常明珠,李亭昱,崔云鶴,劉騰達(dá),郭 笑,母潤紅

(1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林 132013;2.北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)主要生長于俄羅斯北部、中國東北及日本北海道等寒冷地區(qū),是白樺樹上生長的藥用真菌[1-2]。大量研究[3-4]表明,樺褐孔菌可治療和預(yù)防癌癥、心腦血管疾病和糖尿病等多種疾病,此外,樺褐孔菌還具有抗衰老、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用[1-5]。多糖(polysaccharides)是構(gòu)成細(xì)胞和生物體的重要物質(zhì),在生物體的生命活動中發(fā)揮著重要作用[6]。菌類多糖在抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎及增強(qiáng)免疫力等方面都具有明顯作用[7-9],因此,菌類多糖的研究受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。

本研究通過水提法、超聲法、微波法和酶法4種方法[8-11]對樺褐孔菌多糖進(jìn)行提取,并對其抗氧化活性進(jìn)行測定,其中包括總抗氧化能力及DPPH·、·OH和ABTS·還原能力的測定[12-13]。本研究可為樺褐孔菌多糖進(jìn)一步開發(fā)相應(yīng)的抗氧化食品、保健品、藥品等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樺褐孔菌(吉林省長白山地區(qū))經(jīng)北華大學(xué)韓東副教授鑒定為樺褐孔菌的亞實(shí)體。

1.2 主要試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、纖維素酶、2,2-二疊氮化物-雙(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、抗壞血酸(VC)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ:)(北京定國長盛生物科技有限公司);無水乙醇、乙酸、無水乙酸鈉、氯化鐵、過氧化氫、硫酸亞鐵、氯化鈉、水楊酸、過硫酸鉀等均為分析純(遼寧泉瑞試劑有限公司)。

1.3 儀器與設(shè)備

微型高速粉碎機(jī)(上海博潤實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠);ATY224型電子天平(日本SHIM ADZU);RE-52A系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);UV-2550型紫外分光光度計(SHIMADZU公司,日本);infiniteM200型酶標(biāo)儀(TECAN公司,瑞士)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)液制備:稱取100 mg葡萄糖定容100 mL,分別取溶液1、2、3、4、6、8 mL至100 mL的容量瓶中,制成10、20、30、40、60、80 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

苯酚溶液制備:稱取5 g苯酚,溶解于95 mL蒸餾水中。

反應(yīng)液制備:分別取1 mL的標(biāo)準(zhǔn)液,加入1 mL的苯酚溶液,迅速加入5 mL的濃硫酸,震蕩搖勻。在沸水浴中加熱15 min后冷卻至室溫,在490 nm波長下測定其吸光值。

梯度濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),通過苯酚濃硫酸法制得的反應(yīng)液在490 nm波長處所測得的吸光度為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。

1.4.2 不同方法提取樺褐孔菌多糖

取適量樺褐孔菌干燥至恒重,粉碎過60目篩,分別用水提法、超聲法、微波法和酶法對樺褐孔菌多糖進(jìn)行提取,比較其提取率。

水提法:料液比m(g)∶V(mL)=1∶20(樺褐孔菌粉末5 g),80 ℃回流提取90 min,收集上清液,重復(fù)2次,上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至50 mL。加無水乙醇至乙醇濃度為80%,靜置24 h,沉淀即為樺褐孔菌粗多糖。將乙醇蒸發(fā)后,用50 mL蒸餾水溶解,測定樺褐孔菌多糖的濃度。樺褐孔菌多糖的提取率=(x×稀釋倍數(shù)×50)/m×%,式中:x是根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的樺褐孔菌試驗(yàn)樣品的濃度,m為樺褐孔菌粉末質(zhì)量。

超聲法:料液比m(g)∶V(mL)=1∶20、超聲功率為400 W、提取溫度為80 ℃、提取時間為90 min,后續(xù)操作與水提法相同[9]。

微波法:料液比m(g)∶V(mL)=1∶20、微波功率為400 W、提取溫度為80 ℃、提取時間為20 min,后續(xù)操作與水提法相同[10]。

酶法:料液比m(g)∶V(mL)=1∶20 、提取溫度為80 ℃、提取為90 min,3 500 U/g的纖維素酶在50 ℃水浴中振蕩處理30 min,后續(xù)操作與水提法相同[11]。

1.4.3 抗氧化活性試驗(yàn)

選取4種方法中提取率最高的超聲法提取的樺褐孔菌多糖用于抗氧化能力的測定。

1)總抗氧化能力的測定:以10∶1∶1的比例將醋酸-醋酸鈉緩沖液(300 mmol/L,pH 3.6)、TPTZ溶液(10 mmol/L)與FeCl3溶液(20 mmol/L)混勻,配成FRAP工作液。取20 μL系列濃度的FeSO4溶液于96孔酶標(biāo)板中,再加入150 μL FRAP工作液,混勻后37 ℃孵育10 min,測定其在593 nm處吸光度值。以吸光度值(OD)為橫坐標(biāo),FeSO4溶液的濃度(FRAP值)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12-15]。分別取VC和樺褐孔菌多糖提取液20 μL于96孔酶標(biāo)板,與上述操作步驟相同。在593 nm條件下,樣品測得吸光度值為Ai,蒸餾水做空白吸光度值為A0,VC為Amax。相對總還原百分率=(Ai-A0)/(Amax-A0)×100%。

2)DPPH·清除率的測定:用95%乙醇配制DPPH溶液(0.2 mmol/L),備用,配制梯度濃度的VC溶液和樺褐孔菌多糖溶液適量。取100 μL樣品溶液于96孔酶標(biāo)板中,再分別加入100 μL DPPH溶液,混勻后避光室溫反應(yīng)30 min,測定其在517 nm處吸光度值。同時用水做空白,以溶液濃度為橫坐標(biāo),DPPH·清除率為縱坐標(biāo),繪制清除率曲線[13-14]。清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0× 100%,式中,Ai:樣品溶液+DPPH溶液的吸光度值;Aj:樣品溶液+95%乙醇的吸光度值;A0:水+DPPH溶液的吸光度值。

3)·OH清除率的測定:用無水乙醇配制9 mmol/L水楊酸溶液,用蒸餾水配制9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L H2O2溶液備用,配制梯度濃度VC溶液和不同濃度樺褐孔菌多糖溶液適量。分別吸取50 μL VC溶液于96孔酶標(biāo)板中,再分別加入50 μL FeSO4溶液、50 μL水楊酸溶液迅速混勻,37 ℃避光反應(yīng)10 min后,加入50 μL 9 mmol/LH2O2溶液迅速混勻,37 ℃避光反應(yīng)30 min,于510 nm讀取吸光度值。用蒸餾水做空白,以溶液濃度為橫坐標(biāo),·OH清除率為縱坐標(biāo),繪制清除率曲線[15]。清除率=[A-(Ai-Aj)]/A0× 100%,式中,Ai:樣品溶液+FeSO4溶液+水楊酸溶液+H2O2溶液的吸光度值;Aj:樣品溶液+FeSO4溶液+水楊酸溶液+H2O的吸光度值;A0:H2O+FeSO4溶液+水楊酸溶液+H2O2溶液的吸光度值。

4)ABTS·清除率的測定:將100 mL ABTS(7 mmol/L)和1.782 mL過硫酸鉀(140 mmol/L)混勻,室溫避光過夜,制備成ABTS工作溶液。測量前用PBS緩沖液(pH 6.8)稀釋至A734=0.700±0.020。取40 μL系列濃度的VC溶液和多糖樣品溶液,然后分別加入160 μL的ABTS工作液,25 ℃下靜置4 min,測定其在734 nm處的吸光度。通過向無樣品的反應(yīng)液中加入蒸餾水作為空白,以溶液濃度為橫坐標(biāo),清除率為縱坐標(biāo),繪制清除曲線[16]。清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0× 100%,式中,Ai:VC溶液+ABTS·工作液的吸光度值;Aj:樣品溶液+蒸餾水的吸光度值;A0:水/無水乙醇+ABTS·工作溶液的吸光度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

本研究結(jié)果顯示,以梯度濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),通過苯酚濃硫酸法制得的反應(yīng)液在490 nm波長處所測得的吸光度為縱坐標(biāo),所測得的線性回歸方程為y=0.015 60x-0.002 33,R2=0.999 94。見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 不同方法對樺褐孔菌多糖提取率影響

本研究結(jié)果顯示,4種方法按上述條件分別提取3 次,取平均值。不同提取方法所得樺褐孔菌多糖提取率見表1。由表1可見,超聲法、微波法、酶法較水提取法均顯著提高了樺褐孔菌多糖的提取率。其中超聲法效果最好,多糖提取率較水提法提高30.85%。因超聲法可加速樺褐孔菌細(xì)胞壁的破裂,增加其多糖的溶解速率和溶解量,從而提高了提取率[16]。微波法可使樺褐孔菌內(nèi)部的水分加速運(yùn)動而產(chǎn)生大量熱量,同時水分汽化產(chǎn)生壓力導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂,這有利于多糖組分的快速溶解并節(jié)省時間,但高溫會引起多糖的降解或變性[17]。通常,植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和果膠等[18-19],但微波時,蛋白等雜質(zhì)也會被大量釋放,這反而會降低樺褐孔菌多糖的溶解度[17]。與水提取和酶法相比,超聲法操作簡單,節(jié)約成本;與微波法相比,超聲法可控性強(qiáng),安全性高。因此,超聲法更適合樺褐孔菌多糖的提取。

表1 各種提取方法對樺褐孔菌多糖提取率的影響Tab.1 Effect of extract methods on the yields of polysaccharide from Inonotus obliquus

2.3 抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 總抗氧化能力測定結(jié)果

以吸光度值(OD)為橫坐標(biāo),FeSO4溶液的濃度(FRAP值)為縱坐標(biāo),建立線性回歸方程為y=834.279 62x+2.102 59,R2=0.999 94。VC的總抗氧化能力的線性回歸方程結(jié)果為y=0.011 72x-0.000 49,R2=0.999 91。經(jīng)計算,400 μg/mL時,VC的吸光度(OD)為4.69,樺褐孔菌多糖的OD值為0.29,兩者FRAP值分別為3 914.87、244.04 μmol/L,即樺褐孔菌多糖還原能力相當(dāng)于VC的0.16倍。見圖2、3。

圖2 FeSO4的總抗氧化能力Fig.2 Total antioxidant capacity of FeSO4

圖3 VC的總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidant capacity of VC

2.3.2 DPPH·清除率的測定結(jié)果

本研究結(jié)果顯示,VC和樺褐孔菌多糖對DPPH·的清除能力均隨著樣品質(zhì)量濃度增大而增大,其藥物安全性指標(biāo)EC50分別為17.12、290.32 μg/mL。EC50越小,其抗氧化能力越強(qiáng)。說明樺褐孔菌粗多糖對DPPH·清除能力較弱,由此提示我們可通過進(jìn)一步分離純化樺褐孔菌多糖篩選其強(qiáng)抗氧化組分。見圖4。

圖4 VC和樺褐孔菌多糖對DPPH·的清除作用Fig.4 Clearance effect of VC and polysaccharides from Inonotus obliquus on DPPH· free radicals

2.3.3 ·OH清除率的測定結(jié)果

本研究結(jié)果顯示,VC和樺褐孔菌多糖隨著其質(zhì)量濃度的增大其對DPPH·的清除能力也增強(qiáng),其EC50分別為11.49、65.67 μg/mL。樺褐孔菌多糖對DPPH·清除能力弱于VC,但在一定濃度下,兩者對DPPH·的清除能力均能達(dá)到80%以上,說明樺褐孔菌多糖對·OH具有較好的清除能力。見圖5。

圖5 VC和樺褐孔菌多糖對·OH的清除作用Fig.5 Clearance effect of VC and polysaccharides from Inonotus obliquus on ·OH free radicals

2.3.4 ABTS·清除率的測定

本研究結(jié)果顯示,VC和樺褐孔菌多糖隨著其質(zhì)量濃度的增大其對 ABTS·的清除能力也增強(qiáng),其EC50分別為149.41、512.22 μg/mL。在一定濃度下,兩者對ABTS·的清除能力均能達(dá)到80%以上。見圖6。

圖6 VC和樺褐孔菌多糖中黃酮類化合物對ABTS的清除作用Fig.6 Clearance effect of VC and flavonoids from Inonotus obliquus on ABTS free radicals

3 結(jié) 論

本研究通過水提法、超聲法、微波法和酶法分別對樺褐孔菌多糖進(jìn)行了3次提取,提取結(jié)果顯示,超聲法、微波法和酶法對樺褐孔菌多糖的提取率顯著優(yōu)于水提法,其中超聲法在料液比m(g)∶V(mL)=1∶20、超聲功率為400 W、提取溫度為80 ℃和提取時間為90 min時,多糖提取率最高,為10.35%。選取4種方法中提取率最高的超聲法對樺褐孔菌多糖進(jìn)行提取,用于后續(xù)抗氧化能力的測定。以VC為對照,樺褐孔菌多糖的抗氧化能力測定發(fā)現(xiàn)其總抗氧化能力微強(qiáng)于VC,大約為VC的0.16倍;樺褐孔菌多糖對DPPH·的清除率對應(yīng)的EC50為290.32 μg/mL,顯著低于VC,顯示其在對DPPH·的清除率方面能力較弱;樺褐孔菌多糖清除·OH和ABTS·的藥物安全性指標(biāo)(EC50)分別為65.67、512.22 μg/mL,雖低于VC,但在一定濃度下,兩者對·OH和ABTS·的清除率均可達(dá)到80%以上。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果可以得出,超聲法是4種方法中提取樺褐孔菌多糖的最佳工藝,且樺褐孔菌多糖具有較好的抗氧化活性,但關(guān)于其強(qiáng)抗氧化組分和強(qiáng)抗氧化機(jī)制方面還有待于進(jìn)一步的研究與補(bǔ)充。在后續(xù)的研究中可采用多種方法輔助或改良、完善提取率最高的超聲法,進(jìn)一步提高提取率,也可通過對樺褐孔菌粗多糖進(jìn)行純化,促進(jìn)樺褐孔菌多糖抗氧化作用的發(fā)揮。本研究結(jié)果可為樺褐孔菌多糖的深入研發(fā)提供參考。