張翔翔 何娜 何佳玲 呂志剛

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金華醫(yī)院 金華市中心醫(yī)院眼科 金華 321000）

后發(fā)性白內(nèi)障(posterior capsule opacification，PCO)，又稱后囊膜混濁，是白內(nèi)障術(shù)后一種主要的遠(yuǎn)期并發(fā)癥。目前，國(guó)內(nèi)外預(yù)防PCO 發(fā)生的研究主要是通過(guò)提高手術(shù)技術(shù)、優(yōu)化人工晶狀體設(shè)計(jì)及藥理學(xué)方法等[1-2]，但這些方法都無(wú)法安全、有效地預(yù)防遠(yuǎn)期PCO。我們前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，在兔后囊膜混濁晶狀體上皮細(xì)胞中存在端粒酶活性，端粒酶的激活使端粒長(zhǎng)度不斷延長(zhǎng)，細(xì)胞獲得無(wú)限增殖的能力。通過(guò)抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)活性降低端粒酶活性，可以抑制端粒長(zhǎng)度的延長(zhǎng)[4]。我們提出假說(shuō)：以端粒酶活性高度相關(guān)的催化亞基TERT 作為靶點(diǎn)，通過(guò)小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染，降低晶狀體上皮細(xì)胞端粒酶活性，能夠抑制PCO 的發(fā)生。為觀察靶向TERT 基因siRNA 對(duì)PCO 的抑制作用，初步探討靶向TERT 基因siRNA 眼內(nèi)應(yīng)用的安全性及有效性，我們進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)健康新西蘭大白兔20只[采購(gòu)于杭州余杭科聯(lián)兔業(yè)專業(yè)合作社，許可證號(hào)：SCXK(浙)2017-0004]，3～4 月齡，雌雄不限，體重2.2～2.5 kg，實(shí)驗(yàn)前未經(jīng)任何處理，眼部檢查無(wú)異常。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水，保持動(dòng)物房室溫(25±2)℃，通風(fēng)良好。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

靶向TERT 基因siRNA 重組腺病毒(TERT-siRNAAdv)( 蘇州吉瑪基因股份有限公司)，序列為GCTGTTCAGCGTGCTCAATTA；戊巴比妥鈉、注射用苯巴比妥鈉(福建閩東力捷迅藥業(yè))；醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠，0.5 mL/支(上海齊勝生物制劑有限公司)；妥布霉素地塞米松滴眼液(Alcon 公司，美國(guó))；手術(shù)顯微器械(江蘇明仁醫(yī)美器械)；手術(shù)顯微鏡、眼前段照相儀(北京天諾翔科學(xué)儀器有限公司)；超聲乳化儀(pulsar，Optikon 公司，意大利)；手持裂隙燈顯微鏡(PSL Classic，keeler 公司，英國(guó))；手持眼壓計(jì)(PRO，icare 公司，芬蘭)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將20 只新西蘭大白兔采用自身對(duì)照方法，分為2 組，其中以右眼作為T(mén)ERT-siRNA-Adv 組(實(shí)驗(yàn)組)，左眼作為陰性對(duì)照腺病毒Adv 組(對(duì)照組)，每組20 眼。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師完成所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所有眼別的手術(shù)。術(shù)前復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴眼3 次，苯巴比妥鈉(1 mL/kg)+戊巴比妥鈉(12.5 mg/kg)經(jīng)兔耳緣靜脈進(jìn)行注射麻醉，行角膜切口后環(huán)形撕囊，直徑約5 mm，水分層，超聲乳化吸除晶狀體，角膜切口縫合1 針。術(shù)畢實(shí)驗(yàn)組前房?jī)?nèi)注入滴度為109PFU/mL 的TERT-siRNA-Adv 0.1 mL，對(duì)照組前房?jī)?nèi)注入滴度為109PFU/mL 的陰性對(duì)照Adv 0.1 mL。術(shù)后使用妥布霉素地塞米松滴眼液滴眼(每天4 次)，復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴眼(每天2 次)，均使用2 周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 常規(guī)檢查

分別于術(shù)前，術(shù)后第1 天、1 周、2 周、4 周，用手持眼壓計(jì)行眼壓檢查，測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的眼壓；用手持裂隙燈顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組角膜水腫、前房閃輝的情況。角膜水腫分級(jí)[5]：0 級(jí)為角膜透明；1 級(jí)為角膜薄霧狀水腫，內(nèi)皮面光滑，虹膜紋理尚清晰；2 級(jí)為角膜淺灰色水腫，內(nèi)皮面粗糙，虹膜紋理模糊；3 級(jí)為角膜彌漫性灰白色水腫，內(nèi)皮面龜裂狀，虹膜紋理視不清；4 級(jí)為角膜乳白色，眼內(nèi)結(jié)構(gòu)看不清。前房閃輝分級(jí)[6]：0 級(jí)為前房無(wú)閃輝；l 級(jí)為微弱的前房閃輝；2 級(jí)為中等程度前房閃輝，虹膜紋理可以辨別；3 級(jí)為虹膜紋理和晶狀體輪廓難以辨認(rèn)；4 級(jí)為眼內(nèi)結(jié)構(gòu)不可辯，房水呈凝固狀態(tài)，伴有大量纖維素性滲出。

1.4.2 后囊膜混濁檢查

落實(shí)建筑行業(yè)項(xiàng)目管理機(jī)制，綜合考慮項(xiàng)目登記的建筑業(yè)工程，能夠準(zhǔn)確掌握建筑項(xiàng)目的進(jìn)度，并對(duì)項(xiàng)目本身的申報(bào)納稅狀況以及開(kāi)具發(fā)票的情況進(jìn)行有效監(jiān)控。但是，增值稅管理模式是將納稅人作為主體，綜合考慮機(jī)構(gòu)所在區(qū)域的納稅基本原則，而所在區(qū)域的國(guó)稅機(jī)關(guān)要負(fù)責(zé)構(gòu)建相應(yīng)的監(jiān)控機(jī)制。但這種方式已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了現(xiàn)階段增值稅管理的范圍，直接增加了稅務(wù)機(jī)關(guān)的工作難度，很難對(duì)異地工程項(xiàng)目信息進(jìn)行有效掌握，進(jìn)而引發(fā)了虛開(kāi)發(fā)票或增加了稅源流失風(fēng)險(xiǎn)，直接制約了建筑行業(yè)稅收征管工作的開(kāi)展。

于術(shù)后第1 周、2 周、3 周及4 周用手持裂隙燈顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的后囊膜混濁情況，于術(shù)后第4 周用眼前段照相儀行后囊膜照相，觀察并評(píng)價(jià)后囊膜混濁分級(jí)情況。后囊膜混濁分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]：0 級(jí)為后囊膜無(wú)混濁；1 級(jí)為后囊膜輕度混濁并眼底可看清；2 級(jí)為中度混濁并眼底僅可看清部分結(jié)構(gòu)；3 級(jí)為重度混濁且無(wú)法看清眼底。

1.4.3 眼內(nèi)組織病理檢查

術(shù)后第4 周空氣栓塞法處死兔子，摘取術(shù)眼用4%甲醛溶液固定3～5 d，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯清洗，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，無(wú)水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、蒸餾水各15 min，蘇木精染色5 min，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸乙醇分化30 s，自來(lái)水浸泡15 min，置伊紅液3～5 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察角膜、后囊膜、虹膜的各層組織結(jié)構(gòu)情況。

1.4.4 Western blot 法檢測(cè)

術(shù)后第4 周空氣栓塞法處死兔子，獲取后囊膜組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液洗滌3 次，制取小片標(biāo)本，加入含有PMSF 的RIPA 裂解液200 μL，10 000 轉(zhuǎn)/ min，離心5 min。收集上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，分裝于EP 管中。每個(gè)樣品通過(guò)SDSPAGE 分離并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，在室溫下將膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，添加一抗后在4 ℃下孵育過(guò)夜，添加二抗后在室溫下孵育2 h。使用ECL 試劑盒測(cè)定免疫反應(yīng)性，并用ChemiDoc XRS 系統(tǒng)測(cè)定蛋白條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計(jì)。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩胤讲罘治鰧?duì)手術(shù)前后同組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)2 組組間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較；等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼壓及眼前段反應(yīng)情況

2.1.1 眼壓

2組兔子術(shù)前眼壓：實(shí)驗(yàn)組為(11.70±2.23)mmHg，對(duì)照組為(11.96±1.97)mmHg，2 組間術(shù)前眼壓比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.391，P=0.698)。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后眼壓：術(shù)后第1 天為(19.28±5.38)mmHg，術(shù)后第1 周為(13.72±4.56)mmHg，術(shù)后第4 周為(12.14±3.94)mmHg，對(duì)照組同期眼壓為(18.83±3.36)、(12.62±4.53)及(12.17±3.29)mmHg，術(shù)后同期2 組間眼壓比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.321，P=0.750；t=0.762，P=0.451；t=-0.026，P=0.979)。2 組組內(nèi)比較：術(shù)后第1 天眼壓均升高，與術(shù)前眼壓比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而術(shù)后第1 周眼壓較術(shù)前眼壓均偏高，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)后均出現(xiàn)不同程度的角膜水腫。2 組均在術(shù)后第1 天角膜水腫最明顯，分級(jí)最高達(dá)3 級(jí)，未見(jiàn)4 級(jí)角膜水腫表現(xiàn)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，2 組角膜水腫均逐漸減輕，至術(shù)后第1 周，大部分角膜恢復(fù)透明。2 組間角膜水腫分級(jí)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 2組術(shù)后角膜水腫分級(jí)比較

2.1.3 前房閃輝分級(jí)

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)后均出現(xiàn)不同程度的前房閃輝，分級(jí)最高達(dá)4 級(jí)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，2 組前房閃輝均逐漸減輕，至術(shù)后第1 周，大部分兔子的前房閃輝均消失。2 組間前房閃輝分級(jí)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 2組術(shù)后前房閃輝分級(jí)比較

2.1.4 PCO 分級(jí)

術(shù)后擴(kuò)瞳后手持裂隙燈觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組后囊膜混濁情況，并用眼前段照相儀行后囊膜照相。2組后囊膜于術(shù)后第2 周開(kāi)始出現(xiàn)輕微混濁，無(wú)明顯機(jī)化情況，眼底觀察清晰(圖1A)。術(shù)后第4 周，2組后囊膜出現(xiàn)不同程度增殖樣改變，實(shí)驗(yàn)組PCO 程度分布于1 級(jí)和2 級(jí)(圖1B 和C)，而對(duì)照組多分布于2 級(jí)和3 級(jí)(圖1C 和D)，對(duì)照組PCO 程度重于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

圖1 2 組術(shù)后第4 周PCO 不同分級(jí)表現(xiàn) A.PCO 0 級(jí)：后囊膜中央?yún)^(qū)透明，周邊散在增殖；B.PCO 1 級(jí)：中央?yún)^(qū)散在增殖，周邊條帶狀增殖；C.PCO 2 級(jí)：后囊膜中央?yún)^(qū)多處條帶狀增殖；D.PCO 3 級(jí)：中央?yún)^(qū)大片狀增殖灶。

表4 2 組術(shù)后第4 周PCO 分級(jí)比較

2.1.5 術(shù)后眼內(nèi)組織病理學(xué)檢查

術(shù)后第4 周眼內(nèi)各組織病理檢查，光鏡下見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組后囊膜下的上皮細(xì)胞分布均勻，排列規(guī)整，無(wú)明顯或少量成纖維細(xì)胞增殖(圖2A)；對(duì)照組后囊膜細(xì)胞增生反應(yīng)明顯，多層成纖維細(xì)胞增殖，排列緊密，囊膜結(jié)構(gòu)紊亂(圖2B)。試驗(yàn)組與對(duì)照組的角膜、虹膜各層組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)明顯水腫，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2C～F)。

2.1.6 Western 印跡法檢測(cè)α-SMA 表達(dá)

Western 印跡法檢測(cè)可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組后囊膜細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)條帶明顯變細(xì)，表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱(圖3)；實(shí)驗(yàn)組α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯減少，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖3 Western 印跡法檢測(cè)的細(xì)胞中α-SMA 蛋白表達(dá) α-SMA為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；α-Tubulin 為α-微管蛋白。

圖4 2 組后囊膜細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，*示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

近十余年來(lái)，隨著我國(guó)人口老齡化，接受白內(nèi)障手術(shù)的人數(shù)逐年增加，手術(shù)有效率愈發(fā)被重視，PCO 也被逐漸重視。PCO 又稱后囊膜混濁，是白內(nèi)障術(shù)后一種主要的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，是患者遠(yuǎn)期視力下降和再失明等視覺(jué)障礙的主要原因[8-10]。Nd：YAG激光后囊切開(kāi)可以消除后囊膜光學(xué)區(qū)混濁，是目前治療PCO 引起視覺(jué)質(zhì)量下降的主要治療手段[11]。雖然該技術(shù)簡(jiǎn)便、高效且耗時(shí)短，但可能產(chǎn)生黃斑囊樣病變、視網(wǎng)膜脫離、繼發(fā)性高眼壓等并發(fā)癥，且有損傷人工晶狀體可能[12]。因此，對(duì)于PCO 的預(yù)防比治療更為重要。

PCO 的發(fā)生機(jī)制主要是白內(nèi)障手術(shù)后殘留晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cell，LEC)的遷移和增殖，及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)分化為成纖維細(xì)胞和晶狀體纖維樣細(xì)胞引起的[9-10]。因此，目前預(yù)防PCO 發(fā)生的研究主要集中在白內(nèi)障術(shù)中清除殘余LEC 或抑制LEC 增殖。在臨床研究中，通過(guò)提高手術(shù)技術(shù)[13]、人工晶體設(shè)計(jì)[14-15]及囊袋張力環(huán)運(yùn)用[16]等方法來(lái)嘗試預(yù)防PCO；在實(shí)驗(yàn)室研究中，更多的抗代謝藥物[17-18]及基因療法[19]，被用以防治PCO；但這些方法需考慮人工晶狀體穩(wěn)定性、藥物毒性、缺乏靶向性等方面風(fēng)險(xiǎn)，都無(wú)法安全、有效地預(yù)防遠(yuǎn)期PCO。

端粒位于真核細(xì)胞染色體的末端，與端粒結(jié)合蛋白一起保持染色體的完整性和控制細(xì)胞分裂周期，隨著細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)行，端粒的長(zhǎng)度不斷縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞的衰老死亡[20]。端粒酶是一種能延長(zhǎng)端粒末端的核蛋白酶，以自身的 RNA 為模板，合成端粒重復(fù)序列，使端粒維持。端粒酶的激活使端粒長(zhǎng)度不斷延長(zhǎng)，細(xì)胞獲得異常增殖的能力，成為永生化細(xì)胞。人TERT 是端粒酶的催化亞單位，TERT mRNA 表達(dá)受到嚴(yán)格控制。因此，TERT 是決定端粒酶活性的限速?zèng)Q定因子[21]。大多數(shù)癌細(xì)胞通過(guò)激活或上調(diào)正常沉默的TERT 基因來(lái)調(diào)控端粒酶活性，從而實(shí)現(xiàn)增殖不朽[22]。我們的前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，兔晶狀體赤道部囊膜組織、混濁后囊膜晶狀體上皮細(xì)胞中均存在端粒酶活性；與Colitz等[23]研究相似，在正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的晶狀體上皮細(xì)胞中可檢測(cè)出端粒酶活性，而白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞中的端粒酶活性和端粒長(zhǎng)度明顯大于正常組。因此，我們推測(cè)手術(shù)、炎癥等刺激因素可以上調(diào)TERT 來(lái)激活端粒酶活性，調(diào)控LEC 的增殖。

抑制TERT 的表達(dá)可以抑制端粒酶的活性，達(dá)到直接或間接參與調(diào)控細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)。通過(guò)基因靶向干擾技術(shù)，沉默TERT 基因，調(diào)控端粒酶表達(dá)，已經(jīng)在一些疾病中得到一些成果。在臨床研究中抑制TERT 基因：可以抑制CNE-2R 細(xì)胞增殖，增強(qiáng)鼻咽癌放療敏感性[24]；可以協(xié)同抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞增殖并加速細(xì)胞凋亡[25]；可以抑制腎細(xì)胞癌、食管鱗癌等的細(xì)胞活力和遷移[26-27]。為了解抑制TERT 基因與PCO 關(guān)系，我們以端粒酶活性高度相關(guān)的催化亞基TERT 作為靶點(diǎn)，通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染，在術(shù)后第4 周，觀察到實(shí)驗(yàn)組兔子的后囊膜混濁程度輕于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在術(shù)后第4 周，行后囊膜組織病理檢查，見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組后囊膜下的上皮細(xì)胞分布均勻，少量成纖維細(xì)胞增殖，對(duì)照組后囊膜多層成纖維細(xì)胞增殖，排列緊密，囊膜結(jié)構(gòu)紊亂。α-SMA 在EMT 過(guò)程中被激活表達(dá)，改變了原有的LEC 生物學(xué)狀態(tài)，使其出現(xiàn)異常的增生、遷移和纖維化，參與PCO 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[28-29]，可以將α-SMA 作為L(zhǎng)EC 增殖的標(biāo)志物，是PCO 進(jìn)展的重要觀察指標(biāo)。我們通過(guò)Western 印跡法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組α-SMA 相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，表明實(shí)驗(yàn)組LEC 的增殖活性及PCO 程度均低于對(duì)照組。因此，我們認(rèn)為靶向抑制TERT 表達(dá)，可以降低LEC 端粒酶活性，從而抑制LEC 的遷移與增殖，達(dá)到抑制早期PCO 發(fā)生的作用。

在正常人體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到嚴(yán)格調(diào)控，只有在癌細(xì)胞、干細(xì)胞和生殖細(xì)胞中才能檢測(cè)到具有活性的端粒酶[22]。已有研究[23,30]證明，眼內(nèi)晶狀體纖維細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、睫狀體無(wú)色素細(xì)胞中均未發(fā)現(xiàn)端粒酶表達(dá)。故通過(guò)靶向TERT-siRNA 抑制LEC 端粒酶活性方法，理論上對(duì)眼內(nèi)其他組織細(xì)胞應(yīng)不會(huì)產(chǎn)生損害。本實(shí)驗(yàn)siRNA的載體所用為重組腺病毒(Adv)，已去除EI 區(qū)，不產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒，無(wú)法在體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，生物安全性高。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果：術(shù)后第1 天及第1 周、2組間的角膜水腫與前房閃輝比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在術(shù)后第1 周時(shí)2 組的角膜水腫與前方閃輝均大部分恢復(fù)正常；術(shù)后第4 周，2 組的角膜、虹膜組織病理檢查見(jiàn)各層組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)明顯水腫，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。我們認(rèn)為，以重組腺病毒為載體的靶向TERT-siRNA 對(duì)眼前段其他組織無(wú)明顯毒性作用，是一種安全的基因干擾技術(shù)。

因此，靶向TERT 基因siRNA 通過(guò)下調(diào)TERT表達(dá)，抑制LEC 端粒酶活性，可有效抑制LEC 的增殖與遷移，抑制兔早期PCO 的發(fā)生，且對(duì)眼前段各組織無(wú)明顯毒性作用，為基因預(yù)防及藥物治療PCO 提供了研究方向。由于實(shí)驗(yàn)條件所限，本實(shí)驗(yàn)尚有不足之處，如觀察時(shí)間較短，缺乏視網(wǎng)膜組織病理學(xué)檢查、組織細(xì)胞凋亡情況，以及未對(duì)LEC 增殖進(jìn)行多因素定量研究。其遠(yuǎn)期效果及局部安全性有待進(jìn)一步研究觀察。