胡伍清,畢慧玲,苗聰秀

(長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院生殖遺傳科,山西省衛(wèi)生健康委員會生殖工程重點實驗室,長治 046000)

1 卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)

1.1 POF病因學 卵巢功能下降包括卵巢儲備功能減退、早發(fā)性卵巢功能不全及POF三個不同階段,這是一個逐漸進展的過程。POF是早發(fā)性卵巢功能不全的終末階段,其臨床表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、經(jīng)量減少甚至閉經(jīng)、雌激素水平下降、FSH升高、不孕不育等。POF病因可能包括遺傳因素和醫(yī)源性因素,遺傳因素:染色體及相關基因異常,如BMP15、BMPR1A/1B、PGRMC1、FSHR、CYP11、FOXL2、GDF9、MCM8等;醫(yī)源性因素:放化療、盆腹腔手術以及自身免疫性因素等[1-2]。因其病因復雜,許多未知的因素仍在進一步探索中。有研究證明,DNA損傷反應(DNA damage response,DDR)是調控生殖衰老的主要生物途徑,DDR存在于整個生命過程中,調控卵巢儲備及其耗竭,尤其是關鍵基因的功能喪失或變異。該研究發(fā)現(xiàn),FMR1異常是引起POF的主要單基因病因,這為揭開POF的本質向前邁進了一大步[3]。

1.2 POF的治療 POF的治療方法包括:激素替代療法(hormone replacement therapy,HRT)、體外激活療法(in vitro activation,IVA)、贈卵體外受精胚胎移植(in vitro fertilization with oocyte donation,IVF-OD)、干細胞治療等。HRT是治療POF的推薦方法[4-5]。但有研究表明,長期HRT會增加患者患子宮內(nèi)膜癌、靜脈血栓栓塞的風險,同時無法從根本上逆轉卵巢功能減退[6-7]。卵巢儲備減少的部分POF患者,可通過IVA方法獲得成熟的卵母細胞進行體外受精胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET),然而IVA需要有一定數(shù)量的卵巢卵泡儲備,而且影響其臨床應用的最大問題是效率極低問題,不是所有的POF患者都適用此方法,且不能改變與年齡相關的卵母細胞質量下降[8]。IVF-OD利用捐獻的卵子進行IVF-ET,是治療POF患者不孕的方法之一,但IVF-OD治療無法使患者擁有與自身基因相同的后代,且研究表明通過IVF-OD獲得的妊娠,妊娠期高血壓疾病、子癇前期、胎兒出生體重不足和早產(chǎn)等的風險增加[9]。干細胞技術一直以來被視為“再生醫(yī)學技術”,可促進組織修復與再生,被認為是未來治療POF的最有效方法[10]。

2 間充質干細胞(mesenchyal stem cells,MSCs)

2.1 間充質干細胞特性 干細胞是一類未分化的細胞或原始細胞,在特定條件下可激發(fā)其分化潛能,定向分化為組織或器官,具有極強的組織修復潛能。干細胞治療技術被譽為繼藥物治療和手術治療之后的第三次醫(yī)學革命,是近年來國際醫(yī)學前沿重點發(fā)展領域[11]。MSCs是中胚層來源的一類多能型干細胞,是干細胞家族的重要成員,MSCs除了具有多項分化潛能外,還具有自發(fā)趨向損傷組織、促進局部組織血管生成,調節(jié)周圍細胞微環(huán)境以及免疫調節(jié)功能[12-13]。它們可從人體許多不同組織中,如骨髓、臍帶、外周血、脂肪組織、胎盤和經(jīng)血中分離培養(yǎng)獲得,可實現(xiàn)體外建系、擴增,同時MSCs不表達或僅表達極低水平的主要組織相容性復合物和T細胞共刺激因子從而表現(xiàn)出低免疫原性,解決了異體細胞治療最主要的免疫排斥問題[14]。MSCs可提供一個必要的微環(huán)境,以促進卵泡發(fā)育[15]。因此,MSCs治療有望成為許多難治性疾病,如克羅恩病、移植抗宿主病、POF等最有前景的治療方法,且已初見成效[16-17]。一項I期臨床試驗中對9例POF患者進行了MSCs治療,在研究期間和隨后長達12個月的隨訪中,根據(jù)患者體格檢查、相關實驗室指標和超聲檢查評估患者術后狀態(tài),均未觀察到全身或局部不良反應,進一步驗證了其治療的安全性[18]。

2.2 MSCs歸巢 MSCs的療效取決于MSCs歸巢效率,MSCs歸巢受植入方式、組織釋放的選擇素、細胞趨化因子(如SDF-1、MCP-1、MCP-3)、生長因子等MSCs表達的受體類型(如CD44、CD24、CCR2)以及分泌的整合素的綜合影響,只有一小部分MSCs能到達并停留于目標組織[19]。研究證明,靜脈注射MSCs制劑時大多數(shù)MSCs被滯留在毛細血管組織中無法遷移到損傷部位[20];或在到達目標組織之前被脾巨噬細胞吞噬清除而影響治療效果[21]。細胞支架可為MSCs提供適合的3D空間,并確保MSCs最大限度遷移到靶組織。因此,間充質干細胞聯(lián)合細胞支架成為治療POF的研究熱點[22]。

3 組織工程學(tissue engineering,TE)與細胞支架

3.1 細胞支架 TE是一門應用生命科學、材料學和工程學,幫助受損組織重建,恢復其生理結構和功能的新興學科,主要由種子細胞、支架和生物活性物質三個重要部分構成。一個理想的支架除了無毒無害的基本要求之外,還應給細胞提供足夠的三維生長空間,同時促進細胞生長、增殖、參與信號傳遞,且在愈合過程中或之后逐漸被人體吸收[23]。在支架制造選材中,細胞外基質(extracellular matrix,ECM)因具有較高的生物相容性、生物降解性以及在體內(nèi)快速重塑的可能性成為制造細胞支架較為理想的材料[24]。ECM主要由蛋白質包括膠原蛋白、纖維蛋白、彈性蛋白等,以及多糖,包括海藻酸鹽、透明質酸(hualuronic acid,HA)、殼聚糖(chitosan,CS)等組成。這些物質為周圍細胞提供機械支持,同時協(xié)調多種細胞信號傳遞,在組織中的細胞之間發(fā)揮通信聯(lián)絡作用并參與組織修復[25]。在組織工程中這些天然聚合物可制作成水凝膠的形式包裹細胞,為細胞提供適合的生長空間[26]。

3.2 各類支架 臨床上常用的幾種細胞支架包括膠原蛋白支架、纖維蛋白支架、CS支架、海藻酸鹽支架等。

3.2.1 膠原蛋白支架 膠原蛋白是動物組織中最豐富的可利用的蛋白質,具有抗原性低、生物相容性好、生物降解性高等特點,在TE中得到廣泛應用[27]。膠原蛋白支架可支持多種組織和細胞類型,并為細胞錨定、遷移和移植提供合適的位置。Jing等[28]研究發(fā)現(xiàn),脂肪間充質干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)與膠原蛋白支架共培養(yǎng)會增加ADSCs中FGF2、VEGF、TGFb1和HGF的表達。同時膠原蛋白支架也會與ADSCs相互作用,形成三維微環(huán)境,使ADSCs存活率增加,并在卵巢周圍聚集,分泌更多的生長因子、血管內(nèi)皮生成因子,最終增加卵泡顆粒細胞和血管的生成。然而膠原蛋白支架的缺點是機械強度低,降解過快,影響細胞在組織的停留時間,這會影響到該支架在臨床應用中的治療效果。

3.2.2 纖維蛋白支架 纖維蛋白在生物體內(nèi)普遍存在,可對血管生成和成纖維細胞生長起到積極作用,有極強的黏附性能,免疫原性較低,易塑形,可制備成具有復雜幾何形狀的支架,因此纖維蛋白也成為構造細胞支架材料的不二之選,尤其在體外組織器官的重建中具有很大的潛力[29]。在一項小鼠自體卵泡移植實驗中,用纖維蛋白支架作為載體攜帶血小板裂解物包裹卵泡后進行移植,取得了較好的效果[30]。但纖維蛋白支架的缺點是需要多種聚合物進行聚合反應,纖維蛋白原濃度、凝血酶濃度和離子強度的變化都會影響纖維蛋白支架的性能,導致支架外觀、機械性能和穩(wěn)定性發(fā)生不同程度變化。

3.2.3 CS支架 CS是甲殼素N-脫乙?；漠a(chǎn)物,主要來源于甲殼類動物的外殼,CS降解后產(chǎn)生的氨基酸,對人體無害且可被完全吸收。CS來源豐富且具有極好的彈性、柔韌性、可生物降解、良好的生物相容性、無毒、親水、抗菌和促進傷口愈合等特性,使其在生物材料中占據(jù)了獨特的地位[31]。但CS的制備和降解需要一定范圍的PH,且機械性能較弱,難以維持一定的形狀,這也在一定程度上限制了其應用。

3.2.4 海藻酸鹽支架 海藻酸鹽是一種主要存在于海洋藻類細胞壁和細胞黏膠質中的親水性多糖,水合反應后呈凝膠狀[32]。海藻酸鹽作為一種多用途聚合物,具有資源豐富、生物相容性好、處理簡單、凝膠性質溫和且經(jīng)濟實惠等優(yōu)點。以海藻酸鹽為基礎的水凝膠和支架在生物活性制劑的控釋系統(tǒng)、癌癥治療和抗菌劑等多個領域已進行了廣泛的研究[33]。盡管如此,海藻酸鹽支架同樣表現(xiàn)出機械性能弱和不易控制其形態(tài)的缺點。

3.2.5 HA細胞支架 HA是構成ECM的多糖類物質,在許多生理過程中起著關鍵作用,如調節(jié)血管壁的通透性,蛋白質、電解質擴散及運轉,細胞黏附、遷移和增殖等,并在醫(yī)學的眼科、骨科、皮膚科、心血管科及神經(jīng)科等學科有著廣泛的研究應用[34]。HA具有不錯的黏彈性和一定的生理調節(jié)功能,在TE中一直受到科學家們的青睞。HA細胞支架已被證實可在一定程度上延長MSCs在卵巢組織的停留時間,進而增強其旁分泌功能[35]。同時也由于HA的生物學特性導致其在體內(nèi)植入后較其他種類支架更易被機體吸收。由于單一材料的支架各有其局限性,通過結合不同材料的優(yōu)點來提高細胞支架的理化和生物性能的新型復合材料也在不斷的研發(fā)中[36]。

4 MSCs與細胞支架及在POF的研究應用

4.1 MSCs/細胞支架與卵泡體外培養(yǎng) 卵巢作為調節(jié)女性內(nèi)分泌及生殖功能的性腺,內(nèi)含許多始基卵泡,經(jīng)逐步生長發(fā)育,從始基卵泡發(fā)育成為次級卵母細胞從卵巢內(nèi)排出。在月經(jīng)周期中發(fā)育的眾多卵泡里,只有一個優(yōu)勢卵泡可發(fā)育成熟,因此女性一生中約有400～500個卵泡可完全發(fā)育成熟而排卵,卵巢中留存的卵泡數(shù)量和質量反應了卵巢儲備功能。POF患者往往伴有不同程度的卵泡數(shù)量減少和(或)質量下降,卵巢儲備功能的變化是評價POF療效的重要參考指標之一。體外卵泡培養(yǎng)有望成為一種獲得成熟卵母細胞用于受精的有效方法[37],也為將來用于改善POF患者卵巢功能,保存生育能力帶來希望[38]。Rajabi等對卵泡體外培養(yǎng)方法的優(yōu)化進行了一系列的研究,分別制備好0.25%海藻酸鈉和0.75%的膠原蛋白凝膠支架,用于卵泡和人經(jīng)血間充質干細胞(human menstrual blood mesenchymal stem cells,MenSCs)體外三維共培養(yǎng),連續(xù)觀察12d后分析結果。該實驗結果表明海藻酸鈉支架共培養(yǎng)組比膠原蛋白共培養(yǎng)組卵泡存活率更高,且激素測定發(fā)現(xiàn)卵泡的雌二醇和孕酮的分泌量顯著增加,但兩組之間無明顯統(tǒng)計學差異,并且該研究還發(fā)現(xiàn)MenSCs下調了卵泡Mater基因的表達,明顯上調Gdf9和Bmp15表達,而海藻酸鹽支架和膠原蛋白支架對卵泡的基因表達無影響[39]。雖然海藻酸鹽支架在卵泡體外培養(yǎng)具有一定的優(yōu)勢,但有研究認為,從海藻酸鹽支架共培養(yǎng)系統(tǒng)獲得的卵母細胞發(fā)育能力較低,減數(shù)分裂紡錘體組裝可能受到干擾。Hassani等[40]進行了卵泡體外培養(yǎng)的相關研究,指出與0.5%、1.5%濃度的CS支架相比,1%濃度的CS支架孔隙分布更均勻,降解率高,化學性質穩(wěn)定,且機械性能強,最適合供給卵泡細胞體外三維培養(yǎng)。1%濃度CS支架組與0.7%濃度海藻酸鹽支架組比較,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測CS和海藻酸鹽各組中卵泡形態(tài)、成熟卵母細胞質量和類固醇激素分泌情況,用實時熒光定量PCR法檢測卵泡發(fā)生、內(nèi)分泌和凋亡相關基因的表達,結果表明1%CS支架組的卵泡成活率、卵泡直徑、雌二醇分泌、Cyp19a1、Lhcgr基因表達均高于0.7%海藻酸鹽支架組,且海藻酸鹽支架組卵母細胞紡錘體紊亂的比例(42.1%)顯著高于1%CS支架組(16.6%)。因此,Hassani等認為1%CS支架相比0.7%海藻酸鹽支架更適用于卵泡的體外三維培養(yǎng)。

4.2 MSCs/細胞支架與卵巢組織移植 POF病因復雜,癌癥患者放化療過程中可導致卵泡凋亡引起POF。有POF風險且有生育要求的癌癥患者,可通過胚胎凍存、卵母細胞凍存和卵巢組織凍存等,或進行卵巢原位干細胞治療來保留其生育功能。然而卵巢組織在移植后會有大量卵泡凋亡,移植過程仍有許多問題需解決。為了提高卵巢組織移植后卵泡的存活率,Dolmans等將ADSCs嵌入纖維蛋白支架中并移植到免疫缺陷小鼠的腹膜壁下部的1/3處,然后將卵巢組織移植到細胞支架,移植后第3、7和14d對種植體中的PO2進行監(jiān)測和分析。結果表明,通過與ADSCs/纖維蛋白支架的結合,移植組織在早期獲得了更高的血氧水平,組織血管生成增加,卵泡存活率升高[41]。

4.3 MSCs/細胞支架原位注射療法 MSCs原位注射療法,更易被接受,操作簡單,更有望應用于POF的臨床治療中。動物實驗研究表明,MSCs治療能改善卵巢功能并提高生育能力。Ding等[42]研究發(fā)現(xiàn),膠原支架/臍帶間充質干細胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCss)通過磷酸化FOXO3a和FOXO1促進小鼠原始卵泡激活,并抑制卵泡凋亡。隨后的臨床試驗中,招募14例POF患者,將UC-MSCs或膠原支架/UC-MSCs移植到卵巢中,3個月后超聲檢查卵巢的體積和血流量來評估卵巢恢復情況。與移植前相比,移植后卵巢體積增加,且卵巢中未見間質增生及其他卵巢異常結構。3個UC-MSCs組的病例和3個膠原支架/UC-MSCs組的病例超聲顯示卵巢可見明顯血流信號(62.5%,5/8)膠原支架/UC-MSCs組患者移植后卵泡增生,膠原支架/UC-MSCs組中的1例和UC-MSCs組中的1例在接受移植后的一年內(nèi)成功妊娠。一項UC-MSCss聯(lián)合HA治療POF模型小鼠實驗中,使用人GAPDH基因特異性引物進行PCR檢測,在體內(nèi)對UC-MSCss進行了14d的追蹤以評估HA對移植的UC-MSCss在卵巢中停留時間的影響,添加HA組中,UC-MSCss移植后7d仍能觀察到PCR產(chǎn)物,而在無HA組中,3d后就檢測不到陽性條帶。結果表明,HA在很大程度上延長了UC-MSCss在卵巢中的停留時間。在POF小鼠模型中,將UC-MSCss/HA移植到卵巢后,cKit、p-cKit、p-AKT、p-S6K和p-rpS6表達水平有所恢復,HE染色顯示卵巢中卵泡數(shù)增加,不同階段的卵泡占比均有上升,并驗證了UC-MSCss增強HGF、VEGF、SCF和EGF等細胞因子的分泌,其中HGF通過激活PI3K-Akt通路促進卵泡存活,且HA還協(xié)調增強UC-MSCss的旁分泌功能,并促進這一過程[35]?？偟膩碚f,MSCs聯(lián)合細胞支架移植到卵巢內(nèi),可有效治療POF,改善卵巢內(nèi)分泌及生殖功能,提高女性的生育能力。

5 結論與展望

綜上所述,MSCs聯(lián)合細胞支架是治療POF的有效方法,各類細胞支架的使用無論從卵泡體外培養(yǎng)、卵巢組織移植或原位注射中均提高了MSCs療法的療效,且在體外卵泡培養(yǎng)實驗中1%CS支架更具優(yōu)勢。雖然這一治療方法得到了學術界的認可,但仍有許多問題需更進一步研究。目前的研究驗證了MSCs通過旁分泌或自分泌、調節(jié)免疫、調控基因表達等多種方式發(fā)揮治療作用[43],然而細胞之間的作用精細復雜,因治療涉及患者健康安全問題,其治療機制、對機體的遠期影響等仍需進一步研究,探索優(yōu)化MSCs移植方案,以確定最佳注射部位以及MSCs的最佳治療劑量。盡管對MSCs的研究已深入到臨床實驗階段,然而現(xiàn)有的MSCs制劑標準主要針對安全性(如病原體檢測)和細胞類型(如分子標記物)進行檢測,仍缺乏針對MSCs功能評價的標準。如何能快速選取功能強大的MSCs也將成為未來研究需攻克的重點和難點。目前支架制造材料種類繁多,制備方法各異,如何能構造出安全、高效、性價比高的支架尚無定論。隨著醫(yī)學的不斷發(fā)展,相信在不久的將來MSCs治療能為眾多飽受POF煎熬的患者帶來福音。