秦中維, 林欣琪, 魏茜雅, 梁臘梅, 李映志

(廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院, 廣東 湛江 524088 )

土壤鹽漬化是阻礙農(nóng)作物生產(chǎn)力提高的主要非生物脅迫因素之一,可影響種子的順利萌發(fā)和幼苗的健康生長(Yan et al., 2022)。鹽脅迫易使細(xì)胞中有毒離子(Na+和Cl-)過量積累,抑制水分吸收(Yang et al., 2020),同時(shí)會導(dǎo)致大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生,如過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)和超氧陰離子(superoxide anion, O2-)(Yin et al.,2021),使細(xì)胞膜遭受氧化毒害,導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng),不僅影響辣椒(Capsicumannuum)、駝蹄瓣屬(Zygophyllum)、蔓菁(Brassicarapa)等植物種子的萌發(fā) (Gammoudi et al.,2022; Hussain et al., 2022; Zhou et al., 2022),還影響辣椒、牛角瓜(Calotropisgigantea)、小麥(Triticumaestivum)等幼苗的正常生長(Ke et al., 2018; 肖中林,2022;Nouman & Aziz, 2022),甚至降低稻(Oryzasativa)等作物的產(chǎn)量(沙漢景等,2017)。因此,探究如何提高種子在鹽脅迫下的發(fā)芽率和增強(qiáng)植株的鹽脅迫耐受能力,對解決我國土壤鹽漬化問題、保障作物的安全及社會穩(wěn)定發(fā)展具有重大意義(Raffaella et al., 2022)。

種子引發(fā)是一種新興的應(yīng)對鹽漬化脅迫的種子處理技術(shù),即在種子發(fā)芽前用天然和/或合成引發(fā)劑處理,誘導(dǎo)種子進(jìn)入特定的生理狀態(tài),可通過記憶效應(yīng)使植物通過改變關(guān)鍵信號分子、轉(zhuǎn)錄因子等來抵御生長期發(fā)生的鹽脅迫(Shang et al., 2019; Goyal et al., 2021)。多種納米材料如氧化鋅納米顆粒(zinic oxide nanoparticles, ZnONPS)、硒納米顆粒(selenium nanoparticles, SeNPs)、氧化鈰納米顆粒(cerium oxide nanoparticles, CeO2NPS)等被用于種子引發(fā)(Rawashdeh et al., 2020;Prakash et al., 2021; Sardar et al., 2022)。其中,CeO2NPS是一種新興納米材料,因具有超強(qiáng)自由基清除能力被廣泛運(yùn)用于醫(yī)療、化妝品行業(yè),近年來也被運(yùn)用于納米農(nóng)業(yè)中(Newkirk et al., 2018)。CeO2NPS通過Ce3+和Ce4+懸空鍵模擬抗氧化酶活性減少ROS的過度積累,從而緩解植物的氧化應(yīng)激反應(yīng),提高植物對逆境的耐受性。Khan等(2021)研究發(fā)現(xiàn),CeO2NPS通過種子引發(fā)處理后可提高蕓薹(Brassicarapa)種子的α-淀粉酶活性和清除過量ROS,并提高其在鹽脅迫下的發(fā)芽率,同時(shí)可在苗期通過提高鹽脅迫下蕓薹幼苗的SOD、POD活性和可溶性糖含量,進(jìn)而增強(qiáng)蕓薹的耐鹽性,最終促進(jìn)蕓薹生物量的提高。目前,有關(guān)CeO2NPS通過種子引發(fā)處理對辣椒鹽脅迫下生長發(fā)育影響方面的研究還罕有報(bào)道。辣椒,為茄科辣椒屬植物,由于其具有促進(jìn)食欲、改善消化、抗菌殺蟲等作用,深得廣大群眾的喜愛(鄒學(xué)校等,2022)。目前,我國已成為鮮辣椒產(chǎn)量最高的國家,種植面積為78萬公頃,產(chǎn)量為1 900萬噸(王立浩等,2019);其果實(shí)含有大量的生物活性化合物(如辣椒素),在食品、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景(張?zhí)炫e等,2019)。

為探究辣椒耐鹽堿栽培技術(shù)措施及其耐鹽機(jī)制,本研究以茂蔬360為試驗(yàn)材料, 通過種子引發(fā)處理和生理生化分析,旨在探明:(1)CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒種子萌發(fā)、幼苗生長的影響;(2)CeO2NPS種子引發(fā)處理提高辣椒耐鹽性的最佳濃度;(3)種子引發(fā)處理提高辣椒耐鹽性的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)于2022年3月至8月在廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院進(jìn)行。供試材料為辣椒,品種為茂蔬360。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 種子引發(fā)處理 參考Newkirk等(2018)的方法合成氧化鈰納米顆粒(CeO2NPS)溶液,并將新合成的CeO2NPS溶液保存在4 ℃,分別配置成濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1(分別用S0、S0.05、S0.1、S0.2、S0.3、S0.4、S0.5表示)的CeO2NPS溶液,其中,0 mmol· L-1CeO2NPS溶液(S0)為滲透緩沖液,由100 mmol·L-1TES和100 mmol·L-1MgCl2組成,用HCl調(diào)節(jié)pH為7.5,作為CeO2NPS溶液的陰性對照。挑選粒大飽滿、大小均一的辣椒種子約2 g置于燒杯中,分別加入10 mL不同濃度的CeO2NPS溶液,封口后置于培養(yǎng)箱中引發(fā)24 h。用蒸餾水將種子沖洗干凈,濾紙吸干后回干至初始含水量。

1.2.2 種子發(fā)芽 將未引發(fā)處理(CK)和引發(fā)處理的辣椒種子置于標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽皿(10 cm × 10 cm × 5 cm)中,加入5mL的100 mmol·L-1的NaCl溶液模擬鹽脅迫,放置在25 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn),每個(gè)處理60粒種子,重復(fù)3次。

1.2.3 幼苗生長 將CK和不同濃度CeO2NPS引發(fā)處理后的辣椒種子分別播種于混有蛭石椰糠的育苗盤中,每盤播50(5×10)粒發(fā)芽種子,并澆入濃度為100 mmol·L-1的NaCl溶液模擬鹽脅迫。于室溫下培養(yǎng)至幼苗兩葉一心取樣,進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 種子萌發(fā)指標(biāo) 以胚根突破種皮2 mm作為種子萌發(fā)過程中的發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。保持每天記錄辣椒種子的發(fā)芽數(shù),直到無種子發(fā)芽為止。參考Gammoudi等(2020)的方法計(jì)算發(fā)芽勢(germination potential,GP)、發(fā)芽率(germination rate,GR)、發(fā)芽指數(shù)(germination index,GI)、活力指數(shù)(vigor index,VI)。

發(fā)芽勢(GP)=(3 d內(nèi)發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

發(fā)芽率(GR)=(發(fā)芽結(jié)束后的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Ni/ti)。

活力指數(shù)(VI)=GP×(苗高+根長)。

式中:Ni為培養(yǎng)第一天發(fā)芽的種子數(shù);ti是從開始到第一次發(fā)芽的時(shí)間。

1.3.2 生長指標(biāo) 待辣椒幼苗長至兩葉一心時(shí),選取長勢一致的幼苗,全株采回后立即清洗擦干,用游標(biāo)卡尺測量株高、根長,先用電子天平稱量幼苗鮮重,然后將樣品置于烘箱105 ℃殺青30 min,隨后轉(zhuǎn)至80 ℃烘干至恒重,記錄干重。

1.3.3 生理指標(biāo) 將引發(fā)后的辣椒種子及長至兩葉一心的幼苗進(jìn)行取樣,并測定生理指標(biāo)。采用硫代巴比妥酸法(Velikova et al., 2000)測定丙二醛(MDA)含量(nmol·g-1),采用Schneider和Schlegel(1981)的方法測定超氧陰離子(O2-)含量(μmol·g-1),采用蒽酮比色法(張璐,2017)測定可溶性糖含量(mg·g-1)、考馬斯亮藍(lán)染色法(高俊鳳,2006))測定可溶性蛋白質(zhì)含量(mg·g-1),采用Wang等(1991)的方法測定抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)和脫氫抗壞血酸(dehydroascorbic acid,DHA)含量(nmol·g-1),采用Nakano和Asada(1981)的方法測定抗壞血酸過氧化物酶活性(ascorbate peroxidase,APX),酶活性以(U·g-1·min-1)表示,采用試劑盒法(北京索萊寶科技有限公司)測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶(peroxidase,POD)活性,酶活性以U·g-1表示,采用試劑盒法(北京索萊寶科技有限公司)測定脯氨酸含量(μg·g-1)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒種子萌發(fā)的影響

由表1可知,不同濃度CeO2NPS種子引發(fā)處理均能促進(jìn)鹽脅迫下的辣椒種子萌發(fā), S0.5處理組種子的發(fā)芽率最高,比未引發(fā)處理組的種子提高了34.59%,并且發(fā)芽勢為未引發(fā)處理組的12倍。不同數(shù)據(jù)顯示,CeO2NPS啟動顯著提高發(fā)芽指數(shù)。在鹽脅迫下,所有的引物濃度似乎都能改善發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù),S0.5處理組的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均達(dá)到最高水平(與未引發(fā)處理組組相比分別提高了399.57和7.84)。

表1 CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of CeO2NPS seed priming on pepper seed germination under salt stress

2.2 CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒幼苗生長的影響

由表2可知,適宜濃度CeO2NPS引發(fā)處理能促進(jìn)鹽脅迫下的辣椒幼苗的生長。S0.4處理組的幼苗的鮮重、干重和根長均顯著高于未引發(fā)處理組,分別提高了35.75%、135.33%、35.48%,但株高顯著低于未引發(fā)處理組,說明種子引發(fā)處理能夠顯著促進(jìn)幼苗根系的生長。

表2 CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒幼苗生長的影響Table 2 Effects of CeO2NPS seed priming on growth of pepper seedlings under salt stress

2.3 CeO2NPS種子引發(fā)處理后的辣椒種子生理生化變化

2.3.1 CeO2NPS種子引發(fā)處理后對辣椒種子氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 由圖1可知,S0.5處理組種子的超氧陰離子含量顯著低于未引發(fā)處理組,降低了68.54%,但種子的丙二醛含量提高了21.74%,與未引發(fā)處理組相比差異不顯著。

不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P<0.05). The same below.圖1 CeO2NPS種子引發(fā)處理對辣椒種子超氧陰離子和丙二醛含量的影響Fig. 1 Effects of CeO2NPS seed priming on superoxide anion and MDA contents of pepper seeds

由表3可知,S0.5處理組的種子的CAT活性顯著高于未引發(fā)處理組,提高了54.06%,但種子POD、APX活性顯著低于未引發(fā)處理組,分別降低了44.56%、59.98%;S0.5處理組的種子的AsA含量高于未引發(fā)處理組,提高了8.89%,同時(shí),S0.5處理組種子的AsA/DHA比值與未引發(fā)處理組相比顯著提高了78.81%。

表3 CeO2NPS種子引發(fā)處理對辣椒種子抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)含量的影響Table 3 Effects of CeO2NPS seed priming on antioxidant enzyme activities and antioxidant contents of pepper seeds

2.3.2 CeO2NPS種子引發(fā)處理后對辣椒種子可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、可溶性糖含量的影響 由表4可知,S0.5處理組種子的可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸含量顯著高于未引發(fā)處理組,分別提高了119.62%和114.50%,但種子的可溶性糖含量與未引發(fā)處理組相比無顯著差異。

表4 CeO2NPS種子引發(fā)處理對辣椒種子可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、可溶性糖含量的影響Table 4 Effects of CeO2NPS seed priming on soluble protein, proline and soluble sugar contents of pepper seeds

2.4 CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒幼苗生理生化特征的影響

2.4.1 CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒幼苗可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、可溶性糖含量的影響 由表5可知,S0.4處理組幼苗的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于未引發(fā)處理組,提高了20.51%,但幼苗的脯氨酸和可溶性糖含量均顯著低于未引發(fā)處理組,分別降低了75.02%和41.16%。

表5 CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒幼苗可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、可溶性糖含量的影響Table 5 Effects of CeO2NPS seed priming on soluble protein, proline and soluble sugar contents of pepper seedlings under salt stress

2.4.2 CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒幼苗氧化應(yīng)激的影響 由表6可知,S0.4處理組幼苗的CAT、POD、APX、SOD活性均顯著低于未引發(fā)處理組, 分別降低了84.92%、 13.58%、 41.33%、61.79%;S0.4處理組幼苗的丙二醛含量低于未引發(fā)處理組,降低了20.38%。

表6 CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒幼苗抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響Table 6 Effects of CeO2NPS seed priming on antioxidant enzyme activities and MDA contents of pepper seedlings under salt stress

由圖2可知,S0.4處理組幼苗的AsA含量和AsA/DHA比值均顯著高于未引發(fā)處理組,分別提高了111.04%和273.77%。

圖2 CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒幼苗AsA含量及AsA/DHA比值的影響Fig. 2 Effects of CeO2NPS seed priming on AsA content and AsA/DHA ratio of pepper seedlings under salt stress

3 討論

3.1 CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒種子萌發(fā)的影響

鹽脅迫通過滲透脅迫使植物細(xì)胞體內(nèi)離子平衡和氧化還原平衡失調(diào),從而產(chǎn)生過量活性氧(reactive oxygen species, ROS),導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化,進(jìn)而使細(xì)胞膜受到損害,最終使種子萌發(fā)受到抑制(Zhang et al., 2022)。因此,選擇具有清除ROS能力的試劑來進(jìn)行種子引發(fā)處理是目前較為新興的研究方向之一。研究表明,氧化鈰納米顆粒(CeO2NPS)可以通過清除ROS、提高植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)等方式促進(jìn)種子在非生物脅迫下的順利萌發(fā)(Lizzi et al., 2020)。

本研究表明,S0.5處理組的辣椒種子引發(fā)效果相對較好,提高了鹽脅迫下辣椒種子的萌發(fā)速度,進(jìn)而促進(jìn)了種子的萌發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn),S0處理組辣椒種子的發(fā)芽率也遠(yuǎn)高于未引發(fā)處理組, 可能與S0處理組中的MgCl2溶質(zhì)曾被作為無機(jī)的種子引發(fā)劑促進(jìn)甜菜種子的萌發(fā)有關(guān)(劉曉晗等,2021)。

S0.5處理組種子的丙二醛含量稍高于未引發(fā)處理組,表明CeO2NPS種子引發(fā)處理可能對種子的氧化應(yīng)激平衡造成了一定程度的影響,這可能是由于納米毒性引起。但是,S0.5處理組的種子超氧陰離子含量顯著低于未引發(fā)處理組,并且脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)、CAT活性、抗壞血酸(AsA)含量及AsA/DHA比值顯著高于未引發(fā)處理組,說明CeO2NPS辣椒種子引發(fā)處理影響了種子的生理生化活動。脯氨酸的積累有助于穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)的滲透平衡、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷和保護(hù)脅迫相關(guān)蛋白的合成(Gui et al., 2015; Noor et al., 2022),進(jìn)一步提高如CAT的活性,與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)協(xié)同清除過量的活性氧含量,維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài),最終減緩鹽脅迫對辣椒種子萌發(fā)過程中所造成的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度,進(jìn)而維持種子細(xì)胞膜的完整,使種子能夠順利發(fā)芽,并且其最終發(fā)芽率顯著高于未引發(fā)處理組,表明CeO2NPS種子引發(fā)處理對辣椒種子萌發(fā)的促進(jìn)作用起主導(dǎo)作用,同時(shí)也可以證明辣椒種子具有適應(yīng)CeO2NPS毒性的保護(hù)機(jī)制。這與Khan等(2021)采用0.1 mmol· L-1CeO2NPS引發(fā)處理提高蕓薹種子鹽脅迫下發(fā)芽率的研究結(jié)果相似,表明CeO2NPS種子引發(fā)處理對促進(jìn)種子非生物脅迫下的萌發(fā)具有一定的積極作用,但不同植物的最適濃度不一定相同。

3.2 CeO2NPS種子引發(fā)處理對鹽脅迫下辣椒幼苗生長及生理的影響

鹽脅迫通過影響抗氧化系統(tǒng)的建立、抑制蛋白質(zhì)合成等方式抑制植物的生長發(fā)育(Rossi et al., 2016; Hassanpouraghdam et al., 2022)。CeO2NPS已被證明可促進(jìn)植物的生長發(fā)育(Khan et al., 2021)。

本研究表明,S0.4處理組的種子在鹽脅迫下長成的幼苗的鮮重、干重及根系長度均達(dá)到了最大值,顯著高于未引發(fā)處理組,說明適宜濃度CeO2NPS種子引發(fā)處理可促進(jìn)鹽脅迫下辣椒幼苗的生長。這與 Khan等(2021)用0.1 mmol·L-1CeO2NPS種子引發(fā)處理蕓薹種子后,可促進(jìn)鹽脅迫下蕓薹幼苗的生長發(fā)育的研究結(jié)果相似。同時(shí),S0.4處理組在鹽脅迫下長成的辣椒幼苗的鮮重、干重及根長均顯著高于S0處理組,說明CeO2NPS種子引發(fā)處理對幼苗生長發(fā)育的影響作用要優(yōu)于MgCl2。

鹽脅迫對細(xì)胞氧化應(yīng)激的損傷程度可以通過MDA的產(chǎn)生和積累來識別(Deinlein et al., 2014)。本研究中,S0.4處理組的幼苗在鹽脅迫下的丙二醛含量降低,表明CeO2NPS種子引發(fā)處理對減輕辣椒幼苗在鹽脅迫下的脂質(zhì)過氧化程度有一定的積極作用。同時(shí),幼苗的CAT、SOD活性均降低,可能與CeO2NPS因顆粒表面存在+3/+4氧化還原態(tài)比率而使其具有獨(dú)特的類抗氧化酶(CAT、SOD)活性有關(guān)(Zhao et al., 2012)。

AsA可作為非酶類抗氧化物直接清除ROS,也可與還原型谷胱甘肽(GSH)一起參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(AsA-GSH循環(huán))(Rong et al., 2022)。AsA/DHA比值可反映AsA-GSH循環(huán)效率從而用于評價(jià)抗氧化能力和衡量植物的抗逆能力(Gao et al., 2022)。本研究表明,S0.4處理組的幼苗在鹽脅迫下的AsA含量及AsA/DHA比值顯著提高,說明CeO2NPS種子引發(fā)處理可通過促進(jìn)幼苗葉片的AsA-GSH循環(huán)來維持鹽脅迫下幼苗的氧化應(yīng)激平衡,這與Gohari等(2021)在75 mmol·L-1NaCl溶液模擬鹽脅迫下,對葡萄(Vitisvinifera)葉片進(jìn)行葉面噴施CeO2NPS后,可通過促進(jìn)葡萄葉片的抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán),從而降低葉片ROS含量來緩解鹽脅迫下葡萄葉片的氧化應(yīng)激反應(yīng)的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

(1)不同濃度CeO2NPS均可促進(jìn)辣椒種子在鹽脅迫下的萌發(fā),以0.5 mmol·L-1的濃度最佳。

(2)適宜濃度 CeO2NPS種子引發(fā)處理后可促進(jìn)幼苗根系生長和生物量的提高,以0.4 mmol· L-1的濃度最佳。

(3)CeO2NPS種子引發(fā)處理后,可通過激發(fā)萌發(fā)有關(guān)酶活性、增加代謝產(chǎn)物等方式提高種子的發(fā)芽率,還可通過記憶效應(yīng),提高抗氧化物含量、促進(jìn)ASA-GSH循環(huán)從而降低脂質(zhì)過氧化、緩解氧化應(yīng)激來提高幼苗的耐鹽性。CeO2NPS可作為一種納米引發(fā)劑促進(jìn)植物在鹽脅迫下的生長發(fā)育。