徐超，胡文效*，陳明光，朱明宣，邱磊，趙先炎

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）/生物基材料與綠色造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250353）

葡萄酒的香氣物質(zhì)按來(lái)源分為品種香、發(fā)酵香和陳釀香。葡萄酒香氣的香韻和香氣強(qiáng)度特征綜合反映著葡萄酒原料的品種特性、產(chǎn)地風(fēng)土特點(diǎn)和葡萄酒發(fā)酵、陳釀方法及技術(shù)水平。其中，葡萄酒發(fā)酵環(huán)節(jié)是彰顯葡萄酒品種香、形成葡萄酒發(fā)酵香、影響葡萄酒陳釀香的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。葡萄酒發(fā)酵本質(zhì)是借助微生物將葡萄汁成分轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸丫瞥煞值南盗猩锘瘜W(xué)反應(yīng)，微生物（主要是酵母菌、乳酸菌）在發(fā)酵過(guò)程中的作用顯著影響葡萄酒的“表型”，操縱葡萄酒的風(fēng)味、香氣和風(fēng)格[1]?；谏鷳B(tài)多樣性、微生物物種多樣性和遺傳多樣性，以及高通量測(cè)序技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)（GC-MS）的發(fā)展，葡萄酒發(fā)酵微生物群落組成及演替與葡萄酒香氣相關(guān)性[2-4]逐漸被揭示出來(lái)；基于酶調(diào)節(jié)作用和轉(zhuǎn)錄組、蛋白組表達(dá)結(jié)果，通過(guò)調(diào)控葡萄酒發(fā)酵微生物菌群或香氣化合物生物合成途徑關(guān)鍵酶合成與酶活性水平，使實(shí)現(xiàn)調(diào)控目標(biāo)代謝物的代謝通量成為可能。

1 葡萄酒發(fā)酵與葡萄酒香氣的關(guān)系

葡萄向葡萄酒的轉(zhuǎn)化涉及真菌（酵母菌）、細(xì)菌（乳酸菌、醋酸菌）等多種微生物的協(xié)同作用，這些微生物形成了一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，它們的代謝活動(dòng)獨(dú)立進(jìn)行又相互作用，共同塑造了葡萄酒的風(fēng)味風(fēng)格。微生物代謝產(chǎn)生的高級(jí)醇、酸、酯類等構(gòu)成葡萄酒發(fā)酵香的物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)酵過(guò)程中酶催化葡萄原料中的香氣前體物釋放出C13降異戊二烯類化合物、游離態(tài)的萜烯、硫醇類等物質(zhì)，對(duì)于增強(qiáng)葡萄酒品種香氣和產(chǎn)區(qū)風(fēng)味特色具有極其重要的意義。葡萄酒中被檢出的香氣物質(zhì)有800余種[5]，這些香氣物質(zhì)通過(guò)協(xié)同、加成或掩蓋等作用，形成了葡萄酒豐富而獨(dú)特的香韻結(jié)構(gòu)，并決定了葡萄酒的風(fēng)格特點(diǎn)。

1.1 葡萄酒發(fā)酵作用增強(qiáng)品種香

葡萄品種香氣物質(zhì)主要包括萜烯類、降異戊二烯類、芳香族類、脂肪族類、甲氧基吡嗪類和揮發(fā)性含硫化合物等，這些化合物多以香氣前體物的形式存在于葡萄果實(shí)中，在發(fā)酵過(guò)程中香氣前體物在酶促（糖苷酶、酯酶、C-S裂解酶等）和非酶促作用（酸催化水解和化學(xué)重排）下，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性化合物，香氣物質(zhì)被釋放出來(lái)，對(duì)葡萄酒風(fēng)味的感官感知有積極的促進(jìn)作用[6]。

1.1.1 萜烯類香氣物質(zhì)

萜烯是分子骨架以異戊二烯（C5單元）為基本結(jié)構(gòu)單元的化合物及其衍生物，其分子式符合(C5H8)n通式，目前在釀酒葡萄果實(shí)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了70多種萜烯類物質(zhì)[7]，其中單萜是果實(shí)中含量最高、種類最為豐富的萜類物質(zhì)，常見(jiàn)的單萜包括芳樟醇、香葉醇、香茅醇、橙花醇等。

葡萄漿果中萜烯類物質(zhì)通過(guò)2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑合成[8]，主要存在于果皮中，且糖苷結(jié)合態(tài)萜烯的含量高于游離態(tài)。例如在葡萄牙不同產(chǎn)區(qū)的兩種白葡萄品種中，糖苷類香氣物質(zhì)的結(jié)合態(tài)萜烯分別占總香氣物質(zhì)的54%和67%[9]。葡萄果實(shí)中萜烯類物質(zhì)的萜烯苷元主要是單萜醇、單萜二醇和單萜三醇[10]，而糖苷的主要形式是雙糖苷，占總糖苷的80%以上，雙糖苷類香氣前體物質(zhì)的主要酶解方式如圖1所示[11]。

通常在葡萄酒發(fā)酵環(huán)境條件下，葡萄原料中的糖苷類化合物在糖苷酶作用下部分被水解[12-13]，但一般糖苷酶的最適條件是pH5.0～6.0、溫度40～50 ℃，在葡萄酒發(fā)酵實(shí)際環(huán)境（高糖、低pH、低溫、高乙醇）下糖苷酶活性受到抑制，導(dǎo)致其活性僅為最適條件下的10%左右[14]，因此，葡萄原料糖苷結(jié)合態(tài)香氣化合物的有效釋放成為葡萄酒發(fā)酵品種香調(diào)控的關(guān)注點(diǎn)之一。

1.1.2 降異戊二烯類

降異戊二烯類化合物是一類由類胡蘿卜素（四萜）如β-胡蘿卜素等降解產(chǎn)生的13個(gè)、11個(gè)、10個(gè)、9個(gè)碳原子的衍生物。目前有關(guān)葡萄與葡萄酒降異戊二烯化合物的研究多集中于C13類，C13降異戊二烯類化合物及其衍生物，如α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、β-大馬士酮、香葉基丙酮等，雖然這類化合物在葡萄果實(shí)中含量較低，但因其具有閾值低（如β-紫羅蘭酮閾值0.007 μg·kg-1[15]，β-大馬士酮閾值0.002 μg·kg-1[16]）、香氣活度（OAV）值較高的特點(diǎn)，對(duì)葡萄酒品種香氣具有重要貢獻(xiàn)。

類胡蘿卜素雙加氧裂解酶（Carotenoid cleavage dioxygenase，CCDs）是參與類胡蘿卜素裂解產(chǎn)生香氣化合物的主要酶，植物CCD亞基因家族中CCD1、CCD4與香氣物質(zhì)的形成有關(guān)，在葡萄中發(fā)現(xiàn)并鑒定了3個(gè)參與類胡蘿卜素裂解并產(chǎn)生香氣化合物的基因VvCCD1、VvCCD4a和VvCCD4b[17]，近來(lái)才發(fā)現(xiàn)異戊二烯路徑的首個(gè)負(fù)調(diào)控因子VvWRKY70[18]。β-胡蘿卜素在CCD1和CCD4作用下能在9,10和9',10'雙鍵裂解產(chǎn)生α-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮等[19]。在葡萄酒釀造過(guò)程中，葡萄中類胡蘿卜素可以轉(zhuǎn)化為游離態(tài)β-大馬士酮、β-紫羅蘭酮、葡萄螺烷、雷司令縮醛、三甲基二氫萘（TDN）等[12]，成為葡萄酒發(fā)酵品種香調(diào)控的又一關(guān)注點(diǎn)。

1.1.3 硫醇類

大部分揮發(fā)性硫化物對(duì)葡萄酒香氣產(chǎn)生消極影響，但部分硫醇如4-巰基-4-甲基戊烷-2-酮（4MMP）、3-巰基己醇（3MH）、3-巰基己醇乙酸酯（3MHA）等表現(xiàn)出生動(dòng)的果香（番石榴、西番蓮），它們是由酵母分泌的C-S裂解酶催化，從半胱氨酸和谷胱甘肽結(jié)合的前體中釋放[20-21]，有研究表明，3MH可以通過(guò)釀酒酵母轉(zhuǎn)化為3MHA[22]。這些硫醇及其前體物質(zhì)廣泛存在于白葡萄品種的葡萄酒中，如‘長(zhǎng)相思’‘雷司令’‘灰比諾’‘霞多麗’等，其中4MMP在‘長(zhǎng)相思’葡萄酒中含量一般每千升超過(guò)40納克，而3MHA和3MH每千升分別可達(dá)幾百納克和幾百到幾千納克[23-24]。有報(bào)道顯示，在發(fā)酵過(guò)程中只有很少部分的芳香硫醇被釋放出來(lái)[25-26]，也有研究表明，只有3.2%的胱硫醚類香氣前體物被裂解[27]，這可能與釀酒酵母中胱硫醚β-裂解酶的活性較低有關(guān)。

品種香氣還包括甲氧基吡嗪類、芳香族類和脂肪族如C6化合物等，其中甲氧基吡嗪是由氨基酸代謝中產(chǎn)生的含氮雜環(huán)物質(zhì)，其較低的閾值賦予葡萄酒濃郁的青椒味。歐亞種釀酒葡萄及葡萄酒中其濃度約0.5～50 ng·L-1，強(qiáng)烈的青椒氣味往往被認(rèn)為對(duì)葡萄酒香氣質(zhì)量有消極影響。脂肪族C6化合物是由前體物質(zhì)脂肪酸經(jīng)脂氧合酶（LOX）途徑逐步氧化、裂解、脫氫等作用生成，為葡萄酒帶來(lái)青草味及生青味[28]。

1.2 發(fā)酵作用合成發(fā)酵香

葡萄酒發(fā)酵香香氣化合物主要包括醇類、酯類和酸類化合物，屬于微生物次生代謝產(chǎn)物，其中，乙酯、乙酸酯、高級(jí)醇對(duì)發(fā)酵香貢獻(xiàn)較大，其代謝合成示意圖如圖2[29]。葡萄果皮自然攜帶酵母菌群，包括非釀酒酵母（non-Saccharomyces）和釀酒酵母（S.cerevisiae），并且非釀酒酵母占據(jù)種群優(yōu)勢(shì)（1×105～1×106cfu·mL-1），隨著發(fā)酵的進(jìn)行，非釀酒酵母的優(yōu)勢(shì)地位很快被釀酒酵母取代。釀酒酵母發(fā)酵力強(qiáng)，可以耐受更高的SO2和酒精度，在酒精發(fā)酵中占據(jù)主導(dǎo)地位（1×106～1×108cfu·mL-1）[30]。釀酒酵母在酒精發(fā)酵階段可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精、CO2及其它副產(chǎn)物，其代謝活動(dòng)對(duì)葡萄酒的風(fēng)味和質(zhì)量有著重要的影響[31]。

圖2 釀酒酵母中高級(jí)醇和酯的形成[29]Figure 2 Formation of higher alcohols and esters in Saccharomyces cerevisiae

1.2.1 醇類化合物的合成

葡萄酒中對(duì)香氣有影響的醇類物質(zhì)包括脂肪族醇和芳香族醇兩大類，主要有正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇等[32]。文獻(xiàn)報(bào)道[33]中高級(jí)醇對(duì)葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)觀點(diǎn)并不完全相同，有的傾向于負(fù)面影響，因?yàn)楦呒?jí)醇的感官屬性可能依賴于特定的環(huán)境，如在高級(jí)醇總濃度低于300 mg·L-1時(shí)，能對(duì)葡萄酒芳香特征作出積極貢獻(xiàn)，而在總濃度大于400 mg·L-1時(shí)，則會(huì)出現(xiàn)刺鼻和令人不快的氣味。de-la-Fuente-Blanco等[33]評(píng)估了4種常見(jiàn)的高級(jí)醇對(duì)模擬葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)，結(jié)果表明，異丁醇和異戊醇對(duì)葡萄酒整體香氣強(qiáng)度有顯著的影響，能夠增強(qiáng)葡萄酒的香氣感知，而β-苯乙醇和甲硫基丙醇的添加對(duì)模擬酒的香氣特征基本沒(méi)有影響，盡管β-苯乙醇被多次報(bào)道為葡萄酒花香特征的潛在貢獻(xiàn)者。

高級(jí)醇的合成是由相應(yīng)的中間體α-酮酸經(jīng)脫羧還原生成相應(yīng)的醛，再經(jīng)進(jìn)一步脫氫反應(yīng)生成[34]。根據(jù)α-酮酸的來(lái)源，高級(jí)醇的形成分為氨基酸脫氨分解生成α-酮酸的分解代謝途徑（Ehrlich代謝途徑）和糖酵解、三羧酸循環(huán)生成α-酮酸的合成代謝途徑（Harris途徑），并且發(fā)酵液中75%的高級(jí)醇由Harris途徑產(chǎn)生，25%是由Ehrlich途徑產(chǎn)生[35]。

1.2.2 酯類化合物的合成

在葡萄酒中酯類化合物主要為乙酸酯和乙酯。乙酸酯類化合物主要包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸-2-苯乙酯等；乙酯類化合物主要為己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等。

乙酸酯合成的底物是乙酰輔酶A（Acetyl coenzyme A，acetyl-CoA）和醇，乙酰輔酶A主要是通過(guò)丙酮酸的氧化脫羧形成，醇包括乙醇和來(lái)自氨基酸代謝產(chǎn)生的高級(jí)醇；乙醇或高級(jí)醇和乙酰輔酶A在醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶（Alcohol acetyltransferase，AATase）的催化作用下生成相應(yīng)的乙酸酯。釀酒酵母細(xì)胞中參與乙酸酯合成的醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶有ATF1和ATF2。有研究證明ATF1對(duì)乙酸酯的生成量影響較大，可通過(guò)調(diào)控ATF1的表達(dá)來(lái)改變乙酸酯的生成量[36]。

中鏈脂肪酸乙酯（MCFAEE），如己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯，是一組廣泛存在于葡萄酒、白蘭地、威士忌、朗姆酒等飲料酒中的重要香氣化合物，具有優(yōu)質(zhì)的花果香和低閾值。MCFAEE是乙醇和中鏈脂肪酸（MCFA）在?；D(zhuǎn)移酶（Acyltransferase）的催化作用下生成。MCFA主要由酵母細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞質(zhì)中脂肪酸合成酶（FASs）復(fù)合體的作用釋放而來(lái)，酰基轉(zhuǎn)移酶主要有乙醇酰基轉(zhuǎn)移酶（Ethylester biosynthesis I，EEB1P）和乙醇己酰轉(zhuǎn)移酶（Ethanol hexanoyl transferase I，EHT1P），分別由EEB1和EHT1編碼。

1.3 發(fā)酵作用影響陳釀香

在葡萄酒陳釀過(guò)程中，既進(jìn)行著葡萄酒與環(huán)境間的物質(zhì)交換，同時(shí)還發(fā)生著氧化與還原、酯化與水解和縮聚等化學(xué)反應(yīng)，使酯類、醇類、醛類、酮類和酸類等香氣物質(zhì)達(dá)到新的平衡，通過(guò)陳釀可以促使葡萄酒色澤穩(wěn)定，口感更加圓潤(rùn)[37]。

1.3.1 氧化、聚合反應(yīng)

在葡萄酒陳釀過(guò)程中，葡萄酒中的單寧與其它多酚類物質(zhì)發(fā)生微氧化和聚合反應(yīng)[38]。單寧及游離花色素苷與乙醛發(fā)生聚合反應(yīng)形成花色素苷-乙醛-單寧聚合物等不同芳香物質(zhì)，有利于顏色穩(wěn)定，從而改善了葡萄酒品質(zhì)[39]。

1.3.2 橡木香氣物質(zhì)的溶解與擴(kuò)散

與橡木相關(guān)的芳香化合物如香草醛、丁子香酚、愈創(chuàng)木酚等200余種香氣物質(zhì)選擇性的在陳釀過(guò)程中轉(zhuǎn)移到葡萄酒中去[40-41]，增加了葡萄酒香氣復(fù)雜性。

1.3.3 酯類的水解與合成反應(yīng)

葡萄酒陳釀階段，酯類物質(zhì)與酸類物質(zhì)之間的平衡對(duì)葡萄酒的感官品質(zhì)影響最大，由發(fā)酵產(chǎn)生的酯在低pH環(huán)境下不斷水解，結(jié)合態(tài)的萜烯類化合物被水解釋放且發(fā)生分子間重排并互相轉(zhuǎn)化，合成C13降異戊二烯類化合物的前體物類胡蘿卜素也在不斷地降解，同時(shí)，葡萄酒中的酸類和乙醇也會(huì)緩慢生成相應(yīng)的酯。

陳釀過(guò)程中，酯類的構(gòu)成和比例會(huì)發(fā)生改變，直鏈脂肪酸乙酯如己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等因揮發(fā)性強(qiáng)，含量會(huì)逐漸降低；支鏈脂肪酸乙酯如琥珀酸乙酯、乳酸乙酯等因揮發(fā)性相對(duì)較差，以及陳釀期間達(dá)到新的酸酯平衡，含量會(huì)上升。對(duì)瓶?jī)?chǔ)1～5年的葡萄酒中乙酯含量變化的研究發(fā)現(xiàn)，酸酯平衡對(duì)乙酯的形成影響較大，且隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，酯化率明顯提高，在陳釀過(guò)程中，葡萄酒中支鏈脂肪酸乙酯（如異丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和異戊酸乙酯）的含量增加；一部分萜烯類化合物在陳釀過(guò)程中也會(huì)發(fā)生改變，香葉醇和橙花醇可以緩慢地轉(zhuǎn)化成芳樟醇和α-萜品醇，橙花叔醇能轉(zhuǎn)化為法尼醇[42]；C13降異戊二烯類化合物如β-大馬士酮和TDN的含量會(huì)隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)而上升[43]，也有研究發(fā)現(xiàn)在陳釀早期β-大馬士酮和3-氧代-α-紫羅蘭酮的含量會(huì)上升，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)而降低[44]。由此可見(jiàn)，葡萄酒在陳釀過(guò)程中也發(fā)生著十分復(fù)雜的反應(yīng)，由發(fā)酵作用產(chǎn)生的醇、酯等，以及發(fā)酵過(guò)程中新形成的萜烯和C13降異戊二烯類化合物會(huì)影響陳釀香的香氣組分和比例。

2 葡萄酒發(fā)酵香氣物質(zhì)調(diào)控

2.1 葡萄酒品種香香氣物質(zhì)釋放調(diào)控

2.1.1 葡萄酒酒精發(fā)酵前處理

葡萄酒酒精發(fā)酵前處理如凍融、遲采、晾曬、浸漬等，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵基質(zhì)的濃度發(fā)生變化，或致使葡萄內(nèi)源酶促反應(yīng)劇烈，或者產(chǎn)生對(duì)葡萄細(xì)胞活體風(fēng)味物質(zhì)代謝的更大刺激，以及增強(qiáng)非釀酒酵母等微生物的作用，從而影響葡萄酒品種香的香氣化合物組分與濃度。

（1）凍融。凍融會(huì)加速葡萄漿果細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的破壞，葡萄內(nèi)源酶與底物結(jié)合從而發(fā)生各種復(fù)雜反應(yīng)[45]，并且在冷凍過(guò)程中，脫水脅迫會(huì)誘導(dǎo)揮發(fā)性化合物合成相關(guān)基因（如LOX、ADH、CCD）的轉(zhuǎn)錄變化[46-47]。在冰酒的釀造過(guò)程中，葡萄果實(shí)經(jīng)過(guò)凍融和脫水，釀造的冰酒中揮發(fā)性酚、內(nèi)酯、β-大馬士酮和苯乙醛的含量比干型葡萄酒更高[48]。

（2）遲采、晾曬。遲采和晾曬會(huì)導(dǎo)致漿果脫水，使葡萄總可溶性固形物的濃度和總酸度增大。延遲采收的果實(shí)所釀造的葡萄酒中，中鏈脂肪酸和乙酸酯含量變低，而γ-壬內(nèi)酯和β-大馬士酮的含量變得更高[49]；葡萄采后經(jīng)脫水處理，利用質(zhì)量損失率20%和30%的果實(shí)釀造葡萄酒，部分揮發(fā)性化合物種類減少，但大馬士酮、橙花醇和1-己醇等化合物的含量有所提高[50]；在室內(nèi)自然通風(fēng)脫水7、14、21 d的‘美樂(lè)’果實(shí)（質(zhì)量相應(yīng)損失10%、20%和27%），其萜烯如α-松油醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮和芳樟醇的濃度增加，這可能是由于脫水促進(jìn)了葡萄中真菌的生長(zhǎng)，使得糖苷態(tài)香氣前體充分釋放[51]。

（3）浸漬。葡萄果實(shí)中香氣物質(zhì)主要位于果皮中，發(fā)酵過(guò)程中浸漬處理利于果皮中香氣物質(zhì)的浸出。浸漬方式按溫度不同分為3種：熱浸漬、常溫浸漬和冷浸漬，其中冷浸漬更有利于萜烯類物質(zhì)的釋放。低溫處理（4、10 ℃）葡萄樣品后進(jìn)行發(fā)酵，使葡萄酒中倍半萜烯普遍增加，推測(cè)低溫誘導(dǎo)了萜類生物合成的關(guān)鍵基因（VvHDR、VvDX3、VvTER、VvGT14）的表達(dá)[52]；在一定范圍內(nèi)，葡萄酒中萜烯類含量的增加與浸漬時(shí)間成正比，在14 ℃下浸漬24 h后萜烯含量最高[53]。近幾年衍生出一些新的浸漬工藝來(lái)替代傳統(tǒng)方法以提高香氣，常用的浸漬新技術(shù)有CO2浸漬法[54]、脈沖電場(chǎng)[55]、閃蒸法[56]和干縮法[57]，均能顯著提升葡萄酒的品質(zhì)。

2.1.2 接種微生物調(diào)控

品種香香氣化合物的種類、含量和組成比例受葡萄品種、生態(tài)環(huán)境、栽培模式和果實(shí)成熟度等因素的影響。目前在葡萄酒實(shí)際生產(chǎn)中，常利用非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵以及乳酸菌（酒酒球菌、植物乳桿菌等）與釀酒酵母混合發(fā)酵來(lái)調(diào)控萜烯類香氣物質(zhì)的含量；而果實(shí)中降異戊二烯類化合物的合成在轉(zhuǎn)錄水平上受前體物質(zhì)類胡蘿卜素含量和CCD家族基因表達(dá)量的調(diào)控，此類物質(zhì)的調(diào)控研究主要集中在產(chǎn)CCDs相關(guān)微生物資源的挖掘方面。

（1）釀酒酵母。根據(jù)最新的分類方法，釀酒酵母屬有23個(gè)種，葡萄酒釀造中常見(jiàn)的釀酒酵母有5個(gè)種：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、貝酵母（Saccharomyces bayanus）、原葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）、巴斯德酵母（Saccharomyces pastorianus）和奇異釀酒酵母（Saccharomyces paradoxus）。大部分釀酒酵母本身并不具有內(nèi)源糖苷酶，僅有少量釀酒酵母能夠表現(xiàn)出糖苷酶活性，從而增加葡萄酒中萜烯含量[58]。提高釀酒酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中對(duì)極端脅迫的抵抗力，對(duì)于有效調(diào)節(jié)和改善香氣化合物的產(chǎn)生至關(guān)重要[59]。

（2）非釀酒酵母。非釀酒酵母（non-Saccharomyces）可以通過(guò)代謝產(chǎn)生糖苷酶和C-S裂解酶，能夠增加葡萄酒中萜烯類、降異戊二烯類、揮發(fā)性硫醇等化合物，提高香氣成分種類和含量，增強(qiáng)葡萄酒的品種香氣和發(fā)酵香氣特征，并且在酒精發(fā)酵后期非釀酒酵母可以通過(guò)細(xì)胞自溶增加氨基酸、脂肪酸、甘露糖蛋白的含量進(jìn)而影響葡萄酒的口感[60-61]。目前，從葡萄汁中分離出來(lái)的非釀酒酵母已超過(guò)40種，常見(jiàn)的非釀酒酵母屬主要包括有孢圓酵母屬（Torulaspora）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、假絲酵母屬（Candida）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、美奇酵母屬（Metschnikowia）、類酵母屬（Saccharomycodes）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）等。由于一般非釀酒酵母的酒精耐受能力較差，酒精轉(zhuǎn)化效率較低，生產(chǎn)上常與釀酒酵母混合（同時(shí)接種和順序接種）發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)干型葡萄酒[61]。

Whitener等[62]使用‘西拉’和‘長(zhǎng)相思’葡萄順序接種非釀酒酵母與釀酒酵母，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母假絲酵母菌、哈薩克斯坦酵母、耐熱克魯維酵母、美極梅奇酵母、戴爾有孢圓酵母、克魯維畢赤酵母均能對(duì)整體香氣有不同程度的貢獻(xiàn)，美極梅奇酵母、假絲酵母等對(duì)葡萄酒發(fā)酵游離萜烯和酯類合成貢獻(xiàn)最為突出。由此可見(jiàn)，不同非釀酒酵母對(duì)葡萄酒風(fēng)味的影響存在明顯差異。周洪江等[63]使用3種非釀酒酵母分別與釀酒酵母混合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)美極梅奇酵母（M.pulcherrima Flavia）使芳樟醇釋放量信號(hào)強(qiáng)度增加1.33倍，戴爾有孢圓酵母（T.delbrueckii Prelude）使α-松油烯的信號(hào)強(qiáng)度增加1.47倍。申靜云等[64]選用非釀酒酵母仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）分別與商業(yè)釀酒酵母DV10混合發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H.opuntiae與DV10同時(shí)接種混合發(fā)酵增加了冰葡萄酒中21.40%的萜烯類物質(zhì)；鐵紅假絲酵母（Candida pulcherrima）與本土釀酒酵母MMf9混合發(fā)酵，增加了α-松油醇、橙花醇、香葉醇的含量[65]；Barbosa等[66]對(duì)葡萄牙葡萄酒產(chǎn)區(qū)美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)該酵母具有較高的β-葡萄糖苷酶活性。

Hu等[67]通過(guò)對(duì)菌株的篩選發(fā)現(xiàn)，葡萄汁有孢漢遜酵母菌株的糖苷酶提取物能夠催化糖苷態(tài)C13降異戊二烯類化合物的釋放，增強(qiáng)了花香、甜味、漿果和堅(jiān)果的香氣特征。尤雅等[68]采用不同接種方式在兩個(gè)溫度（13、23 ℃）下進(jìn)行扁平云假絲酵母（Candida humilis）與釀酒酵母的發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13 ℃時(shí)混合發(fā)酵顯著提高了β-大馬士酮含量，其中同時(shí)接種發(fā)酵增加了26.19%。類似地，與單純的釀酒酵母發(fā)酵相比，使用仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）與商業(yè)釀酒酵母DV10混合發(fā)酵使冰酒中β-大馬士酮含量提高8.85%[64]。

（3）乳酸菌。乳酸菌除了分泌蘋(píng)果酸脫氫酶外，還產(chǎn)生多種胞外酶，如β-葡萄糖苷酶、酯酶、氨基酸脫羧酶、檸檬酸裂解酶、酚酸脫羧酶等[69]，從而增加葡萄酒中萜烯類、硫醇類等物質(zhì)的含量。葡萄酒啟動(dòng)蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵有利于形成柔和的酸度，促進(jìn)花果香氣的釋放，提高葡萄酒香氣的復(fù)雜性。與酵母菌相似，不同屬、種的乳酸菌對(duì)葡萄酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)也有明顯的差異，其中酒球菌屬（Oenococcus）中的酒酒球菌（O.oeni）和乳植桿菌屬（Lactiplantibacillus）的植物乳桿菌（L.plantarum）廣泛應(yīng)用于葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中[70]。

近些年來(lái)，植物乳桿菌憑借其高產(chǎn)酯酶、糖苷酶的潛力，作為酒酒球菌的替代者用于啟動(dòng)葡萄酒的蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵，在葡萄酒香氣、顏色等特征的改變中起重要作用[71]。Iorizzo等[72]從葡萄酒中分離出11株植物乳桿菌，發(fā)現(xiàn)所有菌株在葡萄酒工業(yè)化生產(chǎn)條件下均表現(xiàn)出較強(qiáng)的蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵性能和β-葡萄糖苷酶活性，能夠釋放出檸檬烯、里哪醇等萜烯苷元。Wang等[73]以植物乳桿菌和酒酒球菌為原料，對(duì)‘赤霞珠’葡萄進(jìn)行蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能夠保留更多的香氣成分，表明植物乳桿菌可以作為較好的發(fā)酵劑運(yùn)用于紅葡萄酒生產(chǎn)中。葡萄酒中的酚類物質(zhì)對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)有抑制作用，Devi[74]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酒酒球菌對(duì)酚脅迫的耐受性優(yōu)于植物乳桿菌，但植物乳桿菌具有更多功能的酚類解毒酶系統(tǒng)，可以使酚類化合物降解為揮發(fā)性酚、芳香醇和苯基丙酸。

（4）其它。魏濤等[75]從紅茶中得到一株高效降解β-胡蘿卜素菌株腸桿菌（HC-3），該菌株對(duì)β-胡蘿卜素的降解率達(dá)86.82%，主要降解產(chǎn)物為5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和反式-β-紫羅蘭酮等香味物質(zhì)。龍章德等[76]從煙葉中篩選出能高效降解β-胡蘿卜素的菌株霍氏腸桿菌亞種（Enterobacter hormanii subsp.），用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GCMS）進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其降解的主要產(chǎn)物為β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-環(huán)檸檬醛等香味物質(zhì)。楊小雪等[77]從鐵觀音茶葉中篩選到了3株具有β-胡蘿卜素降解能力的菌株Aspergillus niger、Bacillus velezensis、Saccharopolyspora gregorii，它們的降解率分別為94.54%、72.97%、61.26%，能產(chǎn)生β-紫羅蘭酮等香氣物質(zhì)。

2.2 葡萄酒發(fā)酵香生物合成調(diào)控

葡萄酒發(fā)酵香氣化合物由菌株特性與葡萄汁特性決定，受發(fā)酵環(huán)境因子（溫度、pH、氧濃度、營(yíng)養(yǎng)素）調(diào)控。葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌受不斷變化的環(huán)境條件影響，誘導(dǎo)了2000多個(gè)基因的表達(dá)，涉及數(shù)百個(gè)基因編碼蛋白質(zhì)參與各種細(xì)胞過(guò)程[78]。

2.2.1 醇類化合物合成調(diào)控

高級(jí)醇的生成量受多重因素調(diào)控，酵母發(fā)酵副產(chǎn)物形成的主要因素有酵母菌株、發(fā)酵工藝和果汁類型等[79-80]。

（1）酵母菌株及接種量。不同的釀酒酵母產(chǎn)高級(jí)醇的能力不同，有研究發(fā)現(xiàn)，采用12株不同的釀酒酵母發(fā)酵相同葡萄，所產(chǎn)生的高級(jí)醇含量顯著不同[81]，其中國(guó)產(chǎn)酵母CC17有更高的感官評(píng)價(jià)，這種差異主要取決于酵母細(xì)胞高級(jí)醇脫氫酶（ADH）的活力。在葡萄發(fā)酵過(guò)程中，酵母的接種量對(duì)高級(jí)醇的生成有很大的影響，接種量低時(shí)，酵母的繁殖倍數(shù)會(huì)相應(yīng)增大，高級(jí)醇的含量則會(huì)升高。宋含等[82]發(fā)現(xiàn)，酵母的增值倍數(shù)控制在3～4以內(nèi)為宜，可以減少高級(jí)醇的生成量。

（2）發(fā)酵溫度。發(fā)酵溫度影響釀酒酵母生長(zhǎng)速率和生物量，能夠調(diào)整釀酒酵母次生代謝產(chǎn)物通量。研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵溫度的升高（10、15、20 ℃），異丁醇、異戊醇和苯乙醇的含量逐漸升高[83]。

（3）發(fā)酵醪pH。pH也能影響釀酒酵母生長(zhǎng)速率和生物量。在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，高級(jí)醇的生成量與發(fā)酵液pH具有相關(guān)性，pH越低時(shí)高級(jí)醇的含量也相應(yīng)減少。當(dāng)葡萄酒醪液pH控制在3.6以下時(shí)，高級(jí)醇的生成量最低[84]。

（4）葡萄醪液可同化氮（YAN）。氮素是影響微生物生長(zhǎng)的常見(jiàn)因素，YAN的種類及比例影響釀酒酵母生長(zhǎng)代謝及發(fā)酵產(chǎn)物含量。適宜的α-氨基氮含量會(huì)使高級(jí)醇生成量保持較低的水平，當(dāng)α-氨基氮含量過(guò)低時(shí)，酵母為滿足自身生長(zhǎng)所需會(huì)不斷的通過(guò)糖代謝合成氨基酸，進(jìn)而形成更多的中間體α-酮酸，當(dāng)α-氨基氮含量過(guò)高時(shí)，酵母增殖倍數(shù)加大，從而導(dǎo)致代謝副產(chǎn)物增多；Liu等[85]發(fā)現(xiàn)，不同YAN能改變高級(jí)醇合成相關(guān)基因的表達(dá)，當(dāng)NH4Cl添加量為200 mg·L-1時(shí)，總高級(jí)醇含量減少了39%，且對(duì)高級(jí)醇含量的控制更有效，因此在葡萄酒生產(chǎn)中根據(jù)實(shí)際情況考慮添加YAN。

（5）葡萄醪液糖濃度。低濃度的糖會(huì)使高級(jí)醇前體物質(zhì)α-酮酸產(chǎn)生減少，對(duì)高級(jí)醇的脫氨基作用也不強(qiáng)烈，因此葡萄酒發(fā)酵可以采取分批補(bǔ)糖的方式來(lái)控制高級(jí)醇的生成量[80]。

2.2.2 酯類化合物合成調(diào)控

酯的產(chǎn)生受底物和酶活性的影響。對(duì)于乙酸酯的形成，乙酰輔酶A和高級(jí)醇的濃度是重要限制因素。有研究表明，乙酰輔酶A的通量受溫度、脂肪酸、氮源和氧的影響，這些因素在促進(jìn)酵母生長(zhǎng)的同時(shí)也能促進(jìn)乙酰輔酶A的利用，使較少的乙酰輔酶A用于酯的生產(chǎn)；另外，可利用基因工程、蛋白質(zhì)工程過(guò)表達(dá)ATF1或敲除競(jìng)爭(zhēng)抑制途徑的相關(guān)基因，提高乙酸酯的含量[86-87]。

中鏈脂肪酸的存在形式是影響乙酯類化合物含量的主要因素，通過(guò)對(duì)脂肪酸從頭合成關(guān)鍵基因（ACC1、FAS1、硫酯酶編碼基因）的強(qiáng)化可達(dá)到提高M(jìn)CFAEE生成量的目的，這些基因的表達(dá)量與酵母細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，同樣受溫度、脂肪酸、氮源和氧的調(diào)控[88-89]。所以通過(guò)調(diào)控葡萄發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母生物量、比生長(zhǎng)率和時(shí)序壽命，可以實(shí)現(xiàn)調(diào)控脂肪酸合成水平進(jìn)而提高乙酯含量的目的。

（1）發(fā)酵溫度。發(fā)酵溫度通過(guò)影響酵母生長(zhǎng)速率和生物量從而顯著影響脂質(zhì)代謝，在13 ℃和25 ℃發(fā)酵條件下，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)釀酒酵母顯著差異表達(dá)的535個(gè)基因中，在25 ℃時(shí)與胞質(zhì)脂肪酸合成有關(guān)的幾個(gè)基因下調(diào)；而在13 ℃時(shí)與線粒體短鏈脂肪酸合成有關(guān)的基因上調(diào)，更有利于乙酯的積累。Schwinn等[90]研究了‘雷司令’發(fā)酵過(guò)程中3個(gè)不同溫度下對(duì)酵母生長(zhǎng)、揮發(fā)物等的影響，結(jié)果顯示，大多數(shù)酯的形成在較高溫度下的發(fā)酵后半段更為明顯，在19 ℃發(fā)酵時(shí)，癸酸乙酯、辛酸乙酯和己酸乙酯的終濃度最大。所以，溫度可以通過(guò)影響脂肪酸合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)影響MCFAEE產(chǎn)量。

（2）脂肪酸。不飽和脂肪酸（UFAs）是釀酒酵母生長(zhǎng)繁殖的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在發(fā)酵過(guò)程中，釀酒酵母主要從葡萄汁中獲得UFAs[91]。在發(fā)酵培養(yǎng)基脂質(zhì)組成（葡萄汁與合成葡萄汁）對(duì)酒中揮發(fā)性成分影響的研究中發(fā)現(xiàn)，兩者完成發(fā)酵的時(shí)間分別為14、25 d，葡萄汁更快完成發(fā)酵且積累的揮發(fā)性化合物濃度更高，其辛酸乙酯的含量是合成葡萄汁發(fā)酵的兩倍[92]。這與合成葡萄汁中缺乏UFAs等生長(zhǎng)因子、厭氧條件下限制了酵母菌生長(zhǎng)有關(guān)。同時(shí)，在發(fā)酵過(guò)程中添加外源中鏈脂肪酸（如己酸、辛酸）也能顯著提高乙酯類化合物的含量[93]。

（3）氮源。在發(fā)酵過(guò)程中，低氮脅迫下酯類的總量降低，在500 mg·L-1以內(nèi)，酯類生成量與葡萄汁可同化氮水平成正比[94]。當(dāng)向初始YAN為250 mg·L-1的葡萄汁中添加磷酸氫二銨（DAP）時(shí)，脂肪酸乙酯的含量升高，乙酸酯含量卻無(wú)顯著差異，表明氮的利用也具有菌株特異性[95]。

（4）氧氣。氧氣是葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中十分重要的因素，葡萄酒發(fā)酵并非絕對(duì)厭氧發(fā)酵，酵母菌脂肪酸代謝是在有氧條件下進(jìn)行的，微量氧氣可以促進(jìn)酵母菌次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)量。Snoek等[96]分別在需氧和厭氧條件下培養(yǎng)酵母菌，轉(zhuǎn)錄組分析表明，在500多個(gè)差異代謝基因中只有23個(gè)是厭氧菌生長(zhǎng)所特有的，這23個(gè)基因影響著酵母菌在缺氧條件下的存活，其關(guān)鍵作用機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

酯類物質(zhì)作為酵母的次生代謝產(chǎn)物，其代謝還受葡萄品種與成熟度[97-99]、發(fā)酵方式、酵母菌種、陳釀方式等[100-102]的調(diào)控，而針對(duì)這些調(diào)控，前人已作了詳細(xì)的論述[103-104]。近幾年來(lái)幾項(xiàng)關(guān)于氧化還原電位（ORP）的研究證明，ORP有潛力作為一個(gè)新的觀測(cè)量實(shí)現(xiàn)香氣物質(zhì)的監(jiān)測(cè)與調(diào)控。Xue等[105]揭示了在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中ORP與MCFAEE生成量的關(guān)系；Nelson等[106]在對(duì)小規(guī)模（10 L）、中規(guī)模（1500 L）和大規(guī)模（10 000 L）葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中ORP的控制進(jìn)行了演示，將ORP控制在-40 mV，可實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中香氣化合物的調(diào)控；在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中利用ORP作為曝氣定時(shí)開(kāi)關(guān)，最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)酯類物質(zhì)生成量的控制[107]。葡萄汁ORP反應(yīng)了溶氧量、溫度、pH、基質(zhì)組分特性與濃度的關(guān)系，通過(guò)調(diào)控ORP可以影響細(xì)胞內(nèi)NAD(P)/NAD(P)H平衡和MCFAEE代謝相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而影響釀酒酵母碳通量分布。這為實(shí)現(xiàn)在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)調(diào)控酯類化合物的合成提供了新的思路。

綜上，葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中采用適度低溫、適當(dāng)溶氧和控制葡萄汁脂質(zhì)、適量可同化氮，提高細(xì)胞群體峰高和細(xì)胞時(shí)序壽命，降低細(xì)胞比生長(zhǎng)率，可以達(dá)到提高酯類物質(zhì)產(chǎn)量的目的。

2.3 葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中香氣物質(zhì)轉(zhuǎn)移的控制

葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，醪液香氣化合物的濃度取決于葡萄原料和微生物代謝通量，還會(huì)隨CO2的排出而發(fā)生揮發(fā)損失。發(fā)酵溫度對(duì)香氣揮發(fā)損失的影響比對(duì)香氣合成產(chǎn)生的影響更為顯著。在30 ℃發(fā)酵時(shí)，己酸乙酯的損失高達(dá)70%[108]。因此，有釀酒師在低溫條件下（8～12 ℃）進(jìn)行發(fā)酵以減少香氣損失來(lái)改善葡萄酒的香氣特征[29]，但引發(fā)了發(fā)酵周期增長(zhǎng)、發(fā)酵不徹底的現(xiàn)象。在發(fā)酵過(guò)程中的氣液傳遞方面已有大量研究，也有多種技術(shù)用來(lái)減少芳香損失，但其中一些可能會(huì)對(duì)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生負(fù)面影響，如能量消耗過(guò)大而增加了生產(chǎn)成本，或增加停滯發(fā)酵的風(fēng)險(xiǎn)[109]。Breniaux等[110]發(fā)現(xiàn)，在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中利用膜接觸器進(jìn)行氣液傳遞，可以溶解CO2并能去除O2，從而提升葡萄酒的質(zhì)量；Diban等[111]基于膜分離技術(shù)提出一種蒸發(fā)滲透萃取技術(shù)，可以明顯減少芳香化合物的損失；然而目前來(lái)看，降低溫度是最大限度減少香氣損失的有效方法，探尋更為有效地控制葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中香氣物質(zhì)轉(zhuǎn)移的方法將會(huì)是一個(gè)熱點(diǎn)。

3 總結(jié)與展望

葡萄酒香氣物質(zhì)組成和來(lái)源非常復(fù)雜，香氣質(zhì)量受多種因素影響。以葡萄香氣糖苷、類胡蘿卜素等香氣前體物水解、裂解為靶標(biāo)的生物催化資源（非釀酒酵母、乳酸菌等）的挖掘與催化機(jī)制、催化技術(shù)研究；以特征發(fā)酵香香氣化合物定向合成為目的的調(diào)控技術(shù)研究；以提高葡萄酒產(chǎn)品整體質(zhì)量和開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品為目的的葡萄酒酒精發(fā)酵前處理原理、方法、技術(shù)研究；以降低葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中香氣損失為目的的方法、技術(shù)研究等，是當(dāng)前葡萄酒香氣發(fā)酵調(diào)控研究的重點(diǎn)。葡萄酒發(fā)酵合成生物研究或成為未來(lái)的研究熱點(diǎn)，合成生物有望成為葡萄酒香氣調(diào)控的有效工具。