蘇芳林，羅鑫，唐賽男，黃樂(lè)韻，胡維，陸世龍，冉龍嬌，向少偉

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腎內(nèi)科，南寧 530011；3.廣西中西醫(yī)結(jié)合腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，南寧 530011

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，也是終末期腎病的主要病因，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，演變過(guò)程主要以腎小球基底膜增厚、基質(zhì)擴(kuò)張、內(nèi)皮細(xì)胞功能受損等為主要癥狀，最后繼發(fā)為腎小球硬化癥、腎小管間質(zhì)纖維化等。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療DN 療效顯著，但其具體干預(yù)機(jī)制仍需多方位探究。

糖腎寶復(fù)方（TSB）由黃芪、川芎、三七、葛根和大火草制成，在臨床上已廣泛應(yīng)用于DN 的治療。本課題組前期研究［1-3］發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)下腎臟組織過(guò)表達(dá)的E26 轉(zhuǎn)錄因子-1（E26 transformationspecific，Ets-1）可致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（Fli-1）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecules-1，ICAM-1）表達(dá)升高，內(nèi)皮細(xì)胞遷移率、功能下降明顯，并誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)Ⅳ型膠原（ColⅣ）、纖黏蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）積聚，促進(jìn)腎損害發(fā)生。

近年來(lái)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為中醫(yī)藥研究領(lǐng)域的一種新型工具，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)中藥研發(fā)中對(duì)藥物靶標(biāo)治療策略研究的缺陷，開(kāi)啟了多成分-多靶標(biāo)的新型研究模式［4］。因此，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接及體外細(xì)胞驗(yàn)證手段預(yù)測(cè)并驗(yàn)證TSB 治療DN 的作用機(jī)制，以期為后續(xù)深入研究糖腎寶復(fù)方防治DN 的確切分子機(jī)制提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與動(dòng)物 小鼠腎小球系膜細(xì)胞株（SV40-MES-13，貨號(hào)：CL-0470，STR 鑒定合格，武漢普諾賽生命科技有限公司）。24 只健康雄性SPF級(jí)KM小鼠（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），生產(chǎn)許可證號(hào)〔SCXK（湘）2019-0004〕。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（DW20221229-304）。

1.1.2 儀器 熒光定量PCR 儀（Roche Light Cycler480 美國(guó)）；渦旋混合振蕩器（Scientific Industries Thermo）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（德國(guó)Thermo Fisher公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus）；二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)美墨爾特）；ST 16R 型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.1.3 試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco 美國(guó)），胎牛血清（FBS，Gibco 美國(guó)），引物（上海生工生物科技有限公司），CCK-8 試劑盒（MCE 公司），總RNA 制備試劑盒（莫納生物科技有限公司），cDNA 合成試劑盒（莫納生物科技有限公司），SYBR Green qPCR Mix 試劑盒（莫納生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)組方藥物活性成分及靶點(diǎn)篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php，TCMSP），對(duì)TSB 復(fù)方藥材活性成分進(jìn)行檢索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（druglikeness，DL）≥0.18 為篩選條件，經(jīng)知網(wǎng)檢索相關(guān)文獻(xiàn)收集補(bǔ)充組方藥味關(guān)聯(lián)性化合物［5-14］，最后結(jié)合Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫(kù)得到組方活性成分相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2.2 TSB-DN 疾病交集靶點(diǎn)分析 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/home/）、OMIM（https：//omim.org/）等數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Diabetic nephropathy”為關(guān)鍵詞檢索，搜集DN 相關(guān)靶蛋白并通過(guò)生物信息學(xué)和進(jìn)化基因組學(xué)（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）在線作圖軟件得到“TSB-DN”共同作用靶點(diǎn)及其Venn圖。

1.2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 TSB 治療糖尿病腎病（DN）的交集作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，物種限定“Homo sapiens”設(shè)置置信度值大于0.9，結(jié)合Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行Cyto NCA 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲆訢egree＞中位數(shù)值為條件篩選2 次，并進(jìn)行結(jié)果可視化分析。

1.2.4 交集靶點(diǎn)GO、KEGG 富集分析 將“PPI”分析篩選得到的靶蛋白導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，以“P＜0.05”作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，取前10 數(shù)據(jù)導(dǎo)入微生信數(shù)據(jù)可視化平臺(tái)（https：//www.bioinformatics.com.cn/）中進(jìn)行結(jié)果可視化分析。

1.2.5 “中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將TSB 復(fù)方藥物、活性成分、篩選后的靶點(diǎn)、及通路和相關(guān)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建得到“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖并通過(guò)Network Analasisi進(jìn)行分析。

1.2.6 分子對(duì)接 從Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載經(jīng)“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖”分析得到的核心活性成分2D 結(jié)構(gòu)文件，作為對(duì)接配體分子，再通過(guò)PBD 數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到篩選后的核心靶蛋白文件，作為對(duì)接蛋白。蛋白與配體分別使用PyMOL 和AutoDock Tools 軟件進(jìn)行氫化、去除水分子、能量最小化處理，并用AutoDock Vina 軟件來(lái)完成核心活性成分配體與核心靶蛋白晶體結(jié)構(gòu)的對(duì)接，經(jīng)PyMOL完成最后的對(duì)接結(jié)果可視化處理。

1.2.7 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的藥物制備、動(dòng)物分組與含藥血清制備 依據(jù)前期研究［1-3］，組方分次加蒸餾水1 000 mL 和500 mL，煮沸2 h 和1.5 h，合并藥液，過(guò)濾、濃縮至含生藥2.0 g·mL-1，高壓滅菌后置于4 ℃冰箱封存待用。

24 只KM 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)區(qū)組法分為正常組、糖腎寶低劑量組、糖腎寶高劑量組，每組8 只。分別予以正常組蒸餾水0.3 mL，糖腎寶合劑（按生藥含量計(jì)算）11.375 g·kg-1·d-1、22.75 g·kg-1·d-1（蒸餾水稀釋至 0.3 mL）灌胃，連續(xù)7 d。末次灌胃2 h 后眼球取血，3 000 r·min-1離心30 min，血清56 ℃水浴30min 滅活補(bǔ)體，0.22 μm 無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，即得各組含藥血清。

1.2.8 小鼠腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)與分組干預(yù)SV40-MES-13細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%的胎牛血清培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為4 組：正常對(duì)照組（5.5 mmol·L-1葡萄糖+正常組含藥血清）、高糖組（25 mmol·L-1葡萄糖+正常組含藥血清）、糖腎寶低劑量組（25 mmol·L-1葡萄糖+糖腎寶低劑量組含藥血清）、糖腎寶高劑量組（25 mmol·L-1葡萄糖+糖腎寶高劑量組含藥血清）。

1.2.9 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，使得細(xì)胞以2.5×104·mL-1的密度接種于96 孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組，于對(duì)應(yīng)孔中加入對(duì)應(yīng)組別的葡萄糖溶液及含藥血清進(jìn)行干預(yù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h 后加入CCK-8 顯色。在酶標(biāo)儀上讀取各孔OD450吸光值。

1.2.10 qPCR檢測(cè)靶基因mRNA表達(dá) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，各組用相應(yīng)糖腎寶含藥血清進(jìn)行藥物干預(yù)處理，24 h后棄上清，用Monzol Reagent Pro 法提取細(xì)胞總RNA，采用Mon-Script試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)體系按MonAmp SYBR Green qPCR Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配置。以GADPH為內(nèi)參，采用公式2－△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，各引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 TSB 活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選和查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充，TSB復(fù)方6味中藥材共含有化學(xué)成分102個(gè)，其中黃芪33個(gè)、川芎26 個(gè)、三七20 個(gè)、葛根22 個(gè)、大火草1 個(gè)。Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)、搜集、合并去重后共獲得TSB 作用靶點(diǎn)835 個(gè)，根據(jù)OB 值排序，主要活性成分基本信息見(jiàn)表2。

表2 TSB組方藥物主要活性成分信息Table 2 Information of main active ingredients of TSB prescription drugs

2.1.2 TSB-DN 交集靶點(diǎn)結(jié)果 GeneCards、Dis-GeNET、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)分別篩選得到“Diabetic nephropathy”疾病相關(guān)靶點(diǎn)2 901、1 058、511 個(gè)，通過(guò)合并、刪除重復(fù)靶基因后共獲得3 584個(gè)疾病基因，取TSB 相關(guān)藥物靶點(diǎn)構(gòu)建“TSB-DN Venn 圖”后共獲得443個(gè)“TSB-DN ”交集靶點(diǎn)（圖1）。

圖1 TSB組方與糖尿病腎病交集Venn圖Fig.1 Venn diagram of intersection of TSB prescription and diabetic nephropathy

2.1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 將443 個(gè)“TSB-DN”交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，物種限定“Homo sapiens”，Score 得分≥0.9，篩選得到蛋白互作關(guān)系“TSV”數(shù)據(jù)，結(jié)合Cytoscape 3.7.2 軟件，進(jìn)行Cyto NCA 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，繪制得到TSB 復(fù)方治療DN 的相關(guān)靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖，包含340 個(gè)節(jié)點(diǎn)，339 條邊，通過(guò)Degree＞中位數(shù)，篩選兩次后共得到86 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，篩選后的節(jié)點(diǎn)用紅色表示（圖2），其中Degree 最高的10 靶點(diǎn)分別為SRC、PIK3R1、STAT3、PIK3CA、HSP90AA1、PIK3CB、AKT1、PIK3CD、GRB2、EGFR，它們可能是TSB復(fù)方治療DN 的核心靶點(diǎn)，結(jié)果表明這些蛋白可能在治療DN 過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

圖2 “TSB-DN”交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram of "TSB-DN" intersection target

2.1.4 GO、KEGG 富集分析結(jié)果 將86個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)后進(jìn)行GO 功能富集，得到742條具有顯著意義的條目（P＜0.05），取前10條目可視化結(jié)果（圖3）。TSB復(fù)方治療DN可能與蛋白磷酸化（protein phosphorylation）、蛋白磷酸正調(diào)節(jié)（positive regulation of protein phosphorylation）、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（intracellular signal transduction）、基因表達(dá)正調(diào)控（positive regulation of gene expression）、胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)通路（insulin-like growth factor receptor signaling pathway）、細(xì)胞質(zhì)等離子膜非固有成分（extrinsic component of cytoplasmic side of plasma membrane）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（proteins erine/threonine/tyrosine kinase activity）、ATP結(jié)合（ATP binding）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）等功能相關(guān)。

KEGG 通路富集，得到126 條通路（P＜0.05），取前10 條通路進(jìn)行可視化（圖4）。對(duì)前20 條通路結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，主要涉及疾?。ㄒ倚透窝?、前列腺癌、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染）和信號(hào)通路（PI3K-Akt、AGERAGE、FoxO、ErbB、PD-L1/PD-1 等），其中PI3KAkt、AGE-RAGE、FoxO、ErbB 等可能是TSB 治療DN 發(fā)揮主要作用的信號(hào)通路，以上結(jié)果表明，組方TSB 治療DN 主要是通過(guò)多層次生物學(xué)過(guò)程聯(lián)合不同信號(hào)通路發(fā)揮作用。

2.1.5 “中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖分析 將TSB 復(fù)方治療DN 的86 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)GO、KEGG 富集分析后得到的前20 條通路，與TSB 復(fù)方藥物、藥物成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、通路靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中，構(gòu)建得到“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖5），包含205 個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 066條邊，Network Analasisi 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果表明，依照Degree 排序，TSB 治療DN 的核心活性成分主要為異微凸劍葉莎醇（isomucronulatol）、3，9-di-O-methylnissolin、20（S）-原人參三醇［（20S）-protopanaxatriol）］、香豆雌酚（coumestrol）、甘草素（Liquiritigeni）、華良姜素（jaranol）等。核心靶點(diǎn)主要為 STAT3、CDK1、EGFR、PIK3CD、MAPK8、HSP90AA1、PIK3R1、AR、PIK3CA、PTGS2。該核心靶點(diǎn)與PPI 篩選得到的前10 核心靶點(diǎn)取交集，確定TSB 治療DN 的主要核心靶點(diǎn)為STAT3、EGFR、PIK3CD、HSP90AA1、PIK3R1、PIK3CA 等，表明其治療DN 發(fā)揮主要作用的信號(hào)通路為PI3KAkt、AGE-RAGE、FoxO、ErbB等。

2.1.6 對(duì)接結(jié)果可視化 Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到核心活性成分結(jié)構(gòu)文件，PBD 數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到核心靶蛋白文件，AutoDock Vina 軟件完成核心活性成分與核心靶蛋白分子對(duì)接。結(jié)果（表3）顯示，isomucronulatol、3，9-di-O-methylnissolin、（20S）-protopanaxatriol、coumestrol、Liquiritigeni、jaranol 等與核心靶點(diǎn)STAT3、PIK3CD、PIK3R1、PIK3CA 及關(guān)聯(lián)性靶點(diǎn)ETS-1 等具有較高結(jié)合作用（結(jié)合能＜-7.9 kcal·mol-1）。其中Liquiritigeni、（20S）-protopanaxatriol 與各靶點(diǎn)結(jié)合能相對(duì)較優(yōu)，暗示這二者在TSB 治療DN 的過(guò)程中起到重要作用，通過(guò)PyMOL 對(duì)其部分結(jié)果進(jìn)行可視化，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6 結(jié)果可知，甘草素與20(S)-原人參三醇能夠與各靶蛋白結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)良好結(jié)合從而發(fā)揮中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)相互作用的治療效果。

圖6 分子對(duì)接可視化結(jié)果Fig.6 Molecular docking visualization results

表3 核心活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果Table 3 Results of docking between core active ingredients and core target molecules

2.2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 SV40-MES-13 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) 鏡下可見(jiàn)（圖7），SV40-MES-13 細(xì)胞干預(yù)前，生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)呈梭形或類圓形未分化狀，細(xì)胞透光性良好，胞質(zhì)清晰，胞距緊湊。干預(yù)24 h 后可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變呈梭形凸起及類圓形凸起狀，胞質(zhì)凸起暗淡，邊界模糊，透光性較差，干預(yù)前后細(xì)胞狀態(tài)差異顯著表明含藥血清干預(yù)的有效性。

圖7 SV40-MES-13細(xì)胞含藥血清干預(yù)前后狀態(tài)Fig.7 State of SV40-MES-13 cells before and after treatment with drug-containing serum

2.2.2 SV40-MES-13 細(xì)胞活性比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖8），SV40-MES-13 細(xì)胞在高糖環(huán)境下干預(yù)24 h后，與正常組相比，高劑量組細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.001）。高糖組及低劑量組與正常組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與高糖組相比，高劑量與低劑量組細(xì)胞活性均具有顯著性差異（P＜0.001，P＜0.01）。結(jié)果表明，SV40-MES-13 細(xì)胞經(jīng)高糖刺激后細(xì)胞活性相較于給藥組有所增加，這提示TSB 在作用于細(xì)胞后或起到抑制、鎮(zhèn)靜作用。

圖8 TSB對(duì)SV40-MES-13細(xì)胞活性影響Fig.8 Effect of TSB on SV40-MES-13 cell activity

2.2.3 相關(guān)信號(hào)通路靶基因mRNA表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖9），與正常組比較，高糖組SV40-MES-13 細(xì)胞中PIK3CD、PIK3R1、ETS-1mRNA 表達(dá)量顯著升高，高劑量組細(xì)胞中PIK3CD、PIK3R1、MAPK8、STAT3mRNA 表達(dá)量顯著降低；與正常組比較，低劑量PIK3CD、STAT3mRNA表達(dá)量顯著降低；與高糖組比較，高劑量、低劑量組細(xì)胞中PIK3CD、PIK3R1、STAT3、ETS-1mRNA 表達(dá)量顯著降低。結(jié)果表明，TSB 復(fù)方可能通過(guò)抑制PIK3CD、PIK3R1、MAPK8、STAT3、ETS-1等基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)調(diào)控PI3K-Akt、AGE-RAGE信號(hào)通路，進(jìn)而使得細(xì)胞活性在一定程度上降低并發(fā)揮對(duì)DN的治療作用。與高糖組比較，高劑量組中MAPK8mRNA 表達(dá)量顯著降低，而低劑量組中MAPK8mRNA 表達(dá)量顯著升高，推測(cè)可能是由于低劑量組血清藥物濃度有所不足導(dǎo)致干預(yù)后細(xì)胞基因抑制度不足。

圖9 TSB治療DN相關(guān)信號(hào)通路靶基因結(jié)果Fig.9 Target gene results of DN-related signaling pathway treated by TSB

3 討論

DN 作為DM 最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，由于病因和致病機(jī)理復(fù)雜及嚴(yán)重的糖代謝紊亂，發(fā)展到終末期腎病比其他腎臟疾病的治療更加棘手［15］。當(dāng)前傳統(tǒng)的西醫(yī)治療方法往往伴隨著嚴(yán)重的不良反應(yīng)，對(duì)患者的病情會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。中西醫(yī)結(jié)合技術(shù)因其更好的預(yù)防性能夠更快速、更安全地改善患者病情而成為當(dāng)前的最佳選擇［16］。

DN在中醫(yī)中無(wú)對(duì)應(yīng)病名，其中醫(yī)病機(jī)我國(guó)醫(yī)學(xué)各流派見(jiàn)解各異，如柳紅芳［17］認(rèn)為，DN 病機(jī)主要是精損絡(luò)痹，核心治法為填精通絡(luò)，如《內(nèi)經(jīng)·五變篇》中提出五臟虛弱，正氣不足容易患消癉［18］。本課題組［15］認(rèn)為糖尿病的中醫(yī)病機(jī)以“氣虛血瘀證”為基本，糖腎寶組方（TSB）以黃芪為君，補(bǔ)氣升陽(yáng)；川芎三七葛根共為臣行氣活血化瘀通絡(luò)；以大火草為佐清熱利濕。五藥共用，攻補(bǔ)兼施，益氣活血。在課題組的前期實(shí)驗(yàn)研究和臨床上均體現(xiàn)出明顯效果［19-23］。然而，糖腎寶復(fù)方治療DN 的其他有效活性成分和作用機(jī)制目前尚未得知。

基于此，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，構(gòu)建復(fù)方糖腎寶治療DN 的“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，推測(cè)TSB 治療DN 可能是通過(guò)PIK3R1、STAT3、PIK3CD 等靶基因發(fā)揮作用。KEGG 通路富集結(jié)果顯示，PI3K-Akt、AGE-RAGE、FoxO、ErbB等信號(hào)通路可能是復(fù)方糖腎寶治療DN 的重要機(jī)制，與上述核心靶點(diǎn)存在一定的聯(lián)系。相關(guān)靶基因中PIK3CD 是磷酸肌醇-3 激酶（PI3kinase，PI3K）的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基，是PI3K-AKT 信號(hào)通路的重要組成部分，在細(xì)胞增殖、遷移和癌癥進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用［24］，磷脂酞肌醇-3 激酶調(diào)節(jié)亞基1（PIK3R1）是PI3K 的調(diào)節(jié)亞基之一，主要參與對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。相關(guān)研究表明［25］，PIK3R1 通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)通路緩解肺內(nèi)皮細(xì)胞損傷從而起到調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活與炎癥、細(xì)胞凋亡反應(yīng)［26-28］。而STAT3 是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，具有傳遞信號(hào)的作用，在宮頸癌的進(jìn)展中，宮頸上皮細(xì)胞的失衡與STAT3 激活具有直接關(guān)系［29］。

此外，糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）及其受體RAGE 介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是引發(fā)DN 的經(jīng)典通路之一。大量研究顯示，長(zhǎng)期的高糖環(huán)境容易導(dǎo)致腎臟AGEs/RAGE的生成增多，從而引起腎臟組織ERS 激活，啟動(dòng)PERK 信號(hào)通路，導(dǎo)致患者腎組織細(xì)胞凋亡，繼而出現(xiàn)腎功能顯著損傷［30-32］。

本研究采用分子對(duì)接法、cck8 法、以及qRTPCR 法檢測(cè)DN 相關(guān)疾病通路基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示TSB 組方可通過(guò)抑制PIK3R1、PIK3CD 和MAPK8、STAT3、ETS-1 等靶基因的mRNA 表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)PI3K-Akt、AGE-RAGE 等信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控并發(fā)揮對(duì)DN的治療作用。

綜上，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證揭示了糖腎寶復(fù)方治療DN 的潛在作用機(jī)制，一定程度上證明了糖腎寶復(fù)方能夠通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路治療DN。為臨床應(yīng)用此方治療DN提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，然而本研究中預(yù)測(cè)的其他相關(guān)靶蛋白量的表達(dá)及代謝組學(xué)層面表達(dá)仍具有進(jìn)一步檢測(cè)驗(yàn)證價(jià)值，后續(xù)會(huì)盡可能完善糖腎寶復(fù)方治療DN的多方面研究。