié)合成功率，為早期胚胎形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。也有研究對(duì)奶山羊發(fā)情期和發(fā)情間期卵巢組織中circRNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測和分析，結(jié)果表明奶山羊卵巢組織中circRNA的表達(dá)水平因奶山羊發(fā)情的不同生理階段而不同，circRNAs可通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)影響卵巢發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致卵巢中卵泡發(fā)育和早期胚胎發(fā)育過程發(fā)生變化[30-31]，可為研究哺乳動(dòng)物繁殖領(lǐng)域早期胚胎的發(fā)育奠定基礎(chǔ)。綜上所述，鑒于circRNA的保守性及其不同種類的功能仍在研究中，可以假設(shè)其他哺乳動(dòng)物繁殖過程中也廣泛存在類似的circRNA，并且可以通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及多基因?qū)Ρ鹊确绞嚼^續(xù)探索circRNA在哺乳動(dòng)物生殖領(lǐng)域的潛在功能。

4 展望

隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，circRNA逐漸由無用的剪切廢料變成了相關(guān)研究的主要內(nèi)容。越來越多ceRNA網(wǎng)絡(luò)的發(fā)現(xiàn)使得哺乳動(dòng)物生殖領(lǐng)域被不斷探索并見證。除了已發(fā)現(xiàn)的作用機(jī)制外，是否存在其他調(diào)控機(jī)制也尚未可知，現(xiàn)如今對(duì)于circRNA的研究大多局限于轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面，在未來如果可以多角度進(jìn)行多組學(xué)整合研究，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)其他非常有價(jià)值的circRNA調(diào)控機(jī)制，circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)也會(huì)成為探索circRNA在生殖細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用的重要手段，為哺乳動(dòng)物繁殖方面的研究打開新視角。