張永紅，李巖異 ，張衛(wèi)婷

華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，石家莊 050035

病毒基因組整合到宿主基因組中形成原病毒，是所有逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的重要步驟。然而，不同類(lèi)型的逆轉(zhuǎn)錄病毒整合位點(diǎn)的分布不同。例如，包括人類(lèi)免疫缺陷病毒1 亞型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）在內(nèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)慢病毒優(yōu)先整合到基因密集區(qū)域處表達(dá)基因；嵌合抗原受體T 細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）作為基因編輯性細(xì)胞治療方法，采用慢病毒整合性載體，將外源基因插入并整合到細(xì)胞基因組中［1］。某些位置的插入，可能會(huì)誘導(dǎo)原癌基因的激活、抑癌基因的失活、基因融合等，引起成瘤風(fēng)險(xiǎn)。在持續(xù)的細(xì)胞治療過(guò)程中，這種潛在的成瘤性，往往具有明顯的滯后性且很難預(yù)測(cè)。因此，CAR-T 治療需要評(píng)估潛在的插入突變風(fēng)險(xiǎn)和致癌風(fēng)險(xiǎn)［2］。

載體整合位點(diǎn)檢測(cè)已成為CAR-T 治療方法臨床試驗(yàn)的安全性評(píng)估要求。2020年9月國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心（Center for Drug Evaluation，CDE）發(fā)布的《細(xì)胞治療產(chǎn)品申請(qǐng)臨床試驗(yàn)藥學(xué)研究和申報(bào)資料的考慮要點(diǎn)》中關(guān)于“生產(chǎn)工藝開(kāi)發(fā)的技術(shù)要求”及“質(zhì)量研究和質(zhì)量控制中的安全性研究”部分要求：提供目的基因在染色體中的整合情況及對(duì)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化（成瘤性和致瘤性）進(jìn)行安全性研究和內(nèi)容評(píng)估。2020 年2 月CDE 發(fā)布的《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中規(guī)定：探索性臨床試驗(yàn)的安全性和耐受性要考慮“外源基因隨機(jī)整合到細(xì)胞基因組形成插入突變，導(dǎo)致成瘤性和惡性轉(zhuǎn)化等”。對(duì)確證性臨床試驗(yàn)的療效和安全性要求“繼續(xù)監(jiān)測(cè)安全性風(fēng)險(xiǎn)，分析重要的已知和潛在的風(fēng)險(xiǎn)信息，包括遲發(fā)性不良事件（如致瘤性）的發(fā)生率、嚴(yán)重性和危險(xiǎn)因素等，并有必要采取措施使風(fēng)險(xiǎn)最小化”。2021 年2 月CDE 發(fā)布的《基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》則明確將“插入突變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估”作為非臨床安全性研究的內(nèi)容，并詳細(xì)規(guī)定了關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素的評(píng)估要點(diǎn)。由此可見(jiàn)，慢病毒載體整合位點(diǎn)檢測(cè)已經(jīng)成為細(xì)胞治療產(chǎn)品新藥臨床試驗(yàn)申請(qǐng)（investigational new drug，IND）及臨床試驗(yàn)安全性評(píng)估的必檢內(nèi)容。

1 整合位點(diǎn)的分析技術(shù)

由于基因重組技術(shù)帶來(lái)的潛在危害，科學(xué)家利用現(xiàn)代基因測(cè)序技術(shù)，對(duì)外源基因整合位點(diǎn)進(jìn)行分析，并用于生物安全性評(píng)價(jià)。

慢病毒進(jìn)入易感靶細(xì)胞后，逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）基因組的兩個(gè)正義拷貝復(fù)制成線性雙鏈DNA 分子，每個(gè)分子都包含病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列（long terminal repeat，LTR）。病毒整合酶完成病毒DNA（viral DNA，vDNA）整合，包括 HIV-1 在內(nèi)的慢病毒可以有效地感染非分裂靶細(xì)胞，而以γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒莫洛尼鼠白血病病毒為代表的其他類(lèi)型的逆轉(zhuǎn)錄病毒則不能感染［3］。提取受感染細(xì)胞原病毒 DNA 和繪制整合位點(diǎn)等技術(shù)，經(jīng)歷近40年的發(fā)展，已日趨成熟［4］。

1.1 Southern 雜交技術(shù)

通過(guò)使用限制性核酸內(nèi)切酶消化感染細(xì)胞病毒基因組DNA（genomic DNA，gDNA）片段，證實(shí)病毒基因插入宿主細(xì)胞基因組中［5］。由于雜交顯現(xiàn)出多個(gè)條帶，證明整合可以發(fā)生在宿主基因組的多個(gè)位點(diǎn)。利用消化和電泳分離宿主gDNA 后，使用病毒DNA 探針進(jìn)行Southern 雜交印跡時(shí)，實(shí)驗(yàn)分辨率得到進(jìn)一步增強(qiáng)。多項(xiàng)研究已證實(shí)，逆轉(zhuǎn)錄病毒可以整合到gDNA 多個(gè)位置，但無(wú)法判斷這種整合是否為隨機(jī)整合。通過(guò)對(duì)宿主gDNA 進(jìn)行分級(jí)分離（例如長(zhǎng)度或GC 含量），結(jié)果顯示整合位點(diǎn)傾向分布于富含GC 的gDNA 區(qū)域［6］。

DNA 測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，對(duì)整合位點(diǎn)的序列分析起到了推動(dòng)作用。研究中主要通過(guò)Maxam Gilbert 化學(xué)法［7］或雙脫氧測(cè)序法［8］，對(duì)使用限制性核酸內(nèi)切酶消化后的分級(jí)gDNA 片段進(jìn)行測(cè)序，從而確定逆轉(zhuǎn)錄病毒整合位點(diǎn)的初始序列。這些研究為不同逆轉(zhuǎn)錄病毒靶位點(diǎn)重復(fù)（targetsite duplications，TSD）的分類(lèi)奠定了重要基礎(chǔ)，并且已知轉(zhuǎn)座會(huì)產(chǎn)生位于這些移動(dòng)遺傳元件兩側(cè)的短TSD［9］，由此首次發(fā)現(xiàn)了整合與 DNA 轉(zhuǎn)座有關(guān)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的進(jìn)一步發(fā)展，為逆轉(zhuǎn)錄病毒整合位點(diǎn)選擇的新興領(lǐng)域提供了技術(shù)支持，且該技術(shù)大大簡(jiǎn)化了對(duì)特定vDNA-gDNA 的研究。

1.2 反向 PCR檢測(cè)技術(shù)

反向 PCR［10］是整合位點(diǎn)測(cè)序中早期應(yīng)用的一種技術(shù)，用于vDNA-gDNA測(cè)序之前使用與已知序列（例如病毒 LTR）互補(bǔ)的外向引物擴(kuò)增自連接的gDNA 片段。這種方法早期用于細(xì)胞與猿猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）多瘤病毒共感染細(xì)胞來(lái)提供具有特征性轉(zhuǎn)座子DNA（transferred DNA，tDNA）底物的鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus，Mo-MLV），SV40 多瘤病毒作為細(xì)胞核中的未整合附加體達(dá)到高拷貝數(shù)［11］。SV40 特異性引物可與 Mo-MLV LTR 引物串聯(lián)使用，以放大出現(xiàn)在該過(guò)量tDNA源中的整合位點(diǎn)。此外，病毒共感染的替代方案涉及設(shè)計(jì)引物，當(dāng)整合恰好發(fā)生在范圍內(nèi)時(shí)，會(huì)偽隨機(jī)啟動(dòng)gDNA 序列［12］，這種方法是藤黃節(jié)桿菌（Arthrobacter luteus，Alu）分泌型核酸限制性內(nèi)切酶識(shí)別重復(fù)序列實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)的基礎(chǔ)，用于確定細(xì)胞培養(yǎng)物和患者樣本中 HIV-1的整合水平。

1.3 配體介導(dǎo)的PCR檢測(cè)技術(shù)

隨著連接介導(dǎo)的 PCR 或配體介導(dǎo)的PCR（ligationr-mediated，LM-PCR）的發(fā)展，單個(gè)整合位點(diǎn)的回收效率取得了重大突破［13］。在這種方法中，gDNA 被限制酶消化，將包含“粘性”末端的寡核苷酸盒（也稱(chēng)為接頭）連接到所有消化片段上，然后使用與病毒 LTR 和接頭序列互補(bǔ)的引物完成整合位點(diǎn)的 PCR 擴(kuò)增。隨著人類(lèi)、小鼠和其他宿主基因組參考序列的完成，這種文庫(kù)構(gòu)建和 DNA測(cè)序的結(jié)合可以用于對(duì)不同類(lèi)型逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合位點(diǎn)分布的研究。到目前為止，載體-基因組連接的下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)允許對(duì)體內(nèi)和體外的整合庫(kù)進(jìn)行復(fù)雜研究。例如，研究人員探索了使用 Illumina MiSeq個(gè)人測(cè)序儀平臺(tái)對(duì)線性擴(kuò)增介導(dǎo)的 PCR（restrictive linear amplification mediated PCR，LAM-PCR）和非限制性線性擴(kuò)增介導(dǎo)的 PCR（non restrictive linear amplification mediated PCR，nrLAM-PCR）擴(kuò)增的載體整合位點(diǎn)（integration site，IS）進(jìn)行測(cè)序。其中，基于MiSeq 的高質(zhì)量 IS 序列檢索是通過(guò)引入雙條形碼策略來(lái)實(shí)現(xiàn)的，與傳統(tǒng)使用的單條形碼協(xié)議相比，該策略大大減少了IS 序列沖突的頻率。

LM-PCR 擴(kuò)增與強(qiáng)大的NGS 平臺(tái)的結(jié)合，例如454 Life Sciences 的焦磷酸測(cè)序和 Illumina 基于 DNA 簇的測(cè)序，使整合位點(diǎn)的檢測(cè)數(shù)量猛增，由使用NGS 之前的數(shù)百個(gè)到最終的數(shù)十萬(wàn)和數(shù)百萬(wàn)［14］。用超聲法代替限制性核酸內(nèi)切酶消化gDNA 片段的方法［15］，實(shí)現(xiàn)了對(duì)獨(dú)特 gDNA 來(lái)源的相同逆轉(zhuǎn)錄病毒整合位點(diǎn)的監(jiān)測(cè)。由于在超聲處理中被研究群體的不同細(xì)胞之間存在完全相同的整合位點(diǎn)，以相對(duì)序列獨(dú)立的方式切割 gDNA，可以識(shí)別具有相同整合位點(diǎn)的多個(gè)序列讀數(shù)上的獨(dú)特接頭連接點(diǎn)［16］。

1.4 基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

NGS 檢測(cè)慢病毒整合的方法受短讀長(zhǎng)和PCR偏差的限制，導(dǎo)致產(chǎn)量低［17］。Van Haasteren等［18］發(fā)現(xiàn)了一個(gè)使用免擴(kuò)增技術(shù)對(duì)IS進(jìn)行測(cè)序的新整合位點(diǎn)測(cè)序（amplification-free integration site sequencing，AFIS-Seq）方法。AFIS-Seq 是基于無(wú)擴(kuò)增、Cas9 介導(dǎo)的高分子量染色體 DNA 富集，適用于Nanopore MinION測(cè)序。這種易于使用且低成本的方法可生成長(zhǎng)讀長(zhǎng)，從而在短時(shí)間內(nèi)能夠確定IS。有研究通過(guò)在多種細(xì)胞模型中繪制慢病毒載體的IS 來(lái)進(jìn)行概念驗(yàn)證，報(bào)告信號(hào)富集高達(dá) 1 600 倍。該方法還可以進(jìn)一步擴(kuò)展到 Cas9 介導(dǎo)的基因整合測(cè)序和 IS體內(nèi)分析。AFIS測(cè)序使用長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序可以提供更有信心的IS 分析，促使臨床前慢病毒載體基因療法的安全性通過(guò)評(píng)估［18］。

為了確定宿主基因組中的病毒整合位點(diǎn)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種基于PCR 的方法。然而，基于PCR的方法靈敏度高度依賴(lài)于引物序列，因此需要針對(duì)單個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)優(yōu)化。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Kiml 等［19］開(kāi)發(fā)了一種用于對(duì)病毒插入位點(diǎn)進(jìn)行全基因組定位的方法——增強(qiáng)型病毒整合位點(diǎn)測(cè)序（CRISPR-enhanced viral integration site sequencing，CReVIS-seq）。該方法基于以下連續(xù)步驟：基因組DNA 片段化，體外環(huán)化，以CRISPR指導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）特異性方式切割靶序列，以無(wú)差別線性化DNA 片段進(jìn)行高通量測(cè)序以及通過(guò)序列分析鑒定病毒插入位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)，CReVIS-seq 不受富集步驟中通過(guò)使用位點(diǎn)特異性引物的PCR 擴(kuò)增引入的偏差的影響。此外，研究發(fā)現(xiàn)使用不同的sgRNA 集合的多重CReVIS-seq，可以同時(shí)識(shí)別單細(xì)胞克隆和異源細(xì)胞群體中的多個(gè)靶位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)變異［19］。

2 生物信息分析技術(shù)的應(yīng)用

對(duì)基因治療數(shù)據(jù)中的病毒整合位點(diǎn)進(jìn)行分析和監(jiān)測(cè)，對(duì)于評(píng)估基因治療的安全性和有效性至關(guān)重要?；蛑委熤胁《据d體分布的整合位點(diǎn)分析和克隆性分析是監(jiān)測(cè)細(xì)胞動(dòng)態(tài)、評(píng)估惡性轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)和建立載體生物安全的關(guān)鍵因素。Afzal等［20］開(kāi)發(fā)了基因整合位點(diǎn)（genome integration site，GENE-IS，https：//github.com/G100DKFZ/gene-is）分析工具用于高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)基因治療數(shù)據(jù)中基于NGS的病毒載體整合位點(diǎn)。它是第一個(gè)具有雙重分析模式的工具，可以對(duì)基于 PCR 方法，如LAM-PCR 和靶向測(cè)序（如agilent sure select）技術(shù)生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行IS分析［3］。GENE-IS是一種可擴(kuò)展、強(qiáng)大、精確且可靠的工具，用于大規(guī)模臨床前和臨床數(shù)據(jù)分析，為用戶提供靈活性的分析，可配置更多的參數(shù)［20］。

Peters 等［21］開(kāi)發(fā)了基于網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)工具，可以促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄病毒整合位點(diǎn)（retroviral integration site，RIS）的識(shí)別，但不足以以高通量方法快速繪制和表征 RIS。根據(jù)細(xì)胞群內(nèi)插入位點(diǎn)的頻率以及運(yùn)行的樣本數(shù)量，單次測(cè)序生成的結(jié)果中單個(gè)RIS 的覆蓋范圍可能為 50～5 000 倍。SeqMap 2.0 提供了一種可擴(kuò)展的序列匹配、聚類(lèi)和比對(duì)的方法（網(wǎng)址為http：//seqmap.compbio.iupui.edu/）。

SeqMap 2.0 工作流程分為3 個(gè)階段：①序列處理，包括載體特征的識(shí)別和屏蔽以及將序列讀數(shù)分配到多重標(biāo)識(shí)符（multiple identifiers，MID）/條形碼特定組中；②序列聚類(lèi)和比對(duì)；③數(shù)據(jù)可視化和存儲(chǔ)以供進(jìn)一步分析［21］。

病毒載體的表征和分析是開(kāi)發(fā)安全基因治療產(chǎn)品、闡明載體潛在的遺傳毒性和免疫原性作用，并建立其安全性的重要組成部分。VSeq Toolkit（https：//github.com/CompMeth/VSeq-Toolkit）是利用Perl 和Bash 編程語(yǔ)言開(kāi)發(fā)的［22］，為病毒基因治療數(shù)據(jù)提供了不同的分析模式：第1 種模式確定不期望的已知污染物及其在病毒制劑或其他測(cè)序數(shù)據(jù)中的頻率；第2 種模式用于分析載體內(nèi)融合位點(diǎn)；第3 種模式用于揭示病毒-宿主融合事件分布。工具包的分析模式可以獨(dú)立執(zhí)行，也可以一起執(zhí)行，并允許同時(shí)分析多種病毒載體。它被設(shè)計(jì)和評(píng)估用于分析短讀高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，包括全基因組或靶向測(cè)序。

整合病毒載體成為宿主基因組的一部分，使其成為臨床基因治療的關(guān)鍵因素。然而，病毒整合有相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，例如致癌基因的無(wú)意激活可能導(dǎo)致癌癥。因此，分析逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的整合位點(diǎn)是開(kāi)發(fā)更安全的治療載體的關(guān)鍵步驟［23］。VIS Mapper 是一個(gè)載體整合分析網(wǎng)站［24］（http：//vismapper.babelomics.org），用于分析逆轉(zhuǎn)錄病毒載體整合的NGS測(cè)序數(shù)據(jù)。VIS Mapper使用了新的映射算法，比以前的可用程序明顯更快，并且提供了一個(gè)有用的圖形界面來(lái)分析在基因組背景下發(fā)現(xiàn)的整合位點(diǎn)［24］。

感染的病毒整合到人類(lèi)基因組中，是各種人類(lèi)惡性腫瘤的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。Virus Clip（https：//github.com/dwhho/Virus-Clip）是一種檢測(cè)病毒片段的病毒整合位點(diǎn)工具。該工具利用從片段測(cè)序讀取中提取的信息來(lái)識(shí)別整合事件中人類(lèi)和病毒斷點(diǎn)的確切位置。通過(guò)與病毒參考基因組的初始讀取比對(duì)及簡(jiǎn)化程序，Virus Clip 為病毒整合位點(diǎn)檢測(cè)提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、快速和內(nèi)存高效的解決方案［25］。此外，它還可以自動(dòng)注釋與相應(yīng)的受影響人類(lèi)基因的整合事件。通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)驗(yàn)證病毒片段，并驗(yàn)證其具有非常良好的靈敏度和特異性。與現(xiàn)有的工具相比，檢測(cè)性能顯著提高。此外，它還具有廣泛的功能，包括全基因組測(cè)序、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和靶向測(cè)序［25］。

分析細(xì)胞基因組中新整合的DNA 位點(diǎn)十分重要，但分析和可視化這些數(shù)據(jù)的方法目前仍處于開(kāi)發(fā)階段。Sherman 等［26］開(kāi)發(fā)了用于數(shù)據(jù)分析和可視化的工具［26］——雙端測(cè)序，其不僅可以推斷轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的數(shù)量以及目標(biāo)基因組中整合位點(diǎn)的分布，還可以將整合位點(diǎn)的分布與基因組特征進(jìn)行比較。此外，為了總結(jié)人類(lèi)基因治療樣本的整合位點(diǎn)數(shù)據(jù)，研究者開(kāi)發(fā)了一種可對(duì)樣本群體結(jié)構(gòu)、縱向動(dòng)態(tài)和癌癥相關(guān)基因附近的整合頻率進(jìn)行分類(lèi)的工具［27］，該工具可以對(duì)治療嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷-X1（severe combined immunodeficiency-X1，SCID-X1）患者進(jìn)行持續(xù)的縱向表征［26］。

3 降低基因重組風(fēng)險(xiǎn)的策略

CAR-T 細(xì)胞療法在治療B 細(xì)胞惡性腫瘤方面取得了重大進(jìn)展，但實(shí)體瘤治療方面仍具有重大挑戰(zhàn)［28］。CAR-T技術(shù)中病毒載體的應(yīng)用不僅受到監(jiān)管限制，同時(shí)其高昂的成本也阻礙了基因工程概念轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的可能。非病毒方法，例如轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas 系統(tǒng)，提供了CAR-T 細(xì)胞的另一種策略，該策略的出現(xiàn)，增加了CAR-T 細(xì)胞療法的可及性和效率［29］。但該策略仍然面臨許多挑戰(zhàn)，如敲除效率低、轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平低、整合率低等［30］。mRNA 技術(shù)在很大程度上能降低基因重組的風(fēng)險(xiǎn)，隨著該技術(shù)的發(fā)展，未來(lái)在基因重組領(lǐng)域，將會(huì)受到更廣泛的關(guān)注和應(yīng)用［31］。

3.1 非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的應(yīng)用

在CAR-T 細(xì)胞治療中，非病毒遞送平臺(tái)提供了一種有前景的替代方案，以解決病毒遞送技術(shù)方面的限制。病毒載體具有免疫原性高、有限的插入尺寸和生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)。相比之下，非病毒載體具有更低的細(xì)胞毒性和免疫原性［32］，同時(shí)可以更好地保護(hù)外源基因，并提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。非病毒基因遞送技術(shù)可以分為瞬時(shí)基因表達(dá)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因整合技術(shù)。非病毒穩(wěn)定的基因整合技術(shù)可以通過(guò)Piggy Bac 或CRISPR/Cas9 系統(tǒng)完成，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通常使用線性化DNA（雙鏈或單鏈）或環(huán)狀DNA［31，33］。

3.2 低整合型病毒的利用

慢病毒載體是一種高效遞送基因進(jìn)入靶向細(xì)胞的病毒載體。通過(guò)慢病毒載體，將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)整合到細(xì)胞基因組，使宿主細(xì)胞獲得新功能，修復(fù)自身缺陷并刺激某些細(xì)胞功能恢復(fù)。由于慢病毒載體的潛在風(fēng)險(xiǎn)，加快整合酶缺陷型病毒的開(kāi)發(fā)。整合酶缺陷型慢病毒載體系統(tǒng)（integrase deficient virus vector，IDLV）降低了轉(zhuǎn)基因整合到宿主基因組中的概率。整合酶缺陷病毒載體具有更高的安全特性，利用該特征整合酶缺陷型慢病毒載體更有利于治療的實(shí)施和臨床應(yīng)用的拓寬，特別是在基因治療、定點(diǎn)基因編輯、細(xì)胞治療重編程等領(lǐng)域。

盡管 IDLV 以某種方式消除了轉(zhuǎn)基因整合到細(xì)胞基因組中的現(xiàn)象，但其不良反應(yīng)仍然困擾著臨床應(yīng)用，例如轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、表達(dá)水平低等。經(jīng)過(guò)科學(xué)家的努力，IDLV 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低的問(wèn)題已在一定程度上得到解決，后續(xù)研究將繼續(xù)克服其他不良現(xiàn)象［34］。鑒于低整合型病毒其致癌整合風(fēng)險(xiǎn)低的特點(diǎn)，IDLV 是現(xiàn)有細(xì)胞產(chǎn)品轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中病毒載體的最理想替代品。

4 展望

基因載體整合到宿主的基因組中，表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因藥物，在宿主體內(nèi)實(shí)現(xiàn)治療效果。然而，慢病毒的RNA 基因組首先被逆轉(zhuǎn)錄為DNA，然后以看似隨機(jī)的方式整合到細(xì)胞基因組。為了避免慢病毒整合影響細(xì)胞功能，當(dāng)整合發(fā)生在癌基因附近或關(guān)鍵基因內(nèi)時(shí)，應(yīng)在慢病毒感染靶細(xì)胞后進(jìn)行慢病毒整合位點(diǎn)鑒定。所選擇的整合位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和宿主細(xì)胞的表型都具有重要的影響。整合位點(diǎn)分析是評(píng)估基因治療載體的生物安全性和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在體內(nèi)克隆追蹤命運(yùn)的關(guān)鍵工具。隨著近代生物測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展及基因重組技術(shù)的廣泛應(yīng)用，基因整合分析將為生物安全提供更多有價(jià)值的參考，為降低細(xì)胞及基因治療產(chǎn)品的用藥安全保駕護(hù)航，慢病毒載體將成為細(xì)胞穩(wěn)定遺傳修飾中重要的基因遞送載體。