黃師，莫茵茵，羅綠景，劉會(huì)婷，陳崢宇，李根亮*

1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，廣西 百色 533000

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率及致死率均位居前五位［1］。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是其中占比最多的分型。肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，危險(xiǎn)因素多，起病隱匿，發(fā)展迅速且預(yù)后差，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰老對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝有一定影響，是致癌因素刺激后細(xì)胞作出的一種反應(yīng)，與癌癥的發(fā)生發(fā)展有緊密的關(guān)系。目前已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰老與肝癌的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性，通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞衰老可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖［2］，但其具體作用方式仍然不夠明確。

核糖核蛋白NHP2 是端粒酶和小核仁核糖核蛋白（snoRNP）復(fù)合物的關(guān)鍵成分，屬于端粒酶復(fù)合物的一部分，能維持染色體末端的穩(wěn)定［3］。已有研究發(fā)現(xiàn)，NHP2 的下調(diào)后一定程度上可以抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)，從而破壞端粒酶復(fù)合物的穩(wěn)定性［4］。NHP2 突變引起的端粒生物學(xué)障礙（telomere biology disorders，TBDs）被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞衰老、癌癥具有關(guān)聯(lián)［5］，這在胃癌、肺癌中也有相關(guān)報(bào)道［5-6］，但是在肝癌中的研究比較少見(jiàn)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析NHP2 的靶向miRNAs 和lncRNAs，以期探究細(xì)胞衰老相關(guān)基因NHP2在HCC中的表達(dá)及可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞衰老相關(guān)基因和肝癌差異表達(dá)基因的獲取

在Quick Go 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ebi.ac.uk/QuickGO/）中進(jìn)行基因檢索，檢索結(jié)果“taxon”選項(xiàng)卡內(nèi)選擇“Homo sapiens”，點(diǎn)擊“apply”。共得99 個(gè)與細(xì)胞衰老生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的基因。打開(kāi)GEPIA2 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）左側(cè)“Expression Analysis”，在下拉菜單中選擇“Differential genes”，“Dataset”中選擇“LIHC”，設(shè)定“Chromosomal Distribution”為both。下載獲取肝細(xì)胞癌的差異表達(dá)基因。將兩者進(jìn)行韋恩圖分析（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），找出共表達(dá)基因。

1.2 目的基因的獲取和泛癌分析

將共表達(dá)基因放入STRING 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn.string-db.org/）進(jìn)行蛋白互作，找出共表達(dá)基因相關(guān)的互作蛋白，使用TIMER 2.0（http：//timer.cistrome.org/）、UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ualcan.path.uab.edu/index.html）分析共表達(dá)基因在泛癌中的差異表達(dá)及肝癌和其他泛癌病理進(jìn)展過(guò)程中的表達(dá)，預(yù)測(cè)其在肝癌中的預(yù)后生存關(guān)系。

1.3 共表達(dá)基因的互作蛋白及功能分析

將共表達(dá)基因放入互作蛋白在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)STRING，檢索共表達(dá)基因及其編碼蛋白的互作蛋白。將共表達(dá)基因及相關(guān)基因放入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行功能分析。

1.4 共表達(dá)基因的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

將共表達(dá)基因放入miRNet 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.mirnet.ca/miRNet/home.xhtml）的“Genes”板塊，物種選擇為“H.sapiens（human）”，ID 類型選擇“official gene symbol”，目標(biāo)類型為“miRNA”，在列表中輸入共表達(dá)基因后發(fā)送，得到其靶向miRNAs。將其靶向的miRNAs 在該數(shù)據(jù)庫(kù)中繼續(xù)查找其靶向lncRNA。將得到的基因放入Cytescape v3.8.0 軟件（https：//cytoscape.org/download.html）中制作ceRNA靶向圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 19 個(gè)差異表達(dá)基因參與了肝癌細(xì)胞衰老的生物學(xué)過(guò)程

在Quick Go數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的與細(xì)胞衰老相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程相關(guān)基因113 個(gè)。在GEPIA 2 在線數(shù)據(jù)庫(kù)下載的肝癌差異表達(dá)基因2 206 個(gè)。將兩者進(jìn)行共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，共有包括NHP2在內(nèi)的19 個(gè)差異表達(dá)基因參與了肝癌細(xì)胞衰老的生物學(xué)過(guò)程（圖1），表明這19 個(gè)細(xì)胞衰老相關(guān)基因參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展。

圖1 Quick Go細(xì)胞衰老基因與GEPIA 2 HCC差異表達(dá)基因的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of cell senescence gene in Quick Go base and DEGs in GEPIIA 2 of HCC

2.2 NHP2在泛癌中的表達(dá)

經(jīng)在線數(shù)據(jù)庫(kù)TIMER 2.0 分析發(fā)現(xiàn)，NHP2基因在多種癌癥中顯著高表達(dá)?？偨Y(jié)TCGA 臨床病例數(shù)據(jù)，與UALCAN 共同分析發(fā)現(xiàn)，NHP2 在肝癌人群及其他多個(gè)腫瘤中高表達(dá)，一定程度上表明NHP2 參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，可能是腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)（圖2～3）。

圖2 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中NHP2在HCC中的表達(dá)情況Fig.2 The expression of NHP2 in HCC in UALCAN database

圖3 TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)中NHP2在多種腫瘤中的表達(dá)情況Fig.3 Expression of NHP2 in a variety of tumors in TIMER 2.0 database

2.3 NHP2基因的互作蛋白及功能分析

NHP2基因編碼的互作蛋白有10 個(gè)，分別是DKC1、FBL、GAR1、NAF1、NHP2L1、NOP10、NOP56、NOP58、RUVBL1、TERT（圖4）。將其相關(guān)基因放入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因主要參與了1 個(gè)KEGG 信號(hào)通路，即真核生物核糖體發(fā)生的信號(hào)通路，6 個(gè)分子功能（MF），如端粒酶RNA 結(jié)合、端粒酶活性、H/ACA SnoRNA 結(jié)合及ATP 酶結(jié)合等，11 個(gè)細(xì)胞組分（CC），如核蛋白復(fù)合物、端粒酶全酶復(fù)合物、小核仁和蛋白復(fù)合物及染色體端粒區(qū)等，7 個(gè)生物學(xué)過(guò)程（BP），如核糖體生物發(fā)生、端粒中端粒酶的維持、端粒酶RNA 的穩(wěn)定及對(duì)端粒酶活性的正向調(diào)節(jié)等（圖5）。

圖4 NHP2的互作蛋白Fig.4 The PPI of NHP2

2.4 NHP2與肝癌疾病進(jìn)展的分析

經(jīng)UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)分析，NHP2 在HCC 中的表達(dá)具有明確的意義。隨著HCC 的進(jìn)展加重，NHP2 表達(dá)水平越高，與其發(fā)病年齡、疾病分期具有顯著的相關(guān)性（圖6）。GEPIA 2 數(shù)據(jù)庫(kù)分析也得出相似的結(jié)論。如圖7、8 所示，經(jīng)預(yù)后生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，NHP2 高表達(dá)組在肝癌的預(yù)后較差，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。故NHP2 在包括HCC 的多種腫瘤的臨床疾病進(jìn)展中具有一定關(guān)聯(lián)，對(duì)HCC 的治療和預(yù)后分析具有一定的參考價(jià)值。

圖6 NHP2在HCC不同狀態(tài)的對(duì)比結(jié)果Fig.6 Comparison of NHP2 in different states of HCC

圖7 NHP2在泛癌的疾病分期對(duì)比結(jié)果Fig.7 Comparison of NHP2 in disease staging in pancarcinoma

圖8 NHP2在HCC中的預(yù)后生存分析Fig.8 Prognostic survival analysis of NHP2 in HCC

2.5 NHP2基因ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

將NHP2 放入miRNet 數(shù)據(jù)進(jìn)行靶向RNA 分析，得出其靶向miRNAs 有2 個(gè)：hsa-miR-1-3p 和hsa-miR-124-3p，其靶向的lncRNAs 有57 個(gè)。將其靶向關(guān)系放入Cytoscape 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，得出NHP2 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（圖9）。NHP2 在HCC 中可能通過(guò)lncRNAs/miR-1-3p/NHP2 或lncRNAs/miR-124-3p/NHP2調(diào)控軸進(jìn)行調(diào)節(jié)。

圖9 NHP2的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig.9 CeRNA regulatory network diagram of NHP2

3 討論

目前，原發(fā)性肝癌的全球發(fā)病數(shù)已超過(guò)90 萬(wàn)例［7］，HCC 是其中最常見(jiàn)的類型。HCC 發(fā)病通常與生活環(huán)境、飲食、遺傳、炎癥刺激等因素相關(guān)［8］，治療方式包括手術(shù)切除、免疫治療、肝移植、介入治療等［9］?？偟膩?lái)說(shuō)，肝癌起病隱匿，進(jìn)展迅速，容易復(fù)發(fā)和耐藥，預(yù)后差［2］。細(xì)胞衰老是抑制腫瘤生長(zhǎng)的潛在機(jī)制，有望為腫瘤的進(jìn)展提供一種治療機(jī)制。

NHP2 是H/ACA snoRNP（小核仁核糖核蛋白）基因家族的成員，是端粒酶復(fù)合物的一部分，能夠調(diào)節(jié)核仁和核漿內(nèi)端粒酶和維持端粒穩(wěn)定［3］。端粒是位于染色體末端的核蛋白結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞衰老相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，端粒酶的激活可以維持端粒的穩(wěn)定，當(dāng)細(xì)胞分裂至Hayflick 界限時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞衰老或凋亡［10］。目前已有研究顯示，端粒酶能夠促使肝細(xì)胞癌無(wú)限增殖［11］。通過(guò)敲低NHP2 抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）表達(dá)和破壞端粒酶復(fù)合物的穩(wěn)定性可以抑制HBx 誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生［4，12］。TERT 是端粒酶的一種催化亞基，由包括NHP2 在內(nèi)的多種蛋白構(gòu)成。TERT 對(duì)端粒酶的活性具有決定性作用，目前有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，TERT 啟動(dòng)子突變與肝細(xì)胞癌的遺傳突變具有重要關(guān)聯(lián)［13-14］。研究還發(fā)現(xiàn)，端粒酶在正常細(xì)胞內(nèi)并不活躍，而在分化能力強(qiáng)的癌細(xì)胞內(nèi)卻很活躍［15-17］。有研究證實(shí)，敲低NHP2 的表達(dá)對(duì)乙肝相關(guān)性肝癌的增殖、端粒酶活性具有抑制作用，能促進(jìn)該類肝癌細(xì)胞的凋亡，分析試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為可能是通過(guò)干擾TERT 的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞的增殖［12］。也有試驗(yàn)證實(shí)，原發(fā)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的端粒酶活性提高，并且端粒的長(zhǎng)度與TERT 的轉(zhuǎn)錄具有相關(guān)性［18］。以上結(jié)果表明，NHP2 在肝癌細(xì)胞衰老機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。

目前，NHP2的具體調(diào)控機(jī)制尚未闡明。ceRNA 網(wǎng)絡(luò)認(rèn)為NHP2 可以調(diào)控腫瘤的增殖和凋亡［19-20］。經(jīng)過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)miRNet分析發(fā)現(xiàn)，NHP2與miR-1-3p、miR-124-3p之間存在靶向關(guān)系，并與lnc00242等57個(gè)lncRNAs之間形成調(diào)控軸。國(guó)內(nèi)學(xué)者在對(duì)胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，lnc00242 競(jìng)爭(zhēng)性地聯(lián)合miR-1-3p后可調(diào)節(jié)mRNA 的表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌的增殖。lncRNA 可能通過(guò)調(diào)控miR-124-3p對(duì)膀胱癌產(chǎn)生生物學(xué)影響，該miRNA 在食管癌、宮頸癌、肝癌、胃癌中的研究中也得出了類似的結(jié)論［21-25］。有研究顯示，linc00174、lncR CYTOR 可以調(diào)控肝癌的增殖活性［26-27］，本研究結(jié)果分析提示該lncRNA是調(diào)控通路上的一部分，所以我們推測(cè)HCC 可能通過(guò)lncRNAs/miR-1-3p/NHP2 或lncRNAs/miR-124-3p/NHP2 調(diào)控軸調(diào)節(jié)其增殖或凋亡過(guò)程。

生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，NHP2屬于細(xì)胞衰老相關(guān)基因，亦屬于HCC 的差異表達(dá)基因。通過(guò)TIMER 2.0和TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，NHP2在包括肝癌的多種癌癥中高表達(dá)，間接證明了在腫瘤中端粒酶活性的提高。對(duì)NHP2基因進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，其參與了真核生物核糖體形成的KEGG，主要參與的CC 有核糖核蛋白復(fù)合物，主要MF如端粒酶RNA的形成，參與的BP如核糖體的形成和通過(guò)端粒酶維持端粒的穩(wěn)定性等。經(jīng)UALCAN和GEPIA 2數(shù)據(jù)庫(kù)分析，利用TCGA病例研究顯示，NHP2的表達(dá)與包括HCC在內(nèi)的多種癌癥分期具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，NHP2可能成為HCC潛在的治療方法和預(yù)后指標(biāo)。

綜上所述，NHP2 作為H/ACA snoRNP 基因家族的一員，在HCC中的表達(dá)高于正常組織，且與腫瘤患者的年齡、分期等狀態(tài)緊密聯(lián)系。數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，NHP2高表達(dá)與患者預(yù)后不佳相關(guān)，NHP2高表達(dá)的HCC患者預(yù)后更差。對(duì)其進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，NHP2與多個(gè)蛋白互作，聯(lián)系緊密，還參與多個(gè)CC、BP 及MF。在對(duì)于HCC 的端粒維持和細(xì)胞衰老過(guò)程中，可能通過(guò)lncRNAs/miR-1-3p/NHP2 或lncRNAs/miR-124-3p/NHP2 調(diào)控軸進(jìn)行調(diào)節(jié)。故NHP2可能參與了HCC的發(fā)展和疾病進(jìn)展，有望作為HCC的治療靶點(diǎn)和預(yù)測(cè)因子。