劉傳霞,王 曉,李雪雯,鮑苗菲,李婷婷,陳 欣,翁長江,鄭 君

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 動(dòng)物疫病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家非洲豬瘟專業(yè)實(shí)驗(yàn)室 基礎(chǔ)免疫創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),哈爾濱 150069)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是一種具有高度傳染性的病毒性疾病,可以導(dǎo)致家豬的高感染率和死亡率,但在自然豬群宿主[1-3]中表現(xiàn)為無癥狀。目前由于缺乏有效的疫苗和防治藥物,該病已經(jīng)造成了全球生豬產(chǎn)業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)有的疾病控制方法是對(duì)受影響的地區(qū)進(jìn)行檢疫和撲殺被感染的動(dòng)物。

ASF的病原是非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV),是一種有囊膜的雙鏈DNA病毒,可引起家豬全身出血性疾病[4]。ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員,是目前僅有的蟲媒DNA病毒。病毒基因組為線性雙鏈DNA,包括中間的穩(wěn)定區(qū)和兩端的可變區(qū),大小為170～190 kbp,編碼150～167個(gè)開放閱讀框。ASFV病毒粒子為二十面體的多層結(jié)構(gòu),直徑約250 nm,由外到內(nèi)依次是病毒外囊膜、衣殼、內(nèi)膜、內(nèi)核心殼和病毒基因組[5]。ASFV編碼的蛋白約200種[6],其中超過50種為結(jié)構(gòu)蛋白[7],行使多種功能,包括病毒粒子形態(tài)的維持,吸附入侵宿主細(xì)胞,影響宿主細(xì)胞多種因子的功能以及調(diào)控宿主細(xì)胞的自噬、凋亡和炎癥反應(yīng)等防御機(jī)制[8]。

pE120R是ASFV編碼的病毒衣殼蛋白之一,是一種晚期結(jié)構(gòu)蛋白,由120個(gè)氨基酸組成[8-9]。pE120R主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,參與了ASFV從組裝位點(diǎn)到質(zhì)膜的運(yùn)輸,這表明pE120R在病毒的傳播過程中起著重要作用[10]。免疫電鏡觀察顯示,pE120R蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)病毒粒子的表面,以獨(dú)立的方式與病毒DNA和主要結(jié)構(gòu)蛋白p72相互作用,并且可能在病毒DNA的包封過程中發(fā)揮作用[11]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及病毒株

E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、HEK293 T細(xì)胞、pGEX-6p1(+)、pCAGGS-Flag-pE120R均由本實(shí)驗(yàn)室保存;SP2/0細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存;豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)分離自30日齡ASFV陰性豬;BALB/c小鼠購自遼寧長生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;ASFV HLJ/18株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所分離并保存。

1.2 主要試劑

DMEM、PBS、胰酶購自哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物衛(wèi)生中心;BamH I/NotI限制性內(nèi)切酶、PrimeSTARMax Premix購自TaKaRa公司;弗氏不完全佐劑購自Sigma公司;同源重組試劑盒購自Vazyme公司;紅外熒光標(biāo)記的山羊抗兔和鼠的IgG購自LICOR公司;小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用ELISA試劑盒購自博奧龍公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

ELISA酶標(biāo)板購自Greiner公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱;高速離心機(jī);ZEISS熒光顯微鏡;SDS-PAGE電泳儀及羅氏轉(zhuǎn)印槽;Bio-Tek公司酶標(biāo)儀。

1.4 pE120R基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中登錄的ASFV HLJ/2018株基因組組序列,設(shè)計(jì)引物pE120R-F: 5′-CAGGGGCCCCTGGGATCCATGGCAGATTTTAATTCT-3′(下劃線處為BamH I酶切位點(diǎn))pE120R-R: 5′-CAGTCACGATGCGGCCGCTTACTTCGATTT-ATGCGA-3′(下劃線處為NotI酶切位點(diǎn)),由吉林省庫美生物科技有限公司合成。以pCAGGS-Flag-pE120R為模板PCR擴(kuò)增E120R基因。反應(yīng)體系為50 μL:包括PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL,上、下游引物各1 μL,DNA 模板50 ng,ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性 2 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸20 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;同時(shí),pGEX-6p1(+)空載體經(jīng)BamH I和NotI雙酶切,將 PCR 產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,用膠回收試劑盒純化,然后二者經(jīng)同源重組酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,并涂布于氨芐抗性LB平板,37 ℃倒置過夜培養(yǎng)12 h。菌液PCR鑒定正確后,送至吉林省庫美生物科技有限公司測序。測序正確的重組質(zhì)粒按照小提質(zhì)粒試劑盒說明書提取,命名為pGEX-6p1-pE120R,-20 ℃保存。

1.5 pE120R 重組蛋白的原核表達(dá)、鑒定與純化

將表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p1-pE120R轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落接種于5 mL氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中,活化后加至2 L氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃,220 r·min-1培養(yǎng)OD600 nm至0.6～0.8時(shí),加入終濃度為1 mol·L-1IPTG,在16 ℃,220 r·min-1培養(yǎng)16 h,離心,收集菌體沉淀。用PBS洗滌沉淀后再次重懸,冰浴條件下進(jìn)行超聲波破碎。收集上清液與GST Beads于4 ℃條件下孵育過夜,用不同濃度梯度咪唑緩沖液洗脫目的蛋白。然后對(duì)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定分析,并進(jìn)行蛋白定量,測定濃度后-80 ℃保存。

1.6 免疫小鼠

將純化的pE120R蛋白進(jìn)行濃度測定,將100 mg·mL-1的融合蛋白與等體積的弗式完全佐劑(首次免疫)和不完全佐劑混合并進(jìn)行乳化,對(duì)5只BALB/c小鼠進(jìn)行多位點(diǎn)皮下注射,免疫小鼠7周后斷尾采血,離心分離血清,檢測小鼠免疫后血清抗體水平,選擇抗體水平最高的小鼠腹腔注射pE120R蛋白加強(qiáng)免疫,3 d后取該小鼠的脾進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.7 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞篩選

將加強(qiáng)免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0 細(xì)胞進(jìn)行融合,利用有限稀釋法對(duì)篩選出來的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行3次亞克隆培養(yǎng)并通過間接ELISA篩選,以建立穩(wěn)定分泌pE120R抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。對(duì)建株后的單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存保種。

1.8 Western blot檢測

將pCAGGS-Flag-pE120R重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,24 h后收集細(xì)胞。同時(shí)利用1 MOI ASFV感染 PAMs,36 h收集細(xì)胞。用細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞,離心取上清,進(jìn)行SDS-PAGE電泳并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。將PVDF膜用含5%脫脂乳的TBS溶液室溫封閉2 h,用pE120R單抗4 ℃作用過夜,洗滌,以紅外熒光標(biāo)記的山羊抗鼠IgG以1∶10 000稀釋作為二抗,室溫避光作用1 h,洗滌后用近紅外熒光掃描成像儀掃描。

1.9 間接免疫熒光(IFA)檢測

將pCAGGS-Flag-pE120R重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,24 h收集樣品。同時(shí)用1 MOI ASFV感染PAMs,分別于0、6、12、24、30 h收集樣品,使用4%多聚甲醛常溫固定pCAGGS-Flag-pE120R轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞和ASFV感染的PAMs細(xì)胞30 min,0.3% TritonX-100透膜10～15 min,5% BSA溶液封閉2 h,pE120R單抗4 ℃過夜孵育;添加相應(yīng)二抗在室溫避光孵育1 h。DAPI 室溫染色15 min,置于共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.10 抗原表位的鑒定

分別以提取的ASFV HLJ/18株基因組DNA為模板擴(kuò)增相應(yīng)pE120R全長和各截?cái)嗥尾⒖寺≈羛ET-21a-MBP載體中,構(gòu)建的重組質(zhì)粒均測序鑒定正確。將上述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后以單克隆抗體和鼠源His抗體為一抗,以IRDye 800CW標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)為二抗,利用Western blot鑒定表位。

1.11 抗體亞型鑒定

取細(xì)胞上清50 μL用標(biāo)本稀釋液稀釋(1∶1),加入到酶標(biāo)微孔板中,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照,37 ℃孵育30 min;棄去板內(nèi)液體,用清洗液洗5遍,加入100 μL酶標(biāo)二抗,37 ℃孵育30 min;棄去板內(nèi)液體,用清洗液洗5遍,加入顯色劑A和顯色液B各50 μL,避光30 ℃孵育20 min,;加入終止液50 μL終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測定450 nm處波長。

2 結(jié) 果

2.1 pE120R重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

首先利用TMHMM軟件對(duì)pE120R蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示pE120R是一個(gè)無跨膜區(qū)的蛋白(圖 1A)。根據(jù)E120R基因的編碼序列(369 bp)設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增E120R片段,PCR產(chǎn)物克隆至pGEX-6p1 載體。結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增條帶單一,大小約369 bp,BamH I和NotI雙酶切重組質(zhì)粒,可見一條大小約369 bp的條帶(圖 1B),與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該片段與pE120R編碼序列一致,說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,命名為pGEX-6p1-pE120R。

A. TMHMM 軟件分析pE120R 蛋白的氨基酸序列;B. ASFV pE120R基因重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2 000,DL15 000);1. ASFV pE120R 基因PCR產(chǎn)物;2. pGEX-6p1-pE120R重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 A. Analysis of amino acid sequence of ASFV pE120R protein by TMHMM software; B. Construction of the recombinant prokaryotic expression plasmid pGEX-6p1-pE120R: M. DNA Marker (DL2 000; DL15 000); 1. PCR production of ASFV pE120R gene; 2. Identification of pET-21a-pE120R plasmid digested with BamH I and Not I圖1 重組原核表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-6p1-pE120R的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant prokaryotic expression plasmid pGEX-6p1-pE120R

2.2 pE120R 重組蛋白的原核表達(dá)、鑒定與純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示,IPTG濃度為1 mol·L-1時(shí),在16 ℃誘導(dǎo)16 h后,含pGEX-6p1-pE120R質(zhì)粒重組菌樣品中均出現(xiàn)了一條明顯的蛋白條帶,大小約25 ku,與預(yù)期大小相符,未誘導(dǎo)的含pGEX-6p1-pE120R重組菌液樣品中未出現(xiàn)對(duì)應(yīng)條帶。SDS-PAGE和Western blot結(jié)果表明,pE120R蛋白以可溶性表達(dá)為主。經(jīng)GST Beads純化后獲得了純度較高的pE120R蛋白(圖2)。

2.3 pE120R單抗隆抗體的Western blot檢測

pCAGGS-Flag-pE120R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,24 h收集細(xì)胞。同時(shí)將ASFV感染PAMs,36 h后收集細(xì)胞,用含1% NP-40細(xì)胞裂解液裂解。以抗pE120R蛋白的單抗隆抗體為一抗,紅外熒光標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000稀釋)為二抗進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果顯示:鼠抗pE120R蛋白單抗隆抗體可特異性識(shí)別外源表達(dá)的Flag-pE120R蛋白(圖3A),以及ASFV感染PAMs后表達(dá)的內(nèi)源性pE120R蛋白(圖3B)。這些結(jié)果表明,制備的鼠抗pE120R蛋白單抗隆抗體可用于Western blot檢測。

2.4 pE120R單克隆抗體的IFA檢測

用pCAGGS-Flag-E120R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞;同時(shí)將ASFV感染PAMs,經(jīng)固定、透膜、封閉處理后,以抗pE120R蛋白的單抗隆抗體為一抗,將綠色(Alexa Fluor? 488)和紅色(Alexa Fluor? 594)熒光標(biāo)記的山羊抗鼠IgG以1∶2 000稀釋為二抗。結(jié)果顯示:鼠抗pE120R蛋白單抗隆抗體可以檢測到外源表達(dá)的Flag-pE120R蛋白(圖4A)以及ASFV感染PAMs后表達(dá)的內(nèi)源性pE120R蛋白(圖4B)。這些結(jié)果表明,制備的鼠抗pE120R單抗隆抗體可用于IFA檢測。

A. 鼠抗pE120R單克隆抗體Western blot檢測Flag-tagged pE120R蛋白的表達(dá); B. 鼠抗pE120R單克隆抗體Western blot檢測ASFV感染PAMs pE120R蛋白表達(dá) A. Detection of Flag-tagged pE120R by Western blot with mouse anti-ASFV pE120R mAb; B. Detection of ASFV pE120R protein expressed in ASFV-infected PAMs by Western blot with mouse anti-ASFV pE120R mAb圖3 Western blot檢測pE120R蛋白的表達(dá)Fig.3 Detection of pE120R protein expression by Western blot

A. 鼠抗pE120R單克隆抗體IFA檢測Flag-pE120R蛋白; B.IFA檢測ASFV感染PAMs pE120R蛋白 A. Detection of pE120R by IFA with mouse anti-ASFV pE120R mAb; B. Detection of ASFV pE120R protein expressed in ASFV-infected PAMs by IFA圖4 IFA方法鑒定Flag-pE120R 和 ASFV pE120R蛋白Fig.4 Identification of Flag-tagged pE120R and ASFV pE120R by IFA

2.5 抗原表位的鑒定

為確定抗原表位,將pE120R截短為6段進(jìn)行原核表達(dá),通過Western blot對(duì)截短進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,該單抗的結(jié)合位點(diǎn)在30～60aa區(qū)域(圖5)。

圖5 Western blot鑒定單克隆抗體識(shí)別的抗原表位Fig.5 Identification of monoclonal antibody epitopes by Western blot

2.6 抗體亞類鑒定

小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用ELISA試劑盒鑒定結(jié)果顯示(圖6),單抗識(shí)別的重鏈為IgG2a。

圖6 單克隆抗體亞類鑒定Fig.6 Identification of monoclonal antibody subspecies

3 討 論

豬肉是世界上消費(fèi)最廣、產(chǎn)量最高的肉類產(chǎn)品,占全球肉類產(chǎn)量的三分之一以上。豬的傳染病威脅著這種重要的高質(zhì)量蛋白質(zhì)來源,而養(yǎng)豬業(yè)的全球化促進(jìn)了病原體的出現(xiàn)和傳播。在這些病原體中,ASFV已成為養(yǎng)豬業(yè)的“殺手”之一。

ASFV病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其編碼的很多蛋白都與結(jié)構(gòu)和形態(tài)的發(fā)生有關(guān),其中就包括pE120R蛋白。pE120R定位于成熟病毒粒子的衣殼上,是一種與主要衣殼蛋白p72相關(guān)的衣殼成分。一般來說,病毒在從宿主細(xì)胞進(jìn)入和退出過程中的運(yùn)動(dòng)依賴于細(xì)胞骨架[12-14],而細(xì)胞骨架通常在整個(gè)感染過程中進(jìn)行重組,而pE120R可能參與了ASFV在微管的運(yùn)輸,所以pE120R對(duì)ASFV的胞內(nèi)運(yùn)輸具有重要的作用。此外pE120R還具有結(jié)合DNA的特性,這就表明pE120R很可能在病毒DNA復(fù)制、DNA封裝或核蛋白核心組裝中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)敲除pE120R蛋白的ASFV在豬骨髓巨噬細(xì)胞(BMDM)中無法被挽救[15],pE120R還在天然免疫方面具有作用,它能夠破壞TBK1-IRF3軸抑制宿主抗病毒應(yīng)答[16]。目前關(guān)于E120R的研究還較少,需進(jìn)一步探究。

本研究建立了能夠大量制備可溶性pE120R蛋白的原核表達(dá)體系,并獲得了高純度的pE120R蛋白,可用于ELISA檢測方法的建立等,具有一定的潛在應(yīng)用研究價(jià)值。Western blot和IFA的鑒定結(jié)果表明,制備的抗pE120R單克隆抗體能特異性識(shí)別HEK293 T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的Flag-pE120R蛋白和ASFV感染PAMs細(xì)胞后表達(dá)的pE120R蛋白。該單抗的結(jié)合位點(diǎn)在30～60aa區(qū)域,并且該單抗亞類鑒定重鏈為IgG2a。上述試驗(yàn)證明,制備的pE120R單抗具有較強(qiáng)的特異性和親和力,為鑒定與pE120R相互作用蛋白和深入研究pE120R蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)純化pE120R蛋白,篩選到1株穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株,有望為ASFV的應(yīng)用研究和基礎(chǔ)研究提供幫助。