董益聞,羅仍卓么,王興平,王晉鵬,周 力

(1. 寧夏大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,銀川 750021;2. 寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,銀川 750021)

【研究意義】長鏈非編碼RNA(Long intergenic non-coding RNA,LncRNA)是一類編碼蛋白質(zhì)能力有限的轉(zhuǎn)錄本,其長度大于200 nt[1]。據(jù)報(bào)道,lncRNA通過不同方式發(fā)揮各種生物學(xué)作用,如lncRNA不僅能夠作為ceRNA與miRNA競爭性結(jié)合來調(diào)控miRNA及其靶基因轉(zhuǎn)錄;同時(shí)還可直接與mRNA結(jié)合導(dǎo)致mRNA降解;此外,lncRNA作為分子支架將表觀修飾的酶或染色質(zhì)修飾因子聯(lián)合在一起,從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。【前人研究進(jìn)展】LncRNA在多種疾病中扮演著重要的調(diào)控角色,如lncRNA HOXA-AS2在肝癌[2]、胃癌[3]和大腸癌[4]等癌癥中發(fā)揮著調(diào)控作用,Kong等[5]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA-CDC6海綿吸附miR-215能夠促進(jìn)乳腺癌。LncRNA FAH2-2與MLKI相互作用調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)的炎癥反應(yīng)[6]。在奶牛乳腺炎中,Ma等[7]研究證實(shí),lncRNA XIST通過NF-κB/NLRP3途徑參與奶牛乳腺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。目前雖然對(duì)奶牛乳腺炎進(jìn)行了一些lncRNA的相關(guān)研究,但仍有大量差異表達(dá)的lncRNA未被發(fā)掘。【本研究切入點(diǎn)】在前期研究中發(fā)現(xiàn)了lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349在奶牛乳腺炎中差異表達(dá)。lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349的序列及其在乳腺上皮細(xì)胞炎癥中的表達(dá)情況尚未報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬以新發(fā)現(xiàn)的lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349為候選基因,進(jìn)行l(wèi)ncRNA的克隆、生物信息學(xué)分析及其在LPS誘導(dǎo)不同時(shí)間的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥中的表達(dá)檢測(cè),為深入研究奶牛乳房炎的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

本研究以寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存的、經(jīng)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定的MAC-T奶牛乳腺上皮細(xì)胞[8-9]作為試驗(yàn)材料。

1.2 主要試劑

LPS由Sigma-Aldrich公司(美國)提供;DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶和PBS緩沖液由Hyclone公司(美國)提供;胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)由BI公司(以色列)提供;TRIzol試劑和PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司提供;pMD19 T-Vector與DNA連接酶由寶生物工程(大連)有限公司提供;DNA回收純化試劑盒由Omega公司(美國)提供;2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq(withTli RNaseH)熒光定量試劑盒由北京聚合美生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 MAC-T細(xì)胞的培養(yǎng) 在37 ℃水浴鍋中解凍凍存在液氮中的MAC-T細(xì)胞,接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,在DMEM/F12培養(yǎng)基(含10% FBS)、37 ℃、100%飽和濕度和5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長融合度至80%～90%時(shí),采用0.25%的胰酶消化貼壁的細(xì)胞,進(jìn)行傳代培養(yǎng),備用。

1.3.2 候選lncRNAs的克隆及測(cè)序 用TRIzol試劑盒并嚴(yán)格按照其說明書提取MAC-T細(xì)胞的總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。應(yīng)用Primer Permier 5.0軟件設(shè)計(jì)lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349的擴(kuò)增引物(表1)。以上述第一鏈cDNA為模板,進(jìn)行上述2個(gè)lncRNA的第二鏈擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：上、下游引物各1 μL,模版cDNA 3 μL,2×TaqMaster Mix (Dyc Plus) 10 μL,加RNase-free H2O至20 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s, 56 ℃(lncRNA TCONS-72171)/58 ℃(lncRNA TCONS-6234 9)30 s,72 ℃ 1 min(39個(gè)循環(huán)),72 ℃終延伸5 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行l(wèi)ncRNAs擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小檢測(cè)。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后,與T載體進(jìn)行連接,并通過轉(zhuǎn)化、陽性克隆篩選及菌液PCR實(shí)驗(yàn)后,挑取陽性克隆菌液,送往楊凌奧科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 候選lncRNAs序列分析 為全面了解候選lncRNAs的序列特征,將測(cè)序所得序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST在線工具(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析候選lncRNAs位于的染色體。利用DNAMAN軟件對(duì)候選lncRNAs進(jìn)行同源性比對(duì)。應(yīng)用lncLocator在線工具(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/)預(yù)測(cè)候選lncRNAs的亞細(xì)胞定位。

1.3.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建 體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞,待細(xì)胞生長至60%～70%融合度時(shí),用終濃度50 ng/μL的LPS誘導(dǎo)細(xì)胞,建立炎癥模型。分別在LPS誘導(dǎo)的第0、3、6和12小時(shí)收集細(xì)胞,利用RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞炎癥模型的可靠性。

表1 候選lncRNAs克隆的PCR引物

1.3.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞總RNA提取、RT-qPCR檢測(cè) 利用TRIzol法提取上述處理細(xì)胞的總RNA,并利用微量紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的純度和濃度。采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)候選lncRNAs和IL-1β和IL-6基因mRNA水平的表達(dá)量。反應(yīng)體系為：上、下游引物(表2)各1 μL,cDNA模板2 μL,2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq(withTli RNaseH)10 μL,加RNase-free H2O至20 μL。反應(yīng)條件為：初始變性95 ℃ 30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,共40次循環(huán);然后95 ℃ 10 s,65 ℃降溫5 s。

1.3.6 候選lncRNAs的靶基因預(yù)測(cè)及KEGG功能注釋分析 本研究從順式作用和反式作用兩方面預(yù)測(cè)候選lncRNAs的靶基因。采用京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)進(jìn)行功能注釋(P<0.05),分析候選lncRNA的生物學(xué)功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選lncRNAs真實(shí)性鑒定

為驗(yàn)證候選lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349的真實(shí)性,本研究進(jìn)行候選lncRNAs的PCR克隆,并將產(chǎn)物回收后送往公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示,本研究獲得340 bp的lncRNA TCONS-72171(圖1)和552 bp的lncRNA TCONS-62349的序列(圖2)。由此確定,候選lncRNAs真實(shí)存在。

2.2 候選lncRNAs的序列分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST在線工具(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析結(jié)果表明lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349分別位于20號(hào)和19號(hào)染色體上。利用DNAMAN軟件分析物種保守性,根據(jù)比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究獲得的牛lncRNA TCONS-72171和羊(XM_027979975)、鹿(XM_020875053)之間的同源性分別為97.03%和94.41%,說明該lncRNA在這3個(gè)物種間是高度保守的;此外,本研究還發(fā)現(xiàn)牛lncRNA TCONS-62349和羊(XR_003590712)之間的同源性為95.31%。LncLocator在線工具(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,lncRNA TCONS-72171大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中,而lncRNA TCONS-62349大部分位于細(xì)胞核中(表3)。綜上推測(cè),lncRNA TCONS-72171可能在轉(zhuǎn)錄后水平反式調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá),例如調(diào)節(jié)mRNA翻譯和降解等,或參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)控;lncRNA TCONS-62349可能與DNA、RNA或蛋白質(zhì)等多種分子相互作用,調(diào)控染色體的結(jié)構(gòu)和功能。

表2 RT-qPCR引物

圖1 lncRNA TCONS-72171的PCR擴(kuò)增和測(cè)序Fig.1 PCR amplification and sequencing of lncRNA TCONS-72171

圖2 lncRNA TCONS-62349的PCR擴(kuò)增和測(cè)序Fig.2 PCR amplification and sequencing of lncRNA TCONS-62349

表3 候選lncRNAs的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

** 表示 P<0.01,下同。** indicates P<0.01. The same as below.圖3 IL-6和IL-1β基因在LPS誘導(dǎo)炎癥的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Expression of IL-6 and IL-1β gene in bovine mammary epithelial cell with LPS-induced inflammation

2.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建

采用LPS誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞,構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型。RT-qPCR結(jié)果顯示,與0 h相比,在LPS誘導(dǎo)3、6和12 h奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的IL-6、IL-1β基因表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.01),說明本研究成功構(gòu)建LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型(圖3)。

2.4 候選lncRNAs在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥中的表達(dá)模式

為驗(yàn)證候選lncRNAs在LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮炎癥不同時(shí)間的表達(dá)情況,采用RT-qPCR檢測(cè)候選lncRNAs的表達(dá)。結(jié)果(圖4)表明,與0 h相比,lncRNA TCONS-72171與lncRNA TCONS-62349在LPS誘導(dǎo)3、6、12 h的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01)。

2.5 候選lncRNAs的靶基因預(yù)測(cè)和KEGG功能注釋分析

通過對(duì)候選lncRNAs的順式和反式靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示,lncRNA TCONS-72171的順式靶基因?yàn)長CP2,反式靶基因?yàn)镾NTG1、ENSBTAG00000052085、FAM221A、ENSBTAG00000033806、ENSBTAG00000005140和LGR6(圖5-A)。lncRNA TCONS-62349的順式靶基因?yàn)锳LOX15、SLC16A13、SLC16A11、ASGR1、BCL6B、ASGR2、ENSBTAG00000053786、ARRB2、PELP1、C19H17orf49、ALOX12、RNASEK、CLEC10A和ALOX12E(圖5-B),并未發(fā)現(xiàn)lncRNA TCONS-62349可能的反式靶基因。

由此,對(duì)上述候選靶基因進(jìn)行KEGG功能注釋分析,進(jìn)一步推測(cè)候選lncRNAs是否參與炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明,lncRNA TCONS-72171可能參與調(diào)控FcεRI、TGF-β、T細(xì)胞受體、Wnt等與炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路(圖6-A)。lncRNA TCONS-62349可能參與5-羥色胺能突觸、TRP通道調(diào)控炎性介質(zhì)等與炎癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路(圖6-B)。上述結(jié)果表明,2個(gè)候選的lncRNA可能與奶牛的乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān),有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖4 候選lncRNAs在LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 Expression of candidate lncRNAs in LPS-induced bovine mammary epithelial cell inflammation

圖5 lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349的靶基因預(yù)測(cè)Fig.5 Target gene prediction of lncRNA TCONS-72171 and lncRNA TCONS-62349

A：lncRNA TCONS-72171的分析結(jié)果; B：lncRNA TCONS-62349的分析結(jié)果。A： Analysis results of lncRNA TCONS-72171; B： Analysis results of lncRNA TCONS-62349.圖6 lncRNA TCONS-72171與lncRNA TCONS-62349的KEGG功能注釋Fig.6 KEGG functional annotation of lncRNA TCONS-72171 and lncRNA TCONS-62349

3 討 論

奶牛乳腺炎是乳腺組織受外界因素刺激產(chǎn)生的炎癥性疾病,以高發(fā)病率、繁殖率降低等特點(diǎn)影響奶制品的品質(zhì)與產(chǎn)量,是制衡奶業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵原因之一[10]。大腸桿菌(Escherichiacoli)與金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引發(fā)奶牛乳房炎最常見的病原菌,而LPS作為E.coli細(xì)胞壁的主要成分,在E.coli侵襲乳腺組織后會(huì)刺激IL-6、IL-1β等炎癥因子的分泌增多,往往導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng),因此研究中常用LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞建立炎癥模型[11]。

lncRNA在細(xì)胞周期及細(xì)胞分化、增殖和凋亡等多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要功能[12]。近年來,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在免疫相關(guān)疾病中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,如lncRNA SNHG16通過海綿吸附miR-520,進(jìn)而調(diào)控VEGF在肺癌中發(fā)揮作用[13]。lncRNA Xist激活miR-335/SOD2/ROS信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展[14]。在炎癥性疾病中,lncRNA MEG3在TNF-α處理的角質(zhì)形成細(xì)胞和銀屑病小鼠中抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)細(xì)胞自噬和抑制炎癥[15]。lncRNA在奶牛乳腺炎中同樣扮演著重要角色,如LRRC75A-AS1參與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路和調(diào)節(jié)TJ蛋白在MAC-T細(xì)胞炎癥中發(fā)揮作用[16]。但并未發(fā)現(xiàn)有關(guān)候選lncRNAs(lncRNA TCONS-72171、lncRNA TCONS-62349)的研究,因此本研究對(duì)候選lncRNAs進(jìn)行了真實(shí)性檢驗(yàn),對(duì)其中間片段進(jìn)行PCR克隆并進(jìn)行測(cè)序,確認(rèn)真實(shí)存在后分別進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),候選lncRNAs在不同物種間高度保守,這預(yù)示可以根據(jù)其他物種上的相關(guān)研究進(jìn)行功能推測(cè)。

為探索候選lncRNAs與奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥的關(guān)系,以LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為炎癥模型,發(fā)現(xiàn)候選lncRNAs的表達(dá)量在LPS誘導(dǎo)后的不同時(shí)間表達(dá)量均極顯著上調(diào),表明候選lncRNAs在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥中扮演著重要角色。此外,通過對(duì)候選lncRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)及KEGG功能注釋,結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA TCONS-72171的靶基因LCP2[17]和LGR6[18]都與炎癥性疾病有關(guān)。其中,LCP2[19]同時(shí)也是JAK-STAT信號(hào)通路中STAT1的靶基因。JAK-STAT信號(hào)通路的核心有3個(gè)部分,分別是細(xì)胞因子受體、JAKs(包含JAK1、JAK2、JAK3和TYK2共4個(gè)成員)和STATs(包含STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6共7個(gè)成員)[20]。JAK-STAT信號(hào)通路與炎癥性疾病關(guān)系十分密切,如IL-6受體和IFN受體可以通過JAK-STAT信號(hào)通路分別響應(yīng)IL-6家族(IL-6、IL-11和LIF等)和IFN-γ的細(xì)胞因子[21-22]。由上述研究結(jié)論可知,lncRNA TCONS-72171可能通過調(diào)控靶基因LCP2來影響STAT1表達(dá),進(jìn)而通過JAK-STAT信號(hào)通路調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥。

在本研究中,lncRNA TCONS-62349的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明,與炎癥性疾病有關(guān)的靶基因有ALOX15[23]、ASGR1[24]、BCL6B[25]、ARRB2[26]、PELP1[27]、ALOX12[28]、CLEC10A[29]和ALOX12E[30]。從上述文獻(xiàn)可知,ALOX15、ASGR1、ARRB2、PELP1和ALOX12都與NF-κB信號(hào)通路有著密切聯(lián)系。NF-κB家族包含5種轉(zhuǎn)錄因子：p50、p52、p65(RelA)、c-Rel和RelB,除RelB只能與p50和p52形成異源二聚體以外,其他家族成員可通過Rel同源結(jié)構(gòu)域組合成為同源或異源的NF-κB二聚體,從而調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄[31]。在炎癥性腸病中,lncRNA NEAT1的表達(dá)上調(diào),通過促進(jìn)NF-κB/p65的轉(zhuǎn)運(yùn)激活NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)炎癥發(fā)展[32];在Nd2O3處理后的小鼠肺組織中,上調(diào)的lncRNA H19通過激活NF-κB,促進(jìn)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)進(jìn)而加劇肺組織炎癥和肺纖維化[33]。由此推測(cè),lncRNA TCONS-62349可以通過ALOX15、ASGR1、ARRB2、PELP1和ALOX12這些靶基因介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的激活,從而對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥具有調(diào)控作用。

KEGG功能注釋分析顯示,lncRNA TCONS-72171富集到的信號(hào)通路中,FcεRI[34]、TGF-β[35]、T細(xì)胞受體[36]、Wnt[37]信號(hào)通路在炎癥性疾病中發(fā)揮著調(diào)控作用;lncRNA TCONS-62349參與到5-羥色胺能突觸[38]、TRP通道調(diào)控炎性介質(zhì)[39]、Relaxin[40]、壞死性細(xì)胞凋亡[41]、趨化因子[42]和MAPK[43]等與炎癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路。由此可以進(jìn)一步推測(cè),候選lncRNAs可能通過潛在靶基因而調(diào)控上述炎癥相關(guān)信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

4 結(jié) 論

奶牛lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349真實(shí)存在,且在LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型中的表達(dá)均極顯著上調(diào)。此外,極顯著上調(diào)的lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349可能通過其潛在靶基因參與JAK-STAT、NF-κB和MAPK等炎癥相關(guān)的信號(hào)通路,在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥發(fā)揮調(diào)控作用。