唐鑫鑫,鄭炬梅,駱 娜,營(yíng) 凡,朱 丹,李 森,劉大偉,安炳星,文 杰, 趙桂蘋*,李和剛

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,青島 266109;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193; 3.佛山市高明區(qū)新廣農(nóng)牧有限公司,佛山 528000)

隨著肉雞養(yǎng)殖規(guī)?；图s化的發(fā)展,商業(yè)化肉雞的選育目標(biāo)逐漸變?yōu)樯L(zhǎng)周期短、增重快、生產(chǎn)性能顯著提高,這給腿部骨骼尚未發(fā)育完全的肉雞帶來(lái)健康隱患的同時(shí)還導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂。這些問題使得我國(guó)肉雞腿病發(fā)生率顯著上升,整體可高達(dá)2.07%[1],嚴(yán)重影響了肉雞養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益和動(dòng)物福利[2-3]。在肉雞腿病中,跛足病約占60%,已被認(rèn)為是造成禽肉行業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要原因之一[4]。肉雞骨骼腿病發(fā)生原因錯(cuò)綜復(fù)雜,如生長(zhǎng)速度、機(jī)體吸收代謝、飼養(yǎng)管理方式、光照時(shí)間等均會(huì)導(dǎo)致腿病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。而大多數(shù)影響跛足和腿部畸形的非傳染性原因與骨代謝紊亂有關(guān),伴隨著骨骼變小、骨密度和骨強(qiáng)度降低[5]。有研究發(fā)現(xiàn),雄性肉雞比雌性生長(zhǎng)速度更快、腿病的發(fā)生率高出兩倍、行走能力也更差[6],也有研究表明肉雞腿病可遺傳[7-9],其遺傳力在0.10～0.40之間[10-12]。因此,通過遺傳選擇手段能有效降低肉雞腿病發(fā)生率,為肉雞育種工作打下基礎(chǔ)。

隨著基因芯片測(cè)序技術(shù)的日漸成熟,全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)技術(shù)作為一種識(shí)別遺傳區(qū)域和性狀間關(guān)聯(lián)的無(wú)假設(shè)方法,可用于鑒定與復(fù)雜疾病或性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP),挖掘與表型性狀變異相關(guān)的基因,已被廣泛使用于人類和畜禽的研究中[13-15]。在人類骨質(zhì)疏松癥的研究中,已經(jīng)通過GWAS發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與骨骼生物學(xué)和代謝相關(guān)的基因,其中一些基因位點(diǎn)的突變或多態(tài)性變異與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)[16-17];Guo等[18]通過對(duì)哈伯德肉雞樣本進(jìn)行雙重基因分型測(cè)序(double-digest genotyping by sequencing, ddGBS),鑒定出5個(gè)顯著單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn)和70個(gè)候選基因作為肉雞肢體內(nèi)外翻畸形(valgus-varus deformity, VVD)的潛在標(biāo)記;Li等[19]將GWAS和選擇特征分析(固定指數(shù)值和核苷酸多樣性比率)相結(jié)合,發(fā)現(xiàn)與骨性狀相關(guān)的顯著SNPs主要集中在雞1、4和27號(hào)染色體上,確定了21個(gè)可能調(diào)控雞骨生長(zhǎng)發(fā)育的候選基因。肉雞腿病發(fā)生一直以來(lái)是家禽生產(chǎn)中的重大難題,因其發(fā)生原因極其復(fù)雜,目前尚不清楚確切的發(fā)生原因和遺傳機(jī)制。因此,本研究采用我國(guó)自主研發(fā)的“京芯一號(hào)”55K SNP基因芯片,對(duì)我國(guó)自主培育的“廣明2號(hào)”白羽肉雞多個(gè)群體共2 331只白羽肉雞進(jìn)行基因組測(cè)序,通過GWAS技術(shù)鑒定與肉雞腿病發(fā)生相關(guān)的遺傳位點(diǎn)和候選基因,闡明肉雞腿病發(fā)生的機(jī)理和遺傳基礎(chǔ),為肉雞腿部疾病的發(fā)病機(jī)制提供更為科學(xué)合理的解釋。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

本次試驗(yàn)采用我國(guó)自主培育的“廣明2號(hào)”白羽肉雞A、B、C、D這4個(gè)資源群體,各有1 321、711、264、35只不同世代和批次共2 331只公雞個(gè)體,所有肉雞均在相同環(huán)境條件下以雙層單籠飼養(yǎng)條件管理,采用自由采食、飲水和一般免疫程序(中國(guó)肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn),NY 33-2004)。在肉雞自然生長(zhǎng)狀態(tài)下,于42日齡時(shí)通過翅間靜脈穿刺采集2 mL血液于EDTA抗凝管中,-20 ℃保存用于后續(xù)DNA測(cè)序。

1.2 表型測(cè)定

有研究表明,肉雞脛骨彎曲更容易出現(xiàn)畸形和病變,增加跛足甚至腿病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[20]。于是本研究通過X光測(cè)定肉雞42日齡時(shí)腿部健康狀況及骨骼具體形態(tài),將脛骨形變角度≤10°個(gè)體作為健康組,定義為0;形變角度>10°個(gè)體作為患病組,定義為1,具體測(cè)定方法和儀器均參照Z(yǔ)heng等[21]的研究。

1.3 DNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

本研究采用磁珠法提取肉雞血液基因組DNA。步驟如下:1)使用dsDNA Fragmentase對(duì)DNA樣品進(jìn)行酶切,以實(shí)現(xiàn)片段化并修復(fù)酶切末端。2)通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),確認(rèn)在300～500 bp范圍內(nèi)存在明顯的亮帶,從而選取效果良好的樣品進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。3)使用連接酶將測(cè)序接頭與片段化DNA連接,并利用磁珠對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行純化。4)運(yùn)用PCR對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增,并使用磁珠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行片段篩選。篩選后的片段產(chǎn)物經(jīng)過Qubit熒光定量?jī)x檢測(cè)濃度,2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)片段大小,并通過Qsep400生物分析儀進(jìn)一步核準(zhǔn)文庫(kù)片段大小,僅對(duì)質(zhì)控合格的樣品進(jìn)行后續(xù)文庫(kù)制備。

1.4 基因分型和質(zhì)量控制

采用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所研發(fā)的“京芯一號(hào)”55K SNP芯片對(duì)2 331只肉雞質(zhì)控合格的血液樣品進(jìn)行基因分型[22],由北京康普森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)定。通過plink(Plink v1.90)軟件對(duì)所有個(gè)體分型后得到的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行共有位點(diǎn)合并,再嚴(yán)格按照最小等位基因頻率≥5%、基因分型率≥90%的位點(diǎn)以及個(gè)體分型率≥90%的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)控,剔除不符合要求的個(gè)體和位點(diǎn)。在進(jìn)行全基因組分析之前,位于性染色體(Z染色體和W染色體)中的SNPs被去除。

1.5 群體結(jié)構(gòu)分析和固定效應(yīng)檢驗(yàn)

在建立模型之前,使用主成分分析(principal component analysis, PCA)進(jìn)行群體分層檢驗(yàn),對(duì)可解釋方差最大的前2個(gè)主成分繪制散點(diǎn)圖。

將腿部健康表型(即健康或患病)作為因變量,世代、批次作為自變量,使用廣義線性回歸模型進(jìn)行固定效應(yīng)檢驗(yàn),使用二項(xiàng)分布和logit鏈接函數(shù)擬合邏輯回歸模型,并使用卡方檢驗(yàn)評(píng)估世代和批次是否對(duì)腿病發(fā)生有顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn),肉雞的批次和世代與腿病發(fā)生有顯著的相關(guān)性(P<0.05),因此將其作為協(xié)變量加入模型中。

1.6 全基因組關(guān)聯(lián)分析

參照此前對(duì)肉雞腿部健康表型的分類方式將樣本進(jìn)行分類,采用plink軟件中的邏輯回歸模型進(jìn)行GWAS分析。用“—dummy-coding”命令將固定效應(yīng)轉(zhuǎn)換成0、1格式的二分類變量,將其和前兩個(gè)主成分作為協(xié)變量加入邏輯回歸模型中。使用邏輯回歸對(duì)腿部健康表型進(jìn)行GWAS分析建立的模型如下:

Logit(P)=ln(P/(1-P))=β0+β1χ1,β2χ2……,βmχm

其中,P表示性狀發(fā)生的概率,取值范圍為0到1;χ1,χ2, ……,χm表示輸入的m個(gè)特征,是模型的自變量;β0,β1,β2,……,βm表示模型參數(shù),需要通過優(yōu)化算法學(xué)習(xí)得到合適的數(shù)值。

采用plink軟件中的參數(shù)“-indep-Pairwise 25 5 0.2”推測(cè)獨(dú)立檢驗(yàn)的有效SNP數(shù)量,以確保SNP單獨(dú)具有統(tǒng)計(jì)顯著性且互相獨(dú)立,從而根據(jù)獨(dú)立的SNP數(shù)量調(diào)整全基因組顯著閾值和全基因組水平潛在顯著閾值[23]。計(jì)算得到有效獨(dú)立檢驗(yàn)SNPs為7 468個(gè),即GWAS分析的顯著性閾值為0.05/7 468=6.70×10-6,潛在顯著閾值為1/7 468=1.34×10-4。使用R(V4.2.3)軟件包“CMplot”(https://github.com/YinLiLin/CMplot)對(duì)GWAS結(jié)果進(jìn)行曼哈頓圖和Q-Q圖繪制。

1.7 基因注釋及其表型解釋率

為了篩選可能與腿病發(fā)生相關(guān)的候選基因,選擇了顯著SNPs基因區(qū)段。利用Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://asia.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index)獲取SNP的信息,對(duì)照Gullas(GRCg6a)參考基因組,并對(duì)GWAS所得SNPs進(jìn)行注釋和基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)功能富集分析,以確定蛋白編碼基因的重要生物學(xué)功能。為衡量所注釋到的基因?qū)Ρ硇妥儺惖呢暙I(xiàn)程度,通過計(jì)算其表型解釋率(phenotypic variation explained,PVE):

beta為基因的效應(yīng)大小或效應(yīng)大小的估計(jì)值;MAF為最小等位基因頻率(minor allele frequency);se為基因效應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)誤差(standard error);N為樣本數(shù)量。

識(shí)別出對(duì)特定表型特征具有較高遺傳影響的基因,以初步篩選影響肉雞腿病發(fā)生的重要候選基因。

2 結(jié) 果

2.1 腿部健康表型評(píng)價(jià)

X光測(cè)定可以精準(zhǔn)評(píng)價(jià)肉雞腿部是處于健康狀況(圖1a)或病變狀態(tài)(圖1b),根據(jù)腿部骨骼形變程度和特征區(qū)分得到2 257只健康和74只腿病個(gè)體[24],總體腿病發(fā)生率為3.17%。各群體腿病發(fā)生具體情況統(tǒng)計(jì)如表1所示,A、B、C、D群體發(fā)病率分別為4.09%、0.70%、4.55%和8.57%,D群體由于個(gè)體數(shù)較少結(jié)果不予考慮,A群體和C群體腿病發(fā)生率均較高,而B群體腿病發(fā)生率較低。

a.健康個(gè)體(0)腿部骨骼形態(tài)X光圖像;b.腿病個(gè)體(1)腿部骨骼形態(tài)X光圖像 a. X-ray images of leg bone morphology in healthy individuals (0); b. X-ray images of leg bone morphology in leg disease individuals (1)圖1 X光測(cè)定評(píng)價(jià)肉雞腿部健康情況Fig.1 X-ray assessment to evaluate the health condition of broiler legs

表1 試驗(yàn)群體肉雞腿病發(fā)生情況Table 1 Leg disease of broiler in experimental group

2.2 基因型數(shù)據(jù)分析

利用“京芯一號(hào)”55K SNP芯片對(duì)2 331只“廣明2號(hào)”白羽肉雞進(jìn)行基因分型,基于最小等位基因頻率≥5%、基因分型率≥90%的位點(diǎn)和個(gè)體分型率≥90%的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,保留了2 330只肉雞個(gè)體和30 414個(gè)有效SNPs位點(diǎn)用于后續(xù)分析,各染色體有效位點(diǎn)密度圖見圖2。其中1號(hào)染色體上位點(diǎn)數(shù)量最多,有6 601個(gè);16號(hào)染色體上位點(diǎn)數(shù)量最少,有134個(gè)。

圖2 基因分型質(zhì)控后染色體密度圖Fig.2 Chromosome density map after genotyping quality control

2.3 主成分分析

使用plink軟件對(duì)A、B、C、D群體進(jìn)行主成分分析,結(jié)果(圖3)顯示這4個(gè)群體有明顯的結(jié)構(gòu)分層,說明這4個(gè)白羽肉雞群體在人工選育過程中群體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異,且PC1和PC2分別可解釋方差的比例為28.4%和6.20%。因此,在后續(xù)全基因組關(guān)聯(lián)分析中將前2個(gè)主成分作為協(xié)變量加入模型中,以校正群體結(jié)構(gòu),降低群體分層對(duì)模型穩(wěn)定性的影響。

圖中的每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)家庭中的個(gè)體,紅色、綠色、藍(lán)色和紫色的圓點(diǎn)分別代表來(lái)自A、B、C、D群體的個(gè)體,代表4個(gè)群體 Each dot in the figure corresponds to an individual in a family, and the red, green, blue, and purple dots represent individuals from group A, B, C, and D, respectively, representing the 4 groups圖3 A、B、C、D群體結(jié)構(gòu)主成分分析Fig.3 Principal component analysis of the structure of A, B, C and D groups

2.4 基于腿病表型的全基因組關(guān)聯(lián)分析

本研究基于肉雞腿部健康表型,將群體分為對(duì)照和患病群體進(jìn)行GWAS分析,以獲得與腿病相關(guān)的位點(diǎn)和候選基因,結(jié)果用曼哈頓圖(圖4a)和QQ圖表示(圖4b)。QQ圖膨脹因子為1.018,表示分析結(jié)果的假陽(yáng)性較低。曼哈頓圖顯示沒有與腿病發(fā)生相關(guān)的顯著SNP位點(diǎn),在潛在顯著水平上共檢測(cè)到5個(gè)SNPs位點(diǎn)(P<9.90×10-5),分別位于6號(hào)染色體(rs7317511、rs7963346、rs11152911、rs11277299)和18號(hào)染色體(rs3239706)。在6號(hào)染色體上,最顯著的SNP是rs11277299(P=1.23×10-5)。

2.5 候選基因的SNP表型解釋率和基因頻率

所鑒定到的顯著SNP位點(diǎn)解釋的表型變異解釋(phenotypic variation explanation, PVE)范圍為0.65%～0.81%,這5個(gè)位點(diǎn)PVE值較其他位點(diǎn)高,說明對(duì)表型的貢獻(xiàn)較大。rs11277299位點(diǎn)的表型變異率最高,為0.81%,認(rèn)為這幾個(gè)SNPs位點(diǎn)可能是重要的遺傳位點(diǎn),在肉雞腿部健康發(fā)生發(fā)展調(diào)控中發(fā)揮重要作用。對(duì)上述5個(gè)顯著SNPs位點(diǎn)進(jìn)行注釋,共得到TBCD、SIRT1和PBLD這3個(gè)候選基因(表2),通過計(jì)算各SNP位點(diǎn)在健康組(0)和患病組(1)間的比例,發(fā)現(xiàn)SIRT1基因中攜帶GG基因型的個(gè)體、PBLD基因中攜帶AA和GA基因型的個(gè)體、TBCD基因中攜帶CC基因型的個(gè)體患病比例較大,均有可能增加肉雞患腿病的風(fēng)險(xiǎn)(圖5)。

2.6 候選基因功能研究

對(duì)腿病表型注釋到的TBCD、SIRT1和PBLD這3個(gè)候選基因通過KOBAS網(wǎng)站(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析,結(jié)果顯示共有82個(gè)GO項(xiàng)達(dá)到了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的水平(P<0.05),這些GO條目主要涉及細(xì)胞分化、細(xì)胞生物合成、細(xì)胞因子結(jié)合和信號(hào)通路負(fù)調(diào)控等過程,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控GO條目(GO: 0030512)是GO富集分析結(jié)果中最顯著的GO條目,其中細(xì)胞質(zhì)過程(GO:0005737)在這3個(gè)基因中均顯著富集到(P<0.05)(圖6)。KEGG分析結(jié)果表明,僅有SIRT1基因富集到FoxO信號(hào)通路(gga04068)和細(xì)胞衰老信號(hào)通路(gga04218)并達(dá)到顯著水平(P<0.05),可能在腿部疾病和骨骼發(fā)育中起重要作用。

a.曼哈頓圖:水平黑色虛線表示全基因組潛在閾值線(P=1.34×10-4),黑色實(shí)線表示全基因組顯著閾值線(P=6.70×10-6);b.Q-Q圖 a. Manhattan plot: Horizontal black dashed line indicates the genome-wide potential threshold line (P=1.34×10-4), and the black solid line indicates the genome-wide significant threshold line (P=6.70×10-6); b; Q-Q plot圖4 全基因組水平上腿部健康表型性狀的曼哈頓圖和Q-Q圖Fig.4 Manhattan and Q-Q plots of leg health phenotypic traits at the genome-wide level

表2 白羽肉雞腿部健康性狀顯著相關(guān)的SNPs及其候選基因Table 2 SNPs and their candidate genes significantly associated with leg health traits in white feather broilers

a, b, c分別為顯著SNPs rs7317511、rs11277299和rs3239706的基因型頻率在健康組(0)和腿病組(1)間的比例,即不同等位基因?qū)ν炔拷】敌誀畹挠绊?a, b, c are the ratios of genotype frequencies of significant SNPs rs7317511, rs11277299, and rs3239706, respectively, between the healthy group (0) and the leg disease group (1), i.e., the effect of different alleles on leg health traits圖5 注釋到基因的顯著SNPs在健康和腿病組間的基因型比例Fig.5 Genotype proportions of significant SNPs annotated to genes between healthy and leg disease groups

圖6 候選基因GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of candidate genes

3 討 論

隨著對(duì)現(xiàn)代商業(yè)化肉雞增重和生產(chǎn)性能的不斷選育,骨骼生長(zhǎng)發(fā)育不足以支撐肉雞快速生長(zhǎng)的體重導(dǎo)致多種類型腿病發(fā)生,腿病發(fā)生已引起養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)極大關(guān)注。本研究采用我國(guó)自主培育的“廣明2號(hào)”白羽肉雞,通過X光方法對(duì)已在人工選育過程中群體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異的A、B、C、D四個(gè)群體測(cè)定腿部骨骼健康狀況,對(duì)實(shí)踐應(yīng)用有重要的指導(dǎo)意義。腿病個(gè)體在品系培育過程中經(jīng)歷了嚴(yán)格淘汰,可能導(dǎo)致已上市的配套系中相應(yīng)性狀遺傳力降低,而本研究中特定的通過X光方法定義表型也可能對(duì)遺傳力估計(jì)造成影響。需要繼續(xù)探究腿病個(gè)體淘汰對(duì)整個(gè)品系性狀的影響且分析造成遺傳力較低的原因,進(jìn)一步完善通過X光方法評(píng)價(jià)肉雞腿病發(fā)生的狀況,為改進(jìn)肉雞品系培育和預(yù)防腿病發(fā)生提供借鑒。

本研究基于多個(gè)品系、批次和世代群體腿病發(fā)病率的統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)腿病發(fā)生率總體高達(dá)3.17%,A、C群體發(fā)病率分別高達(dá)4.09%、4.55%,這極度加大了家禽生產(chǎn)中的死淘率,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,但群體內(nèi)世代和批次間的腿病發(fā)生率無(wú)顯著差異。而B群體腿病發(fā)生率較低,可進(jìn)一步探究B群體腿部健康狀況遺傳機(jī)制,從遺傳選育角度入手改良腿部健康性狀。肉雞腿病發(fā)生受遺傳、營(yíng)養(yǎng)、飼養(yǎng)管理、環(huán)境等多方面的影響,其中定位其主效遺傳因和位點(diǎn)是作為突破口進(jìn)行遺傳改良以改善肉雞腿部疾病的關(guān)鍵[25]。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)作為揭示基因與疾病之間關(guān)聯(lián)性的有力研究方法,能為疾病的機(jī)制研究和治療提供新的方向和策略,已被廣泛應(yīng)用于挖掘復(fù)雜疾病的易感基因[26-27]。在畜禽生產(chǎn)中,GWAS方法已被廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)性狀的研究中,如體重、產(chǎn)蛋性狀、免疫功能和骨骼等[28]。通過全基因組關(guān)聯(lián)研究和基因組選擇等手段能迅速加快腿部健康的遺傳改良進(jìn)程,然而目前關(guān)于肉雞腿部健康表型相關(guān)遺傳變異位點(diǎn)的研究仍然十分缺乏,沒有大樣本用于鑒定與腿病相關(guān)的基因位點(diǎn)和候選基因。因此,本研究基于白羽肉雞腿部疾病發(fā)生的病例和對(duì)照樣本,將2 257例健康和74例腿病發(fā)生白羽肉雞通過“京芯一號(hào)”55K SNP芯片基因分型測(cè)序方法進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析,以期鑒定出與白羽肉雞腿部健康相關(guān)的候選基因和變異位點(diǎn),為肉雞腿部健康遺傳改良提供參考。

本研究通過全基因組關(guān)聯(lián)分析定位到5個(gè)潛在SNPs位點(diǎn)與腿病發(fā)生顯著相關(guān),其中4個(gè)位點(diǎn)位于6號(hào)染色體,1個(gè)位點(diǎn)位于18號(hào)染色體。PVE值可以作為評(píng)估基因位點(diǎn)對(duì)表型變異解釋能力的指標(biāo),本研究發(fā)現(xiàn)在肉雞腿部健康表型變異中,位點(diǎn)rs7317511、rs7963346、rs11152911、rs11277299和rs3239706的基因突變或多態(tài)性分別解釋了0.65%、0.66%、0.72%、0.81%和0.72%表型的變異,這些位點(diǎn)較其他位點(diǎn)PVE值大,一定程度上能作為評(píng)估肉雞腿部健康表型的變異位點(diǎn)的指標(biāo)。其中,rs7317511注釋得到SIRT1基因,rs3239706注釋得到TBCD基因,rs11277299注釋得到PBLD基因,這3個(gè)已知候選基因相對(duì)來(lái)說對(duì)腿部健康表型具有較為重要的潛在意義。

骨骼作為雞的一個(gè)重要性狀,它的質(zhì)量與肉雞的產(chǎn)肉量和骨質(zhì)疏松癥有關(guān)。有研究采用高密度基因分型平臺(tái)檢測(cè)骨骼性狀的候選基因,發(fā)現(xiàn)位于不同染色體上的3個(gè)基因位點(diǎn)包含候選基因HTR2A、LPAR6、CAB39L、TRPC4、WNT9A、SPOP、NGFR、GIP和HOXB3與骨骼質(zhì)量和長(zhǎng)度有關(guān)[29];Zhang等[30]對(duì)雞龍骨表型差異進(jìn)行選擇消除分析,發(fā)現(xiàn)了10個(gè)具有強(qiáng)選擇信號(hào)且與骨骼相關(guān)的重要候選基因并富集到了MAPK和破骨細(xì)胞分化兩條重要的骨信號(hào)通路。重要的是,基于本研究注釋到的基因SIRT1、TBCD和PBLD具體功能及其如何參與機(jī)體骨骼代謝過程也已有多項(xiàng)研究。雞SIRT1基因cDNA全長(zhǎng)約2 271 bp,位于6號(hào)染色體,可編碼756個(gè)氨基酸[31],它參與調(diào)節(jié)腫瘤、氧化應(yīng)激、凋亡、衰老和炎癥等一系列細(xì)胞代謝過程[32-33]。有研究發(fā)現(xiàn),SIRT1敲除小鼠體內(nèi)骨量減少,成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞比例失衡,這表明該基因是通過直接作用于骨細(xì)胞來(lái)調(diào)控骨代謝過程[34],它的表達(dá)水平與骨礦物質(zhì)密度和骨脆性有關(guān),其可能成為系統(tǒng)性骨代謝和骨相關(guān)疾病的潛在生物標(biāo)志物[35],還能介導(dǎo)FoxO(gga04068)和細(xì)胞衰老(gga04218)等重要信號(hào)通路。FoxO是一類轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)控多種細(xì)胞過程,而FoxO信號(hào)通路通過參與調(diào)控骨母細(xì)胞的增殖分化和吸收等過程影響骨細(xì)胞的功能和骨骼組織的形成[36-37]。細(xì)胞衰老信號(hào)通路主要包括端?？s短、DNA損傷響應(yīng)、染色質(zhì)重塑、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞死亡等多個(gè)分子機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞衰老信號(hào)通路與骨骼生長(zhǎng)發(fā)育過程的關(guān)聯(lián),即端?？s短和端粒酶的活性與骨質(zhì)疏松和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[38],但目前對(duì)于細(xì)胞衰老信號(hào)通路在骨骼生長(zhǎng)發(fā)育中的具體功能還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。關(guān)于SIRT1基因?qū)趋来x和生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制和互作網(wǎng)絡(luò)在未來(lái)的研究中值得進(jìn)一步關(guān)注,特別是GG基因型的肉雞。PBLD通過抑制NF-κB和上皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化信號(hào)通路而發(fā)揮腫瘤抑制作用,控制炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié),對(duì)骨關(guān)節(jié)炎等疾病都有著重要影響[39];TBCD主要參與微管相關(guān)的生物學(xué)過程,如細(xì)胞分裂、細(xì)胞軸向極化和細(xì)胞運(yùn)輸?shù)萚40],尚未發(fā)現(xiàn)該基因與骨骼之間的聯(lián)系,但微管在骨骼生長(zhǎng)和骨骼細(xì)胞的某些功能中也發(fā)揮著重要作用[41]。關(guān)于這3個(gè)基因如何具體影響骨骼生長(zhǎng)發(fā)育的生理過程及其分子遺傳機(jī)理,以及攜帶不同基因型的肉雞腿部健康是否會(huì)有差異,還亟待進(jìn)一步的理論和試驗(yàn)研究進(jìn)行探索。

本研究還發(fā)現(xiàn)了特定的潛在SNP位點(diǎn)rs7963346,其位置被定位到了lncRNA上,這個(gè)發(fā)現(xiàn)提供了進(jìn)一步研究該SNP位點(diǎn)對(duì)腿病發(fā)生影響的線索。lncRNA是一類長(zhǎng)鏈非編碼RNA,它的功能相對(duì)較為復(fù)雜和多樣,可以調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞生物學(xué)過程等?？赏ㄟ^進(jìn)一步試驗(yàn)深入研究該位點(diǎn)所在的lncRNA的功能,還可通過構(gòu)建SNP-lncRNA-disease網(wǎng)絡(luò)來(lái)探究該位點(diǎn)與腿病之間的關(guān)系,從而揭示其在腿部疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的作用,為肉雞腿病的預(yù)防、診斷和治療提供重要的理論依據(jù)。大多數(shù)疾病發(fā)生發(fā)展都是極其復(fù)雜的,受多種環(huán)境條件和基因控制。本研究在全基因組水平上發(fā)現(xiàn)多個(gè)顯著與肉雞腿病發(fā)生相關(guān)的位點(diǎn),但這些位點(diǎn)未定位到相似的區(qū)域和基因。骨骼生長(zhǎng)發(fā)育及病變過程受遺傳和環(huán)境因素共同影響調(diào)控,基因組的復(fù)雜性和多樣性決定了不同環(huán)境背景下基因的功能可能會(huì)呈現(xiàn)不同的效應(yīng)。推測(cè)肉雞腿病作為復(fù)雜性狀,受到了多種效應(yīng)的影響,進(jìn)一步的功能注釋、環(huán)境相關(guān)研究以及更大規(guī)模的驗(yàn)證研究將有助于深入理解這些位點(diǎn)在肉雞腿部健康中的潛在作用和復(fù)雜關(guān)系。SIRT1、PBLD和TBCD均是可能與腿病發(fā)生相關(guān)的候選基因,有望深入研究這些基因的潛在生物學(xué)意義,并為肉雞腿部健康研究提供新的見解。

4 結(jié) 論

本研究基于多個(gè)品系及世代的2 331只白羽肉雞個(gè)體,通過大量樣本數(shù)據(jù)基于55K SNP基因芯片利用GWAS方法研究白羽肉雞腿部健康的遺傳機(jī)制,挖掘與腿病發(fā)生相關(guān)的重要遺傳信息。研究發(fā)現(xiàn)6號(hào)染色體(rs7317511、rs7963346、rs11152911、rs11277299)和18號(hào)染色體(rs3239706)上的5個(gè)SNPs位點(diǎn)可能是影響肉雞腿病發(fā)生的變異位點(diǎn),SIRT1、PBLD和TBCD可能是影響白羽肉雞腿病發(fā)生的重要候選基因。本試驗(yàn)為研究肉雞腿病的發(fā)生機(jī)制和降低腿病發(fā)生率提供了重要遺傳參考。