周建浩,王東方,劉 影,王淑娟,馬震原,謝彩華,趙雪麗,楊海波,馮桂丹, 康臺(tái)生,胡煜鋒,李博文,閆若潛*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046;2.河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心/河南省重大動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)預(yù)警 及防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450008;3.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,洛陽 471000; 4.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201103)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種急性、高度接觸性的腸道傳染病,以急性腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征[1]。PED是當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)除非洲豬瘟以外危害最為嚴(yán)重的腹瀉疫病,該病主要對(duì)10日齡內(nèi)仔豬危害最為嚴(yán)重,發(fā)病率可達(dá)100%;致死率為80%,最高可達(dá)100%[2],我國將其列為二類動(dòng)物疫病。PEDV是α冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)的成員,直徑為90～190 nm的RNA病毒,該基因組長(zhǎng)約28 kb,包含2個(gè)復(fù)制酶蛋白:ORF1a和ORF1b;4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白:S、E、M、N;1個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白:ORF3。我國當(dāng)前PEDV毒株主要分為經(jīng)典毒株(G1)和變異毒株(G2)兩大群,經(jīng)典毒株以CV777為代表,分為G1a和G1b兩個(gè)亞群;變異毒株分為G2a、G2b和G2c三個(gè)亞群,以G2a(如AH2012、JS-HZ2012等)最為流行[3]。2010年11月以來,由PEDV變異毒株(G2群)引起的豬群腹瀉性疫病可感染各個(gè)階段的豬,尤其對(duì)哺乳仔豬危害最嚴(yán)重,原有的以CV777毒株代表的經(jīng)典毒株疫苗對(duì)變異株感染保護(hù)效力差。PEDV經(jīng)典毒株和變異毒株基因組中的M和N基因高度保守,因此本研究建立的ddPCR方法引物/探針的選擇根據(jù)M基因保守區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì),以實(shí)現(xiàn)可對(duì)PEDV經(jīng)典毒株和變異毒株同時(shí)檢測(cè)的目的。

數(shù)字PCR(digital PCR,dPCR)是繼普通PCR、熒光定量PCR之后出現(xiàn)的第三代聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction)技術(shù)[4-5]。目前數(shù)字PCR技術(shù)主要分為微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)和芯片式數(shù)字PCR[6](chip digital PCR,cdPCR)。dPCR與熒光定量PCR相比較,dPCR不受擴(kuò)增效率的影響,無需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本[7],極大提高了低拷貝樣品的檢測(cè)靈敏度,因而定量結(jié)果更加準(zhǔn)確[8]。dPCR方法靈敏度高、特異性好,實(shí)現(xiàn)了真正意義的絕對(duì)定量[9],更有利于低病毒含量樣品的檢測(cè)進(jìn)而推動(dòng)PEDV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。

本研究將根據(jù)PEDV的M基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的引物對(duì)/探針,建立特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的ddPCR檢測(cè)方法,為臨床上PEDV感染的早期檢測(cè)診斷、PEDV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制等提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備及主要試劑

全自動(dòng)核酸提取儀、商品化病毒基因組DNA/RNA核酸試劑盒為西安天隆公司產(chǎn)品;ABI 7500熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品;微滴式數(shù)字PCR儀,2×PerfeCTa? qPCR ToughMix? UNG、2×qScriptTMXLT 1-Step RT-qPCR ToughMix?、Fluorescein sodium Salt等試劑為法國Stilla Technologies公司產(chǎn)品;PrimeScriptTMRT Master Mix、Premix ExTaqTM等均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 樣品來源

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬丁型冠狀病毒、豬偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒、豬輪狀病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型等10種病毒核酸樣品由河南省動(dòng)物疫病防控中心實(shí)驗(yàn)室提供;口蹄疫病毒O型、A型國家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供。疑似PEDV感染的腸內(nèi)容物、小腸組織、糞便等150份樣品由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 ddPCR引物和探針的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank登錄的PEDV的基因序列,選取其M基因(MK862249.1)序列保守區(qū),利用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和探針,引物對(duì)/探針序列為F:5′-GGCGCAGGACACATTCTTG-3′;R:5′-AAGTAGTGAGAAGCGCGTCTGTT-3′;P:FAMTGGTCTTTCAATCCTG-MGB。引物及探針均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 ddPCR反應(yīng)程序的優(yōu)化

1.4.1 ddPCR預(yù)混酶的選擇 使用自行建立的FQ-PCR引物對(duì)/探針。將經(jīng)FQ-PCR檢測(cè)定量后的PEDV核酸稀釋至終濃度1.0×104copies·μL-1作為一步法ddPCR模板,將其核酸RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為兩步法檢測(cè)模板(以下簡(jiǎn)稱‘模板’)。在一步法和兩步法ddPCR supermix for Probes 體系分別加入2×PerfeCTa? qPCR ToughMix? UNG、2×qScriptTM XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix?進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)兩種預(yù)混酶擴(kuò)增結(jié)果,選擇合適的預(yù)混酶。

1.4.2 ddPCR引物對(duì)/探針濃度以及退火溫度的優(yōu)化 以PEDV核酸cDNA為模板,ddPCR引物的濃度為0.3～0.9 μmol·L-1、探針濃度0.1～0.3 μmol·L-1,采用矩陣法篩選最佳的引物對(duì)/探針組合濃度。退火溫度設(shè)置52～62 ℃。反應(yīng)體系:2×PerfeCTa? qPCR ToughMix? UNG,Fluorescein sodium Salt 2.5 μL,模板3 μL,用無菌蒸餾水補(bǔ)齊至25 μL。ddPCR擴(kuò)增條件:45 ℃ 5 min,95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,50～62 ℃ 45 s,共45個(gè)循環(huán)。通過分析微滴分布狀態(tài)、拷貝數(shù)、檢測(cè)結(jié)果等確定最佳的引物對(duì)/探針濃度和最佳退火溫度。

1.5 ddPCR檢測(cè)方法與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR方法敏感性比較試驗(yàn)

對(duì)PEDV核酸cDNA模板進(jìn)行10倍梯度稀釋,濃度為1.0×104～1.0×10-1copies·μL-1;采用中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法[10](以下簡(jiǎn)稱:行標(biāo)FQ-PCR方法)和本研究建立的ddPCR方法同時(shí)對(duì)5個(gè)濃度的PEDV cDNA模板進(jìn)行檢測(cè),比較檢測(cè)結(jié)果,評(píng)估本研究建立的ddPCR檢測(cè)方法的敏感性。

1.6 ddPCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)

采用本研究建立的ddPCR方法對(duì)PEDV、PDCoV、PRV、TGEV等12種全基因組核酸總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),以評(píng)估該ddPCR檢測(cè)方法的特異性。

1.7 ddPCR檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)

選取濃度分別為1.0×103、1.0×102、1.0×101copies·μL-1PEDV核酸 cDNA為模板,用本研究建立的ddPCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)每個(gè)濃度進(jìn)行3批次批間試驗(yàn)和批內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè),計(jì)算變異系數(shù),評(píng)估該方法的重復(fù)性。

1.8 ddPCR檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

采用本研究建立的ddPCR方法和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存150份臨床疑似PEDV感染的腸內(nèi)容物、小腸組織、糞便等樣品進(jìn)行檢測(cè),將1.0×104copies·μL-1PEDV核酸cDNA模板作為陽性對(duì)照,以正常vero細(xì)胞培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照,評(píng)價(jià)ddPCR方法對(duì)臨床樣品檢測(cè)效果。

2 結(jié) 果

2.1 ddPCR反應(yīng)程序的優(yōu)化

2.1.1 ddPCR預(yù)混酶的選擇 根據(jù)兩種預(yù)混酶推薦的引物對(duì)/探針濃度進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示:采用2×qScriptTMXLT 1-Step RT-qPCR ToughMix?的拷貝數(shù)為7 338 copies·μL-1;采用2×PerfeCTa? qPCR ToughMix? UNG的拷貝數(shù)為10 647 copies·μL-1。因此,選擇2×PerfeCTa? qPCR ToughMix? UNG作為本研究的預(yù)混酶。

2.1.2 ddPCR引物對(duì)/探針濃度以及退火溫度的優(yōu)化 ddPCR引物對(duì)/探針濃度的優(yōu)化結(jié)果顯示:上下游引物濃度各0.5 μmol·L-1,探針濃度0.25 μmol·L-1時(shí)拷貝數(shù)最高,檢測(cè)結(jié)果最穩(wěn)定。最佳反應(yīng)體系:上下游引物濃度各0.5 μmol·L-1,探針濃度為0.25 μmol·L-1,2×PerfeCTa? qPCR ToughMix? UNG 12.5 μL,Fluorescein sodium Salt 2.5 μL,PEDV模板3 μL,無菌蒸餾水補(bǔ)足至總體積25 μL。ddPCR退火溫度的優(yōu)化結(jié)果顯示:退火溫度為56 ℃時(shí),陰陽性微滴分區(qū)最為明顯,拷貝數(shù)最高。最佳的反應(yīng)程序:45 ℃ 5 min,95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,56 ℃ 45 s 共45個(gè)循環(huán)。

2.2 ddPCR檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

2.2.1 與行標(biāo)FQ-PCR方法敏感性比較試驗(yàn) 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示,相關(guān)系數(shù)R2為0.993,斜率為-3.647。本研究建立的ddPCR方法線性動(dòng)態(tài)靈敏度范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=-1.045 3x+4.193,R2為99.8%(圖1)。ddPCR方法檢測(cè)極限為0.15 copies·μL-1(圖2),行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR方法檢測(cè)下限為10 copies·μL-1。結(jié)果表明,本研究建立的ddPCR方法敏感性明顯高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR方法。

圖1 ddPCR方法對(duì)PEDV檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of PEDV detection by ddPCR method

圖2 ddPCR方法對(duì)10倍梯度稀釋的PEDV檢測(cè)Fig.2 Detection of PEDV with 10-fold gradient dilution by ddPCR

2.2.2 特異性試驗(yàn) 使用本研究建立方法,僅PEDV陽性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增,拷貝數(shù)為10 087 copies·μL-1,陰性對(duì)照以及PDCoV、PRV、TGEV等11種全基因組核酸均未出現(xiàn)陽性微滴。結(jié)果表明,本研究建立的ddPCR方法特異性強(qiáng)。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 結(jié)果顯示,批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)(CV)為2.10%～7.40%;批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)(CV)為1.52%～7.40%(表4)。結(jié)果表明,本研究建立的ddPCR方法重復(fù)性好。

2.2.4 ddPCR檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè) 本研究建立的ddPCR方法和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR方法對(duì)150份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示:行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR方法檢出76份陽性樣品,檢出率為50.6%;ddPCR方法檢出89份陽性樣品,檢出率為59.3%(其中76份為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR方法檢測(cè)陽性樣品,13份為行標(biāo)FQ-PCR方法檢測(cè)陰性樣品);其中,ddPCR方法檢出的63份陽性樣品中的48份與標(biāo)準(zhǔn)熒光PCR檢測(cè)陽性結(jié)果一致。結(jié)果表明,本研究建立的ddPCR方法靈敏性高,具有很好的臨床應(yīng)用效果,可以有效避免漏檢。

表3 ddPCR方法檢測(cè)PEDV的重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 Repeatability test of ddPCR method for PEDV detection

3 討 論

近年來,非洲豬瘟、豬流行性腹瀉、豬丁型冠狀病毒病、豬偽狂犬病等豬重要病毒性疫病嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全[11]。由PEDV變異毒株引起的豬群腹瀉性疫病是當(dāng)前除非洲豬瘟以外嚴(yán)重影響我國生豬養(yǎng)殖的重要疫病[12]。目前對(duì)PEDV感染進(jìn)行快速、敏感的病原學(xué)檢測(cè)的常用手段是FQ-PCR方法,其存在敏感性低、判讀需依賴Ct值等問題。建立PEDV ddPCR方法對(duì)PEDV感染的早期診斷、PEDV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制以及PEDV疫苗抗原含量評(píng)價(jià)等具有重要意義。

綜合考慮到變異毒株和經(jīng)典毒株的保守區(qū)域,本研究在設(shè)計(jì)引物對(duì)/探針時(shí)選擇能涵蓋變異毒株與經(jīng)典毒株的M基因[13],以建立適用性更廣的PEDV ddPCR方法。在設(shè)計(jì)引物的同時(shí),嚴(yán)格控制退火溫度之間的差距,保證上下游引物Tm值的差距最小。對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,當(dāng)退火溫度為56 ℃時(shí),PEDV陰陽性微滴分區(qū)最為明顯,可疑微滴最少,拷貝數(shù)最高。證明引物之間有著較好的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性。

本研究對(duì)自建FQ-PCR方法和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR方法[10]進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,自建的FQ-PCR方法在檢測(cè)的敏感性、重復(fù)性方面優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR方法。為了使ddPCR方法的檢測(cè)定量更加準(zhǔn)確,本研究選取敏感性強(qiáng)、重復(fù)性好的自建FQ-PCR方法的引物對(duì)/探針來建立ddPCR方法。本研究建立的ddPCR方法,極大地提高了檢測(cè)的靈敏性,其特異性較強(qiáng),與PDCoV、PRV等11種病毒均無交叉反應(yīng)。當(dāng)PEDV處于潛伏期感染時(shí),病毒的含量較低,使用普通PCR方法和熒光RT-PCR方法很難檢測(cè)到。而本研究建立的ddPCR方法最低檢測(cè)極限為0.15 copies·μL-1,為PEDV早期檢測(cè)提供了重要的技術(shù)手段。另外,臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示,ddPCR與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR方法符合率為100%,敏感性高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR,能夠滿足PEDV的臨床樣品檢測(cè)。

采用ddPCR方法和FQ-PCR方法對(duì)150份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,ddPCR方法對(duì)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FQ-PCR方法檢測(cè)陽性樣品的檢測(cè)符合率為100%。在PEDV感染早期及病毒含量較低的臨床樣品檢測(cè)中,ddPCR方法更具有檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié) 論

本研究基于PEDVM基因保守區(qū)域?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物對(duì)和探針,經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)體系及反應(yīng)條件,建立了一種敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、臨床應(yīng)用效果佳的PEDV ddPCR方法,為臨床上PEDV感染的早期診斷和定量檢測(cè)、PEDV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制以及豬流行性腹瀉防控等提供了技術(shù)手段。