章寅，賈軍偉，白藍(lán)，陳一帆，阮功成，呂貝貝*，潘愛(ài)虎*

1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（環(huán)境）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（上海），上海 201106；2.越南北江農(nóng)林大學(xué)，越南 北江 21000

轉(zhuǎn)基因技術(shù)屬于基因工程領(lǐng)域的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)育種技術(shù)的核心技術(shù)［1］，它通過(guò)打破物種間的界限，從而實(shí)現(xiàn)作物目標(biāo)性狀的定向改變，在緩解資源約束、減少生態(tài)環(huán)境污染、改進(jìn)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、節(jié)水增效、拓展農(nóng)業(yè)功能等方面顯示出重要作用和巨大潛力［2］，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為世界各國(guó)增強(qiáng)農(nóng)業(yè)核心競(jìng)爭(zhēng)力的戰(zhàn)略選擇［3］。

發(fā)展轉(zhuǎn)基因是我國(guó)農(nóng)業(yè)的重大戰(zhàn)略決策。2020 年2 月26 日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳印發(fā)關(guān)于《2020 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村科教環(huán)能工作要點(diǎn)》的通知中提到，組織實(shí)施轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng)，進(jìn)一步強(qiáng)化生物育種技術(shù)研究和產(chǎn)品熟化。轉(zhuǎn)基因?qū)⒊蔀楸Ｕ衔覈?guó)糧食安全、實(shí)現(xiàn)種業(yè)振興的重要手段之一。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)能為轉(zhuǎn)基因食品的有效標(biāo)識(shí)、科學(xué)監(jiān)管、推廣應(yīng)用提供重要的技術(shù)支撐。詳細(xì)有效的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證指南將為我國(guó)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)體系的應(yīng)用推廣提供參考和技術(shù)指導(dǎo)。

1 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系

轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理必不可少的技術(shù)保障［4-7］。在《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》等配套管理辦法的指導(dǎo)下，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局等相關(guān)部門(mén)組織制定了轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系框架和標(biāo)準(zhǔn)修制訂規(guī)劃［4，8-9］。

現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中覆蓋了大豆、水稻、玉米、油菜、棉花、小麥、苜蓿、甜菜、番茄等轉(zhuǎn)基因作物，以及常用的抗病毒、抗蟲(chóng)及耐除草劑基因、報(bào)告基因、內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因等檢測(cè)項(xiàng)目［10］。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)在被相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室使用之前，需要實(shí)驗(yàn)室按照《ISO/IEC17025：2017 檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》或《CNAS-CL01：2018 檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》的要求開(kāi)展方法驗(yàn)證工作，證實(shí)實(shí)驗(yàn)室具備進(jìn)行轉(zhuǎn)基因準(zhǔn)確檢測(cè)的能力。但是上述兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)只給出了方法驗(yàn)證的定義，并沒(méi)有具體開(kāi)展的操作指南，同時(shí)現(xiàn)有的文獻(xiàn)中關(guān)于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的驗(yàn)證缺少科學(xué)性、有效性的參考依據(jù)，故對(duì)于開(kāi)展轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的方法驗(yàn)證分析研究有迫切的需求。

2 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)

2.1 儀器設(shè)備檢定校準(zhǔn)

轉(zhuǎn)基因檢測(cè)數(shù)據(jù)一部分主要依靠?jī)x器設(shè)備直接獲得，因此儀器設(shè)備的狀態(tài)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有著直接的影響。開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證之前需要確認(rèn)儀器設(shè)備的靈敏度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性是否滿(mǎn)足要求。

轉(zhuǎn)基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室主要以出具定性結(jié)果為主，對(duì)儀器設(shè)備的性能指標(biāo)更加重視。關(guān)鍵設(shè)備如定性PCR 儀、實(shí)時(shí)熒光PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)等目前缺乏檢定或校準(zhǔn)規(guī)程，故無(wú)法送至計(jì)量檢定部門(mén)進(jìn)行檢定或校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室可以參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織的儀器比對(duì)或周期性地開(kāi)展內(nèi)部校準(zhǔn)和功能性檢查。其他關(guān)鍵設(shè)備如電子天平、移液器等則需送至計(jì)量檢定部門(mén)檢定或校準(zhǔn)。

2.2 關(guān)鍵試劑及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)收

針對(duì)轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)［11］，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品是檢測(cè)結(jié)果可比、有效和可溯源的重要保障。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求在驗(yàn)證工作開(kāi)始前，需準(zhǔn)備相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品［12］。目前，有資質(zhì)研制轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的單位/機(jī)構(gòu)包括美國(guó)油脂化學(xué)家學(xué)會(huì)、歐盟聯(lián)合研究中心、中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心等［13］。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也分為基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、基因組DNA 和質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［14-16］。方法驗(yàn)證時(shí)需要根據(jù)實(shí)際的樣品種類(lèi)、含量以及形態(tài)特征選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測(cè)定值來(lái)核實(shí)標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證的有效性和準(zhǔn)確性［17］。

除了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，DNA 提取試劑盒、DNA 聚合酶、引物、探針、PCR 反應(yīng)緩沖液等也是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的關(guān)鍵試劑耗材，標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證過(guò)程中需要對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)收，并做好驗(yàn)收記錄。

2.3 技術(shù)參數(shù)驗(yàn)證

精密度、線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限是標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證中需要進(jìn)行有效驗(yàn)證的特性參數(shù)，上述指標(biāo)在食品理化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中有詳細(xì)的操作步驟和技術(shù)要求，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)屬于分子生物學(xué)檢測(cè)范疇，缺少此類(lèi)的驗(yàn)證技術(shù)指導(dǎo)。國(guó)際上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法驗(yàn)證的研究可參考?xì)W盟聯(lián)合研究中心的權(quán)威指南文件《Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods》（EUR 24790 EN，JRC）。上述指南中規(guī)定，準(zhǔn)確度驗(yàn)證至少選擇包括接近定量限在內(nèi)的3 個(gè)不同濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，每個(gè)濃度水平要得到16 個(gè)PCR平行結(jié)果，平均值通過(guò)一定的計(jì)算公式計(jì)算，結(jié)果應(yīng)在可接受參考值的±25%內(nèi)。重復(fù)性驗(yàn)證主要通過(guò)PCR 平行試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，選取5%、1%、0.5%、0.1%這4 個(gè)不同轉(zhuǎn)基因含量的樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)水平至少要得到16個(gè)獨(dú)立測(cè)量結(jié)果，計(jì)算得到相對(duì)可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差，要求結(jié)果應(yīng)在可接受參考值的±25%內(nèi)。定量限的驗(yàn)證用一個(gè)低轉(zhuǎn)基因濃度的陽(yáng)性對(duì)照樣品的至少10次PCR平行重復(fù)來(lái)測(cè)量，如果所有的平行重復(fù)結(jié)果都是陽(yáng)性，這表示實(shí)驗(yàn)室的定量限低于或等于該標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)定的陽(yáng)性對(duì)照水平［18-19］。

2.4 環(huán)境區(qū)域隔離

在開(kāi)展驗(yàn)證之前，需要保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境未被污染。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)主要針對(duì)DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子，檢測(cè)方法又具有高靈敏性，實(shí)驗(yàn)室需要重點(diǎn)考慮氣溶膠污染和交叉污染。因此日常實(shí)驗(yàn)室需要有效分區(qū)，檢測(cè)區(qū)和實(shí)驗(yàn)室要隔離，可設(shè)置為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物檢測(cè)區(qū)等。對(duì)空調(diào)、生物安全柜等設(shè)施定期保養(yǎng)維護(hù)。有條件的實(shí)驗(yàn)室安裝空氣過(guò)濾系統(tǒng)，并時(shí)常進(jìn)行房間通風(fēng)，定期進(jìn)行紫外線(xiàn)照射，有效控制氣溶膠對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證的影響［20-21］。

3 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證工作建議

3.1 積極參加能力驗(yàn)證工作

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)自身開(kāi)展的轉(zhuǎn)基因方法驗(yàn)證工作屬于內(nèi)部質(zhì)量控制方法的一種，能有效監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室在技術(shù)能力、資源配置、體系保證等方面的符合程度，但該方法無(wú)法有效消除實(shí)驗(yàn)室內(nèi)誤差，而參加能力驗(yàn)證則可以很好地解決這一問(wèn)題。通過(guò)參加權(quán)威能力驗(yàn)證單位組織的驗(yàn)證工作，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室可直觀(guān)判定本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，及時(shí)識(shí)別出實(shí)驗(yàn)室存在的質(zhì)量問(wèn)題，從而更好地評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證工作。

3.2 注重積累定量檢測(cè)方法驗(yàn)證經(jīng)驗(yàn)

現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)以定性檢測(cè)為主，在方法驗(yàn)證過(guò)程中缺乏對(duì)數(shù)據(jù)定量結(jié)果的驗(yàn)證工作。隨著轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度在中國(guó)及國(guó)際上的不斷推行，很多國(guó)家不僅要求對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行定性檢測(cè)，更加會(huì)對(duì)定量檢測(cè)提出需求，故轉(zhuǎn)基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室需要加強(qiáng)對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)真實(shí)性、準(zhǔn)確性等方面的驗(yàn)證工作，同時(shí)要對(duì)數(shù)字PCR 等一系列定量檢測(cè)儀器的計(jì)量校準(zhǔn)工作提前準(zhǔn)備。國(guó)外轉(zhuǎn)基因含量標(biāo)識(shí)的閾值一般在0.9%～5%之間［22］，標(biāo)準(zhǔn)方法在驗(yàn)證過(guò)程中要更加注重這幾個(gè)點(diǎn)的驗(yàn)證工作，有條件時(shí)還需要完成不確定度的評(píng)價(jià)工作，以便為標(biāo)準(zhǔn)方法的驗(yàn)證工作提供更加全面完善的信息。

3.3 拓展標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的日常質(zhì)量控制

轉(zhuǎn)基因檢測(cè)過(guò)程中，要同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，以此來(lái)確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程的可塑性和可比性，故實(shí)驗(yàn)室要將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)納入到日常的質(zhì)量控制中。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以購(gòu)買(mǎi)大豆、玉米、油菜等作物特定品系的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，也可以購(gòu)買(mǎi)目前研究比較熱門(mén)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子。已有報(bào)道將包括CaMV35S 啟動(dòng)子、NOS 終止子在內(nèi)的8 個(gè)調(diào)控原件轉(zhuǎn)化到質(zhì)粒上，形成陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，可用于轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)與研究。該方法不僅能減少陽(yáng)性物質(zhì)的反復(fù)提取，降低污染，同時(shí)能覆蓋大多數(shù)轉(zhuǎn)化體，提高檢測(cè)的覆蓋面。

3.4 探索引入國(guó)際GLP質(zhì)量管理準(zhǔn)則

良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范（good laboratory practice，GLP），作為一種國(guó)際認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系，常被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等重要領(lǐng)域的非臨床安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)數(shù)據(jù)成為監(jiān)管部門(mén)作出行政審批的技術(shù)依據(jù)，直接關(guān)系著我國(guó)轉(zhuǎn)基因技術(shù)未來(lái)的發(fā)展方向，世界上美國(guó)、歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家均已將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物領(lǐng)域。在將來(lái)的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證工作中，可以探索引入GLP 準(zhǔn)則中的質(zhì)量要求，從而更好保障數(shù)據(jù)的真實(shí)性和可追溯性，以期為轉(zhuǎn)基因生物安全管理、研發(fā)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供借鑒。

4 展望

轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)是保證我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全管理制度順利實(shí)施的重要技術(shù)支撐，隨著我國(guó)生物育種產(chǎn)業(yè)化的推進(jìn)，轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化種植和轉(zhuǎn)基因研發(fā)新技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因研究試驗(yàn)、生產(chǎn)加工、進(jìn)出口和標(biāo)簽標(biāo)識(shí)等方面的監(jiān)管任務(wù)劇增，我國(guó)必然需要增加轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的技術(shù)力量。建立一套詳細(xì)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)霓D(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，保障檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性、準(zhǔn)確性、可比性和溯源性，有利于各家機(jī)構(gòu)統(tǒng)一化、高標(biāo)準(zhǔn)地開(kāi)展方法驗(yàn)證工作，同時(shí)便于監(jiān)管機(jī)構(gòu)開(kāi)展對(duì)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的評(píng)審考核工作，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系的能力水平，促進(jìn)我國(guó)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)水平與國(guó)際對(duì)標(biāo)，為我國(guó)農(nóng)業(yè)生物安全監(jiān)管工作提供堅(jiān)強(qiáng)的技術(shù)支撐。未來(lái)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證規(guī)程需要具備以下幾方面的要求。

首先，驗(yàn)證規(guī)程需要適用多類(lèi)型機(jī)構(gòu)。轉(zhuǎn)基因監(jiān)管的檢測(cè)機(jī)構(gòu)數(shù)量需要進(jìn)一步增加，除了部級(jí)質(zhì)檢機(jī)構(gòu)、出入境檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)等政府實(shí)驗(yàn)室，還應(yīng)將社會(huì)實(shí)驗(yàn)室補(bǔ)充進(jìn)入轉(zhuǎn)基因政府監(jiān)管工作中。這些機(jī)構(gòu)在建設(shè)布局、條件水平、質(zhì)量體系、運(yùn)行模式，檢測(cè)能力等方面存在巨大差異，而轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作很敏感，公眾關(guān)注度高，檢測(cè)數(shù)據(jù)的真實(shí)性要求高。驗(yàn)證規(guī)程要適用大部分的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，以同一尺度開(kāi)展驗(yàn)證工作，從儀器設(shè)備檢定校準(zhǔn)、關(guān)鍵試劑及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)收、技術(shù)參數(shù)驗(yàn)證、環(huán)境區(qū)域隔離等關(guān)鍵參數(shù)開(kāi)展驗(yàn)證工作。

其次，驗(yàn)證規(guī)程需適用于新型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)支撐轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作的開(kāi)展、數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、有效性和可追溯性具有重要意義。國(guó)務(wù)院印發(fā)的《計(jì)量發(fā)展規(guī)劃（2021—2035 年）》要求“建立完善以國(guó)家基準(zhǔn)物質(zhì)、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和工作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為主要組成部分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)體系”，要求加快重點(diǎn)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制和應(yīng)用。隨著農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因重大專(zhuān)項(xiàng)“基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制”等項(xiàng)目的實(shí)施，我國(guó)已經(jīng)具備研發(fā)轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的能力［23］。未來(lái)除了現(xiàn)有的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，新型的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也將成為方法驗(yàn)證中重要的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［24］，其具有制備靈活、不受樣品影響、性質(zhì)簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，將成為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證重要的技術(shù)材料。

最后，驗(yàn)證規(guī)程需適應(yīng)新型檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。目前，國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)體系中的主流技術(shù)為普通PCR，將來(lái)隨著轉(zhuǎn)基因作物分子特征分析、精準(zhǔn)定量、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值等工作的開(kāi)展，精準(zhǔn)定量、快速檢測(cè)技術(shù)、高通量檢測(cè)技術(shù)、基因編輯產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量將增加［25-26］，實(shí)驗(yàn)室需要做好相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)能力的儲(chǔ)備工作。