逄格雨，徐碩，張子豪，張雨晴，于少軒

(山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)是非酶糖基化反應(yīng)(Maillard反應(yīng))的終末產(chǎn)物,是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子在沒(méi)有酶參與的條件下,與葡萄糖或其他還原性單糖反應(yīng)所生成的穩(wěn)定的共價(jià)加成物[1]。研究表明[2-3],AGEs與糖尿病及其并發(fā)癥、心血管疾病、阿爾茨海默癥、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病以及人體衰老密切相關(guān),目前,AGEs已成為影響人類健康的一個(gè)慢性風(fēng)險(xiǎn)因素[4]。人體內(nèi)AGEs的來(lái)源包括內(nèi)源性和外源性兩種途徑,前者主要是指體內(nèi)過(guò)量的糖和蛋白質(zhì)反應(yīng)生成的AGEs;后者是通過(guò)進(jìn)食、吸煙等方式將食物或香煙中的AGEs吸收進(jìn)入體內(nèi)。與內(nèi)源性AGEs相比,外源性AGEs在人體AGEs蓄積池中的占比要高得多[5]。因此,控制食品中AGEs的生成進(jìn)而減少AGEs的膳食攝入對(duì)改善國(guó)民的健康狀況,提高人們的生活質(zhì)量,緩解醫(yī)療支出費(fèi)用負(fù)擔(dān)具有重要的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)意義。在保證食品色、香、味的前提下,通過(guò)添加外源物質(zhì)來(lái)抑制食品中AGEs生成是目前食品領(lǐng)域備受關(guān)注的研究?jī)?nèi)容之一。多種外源物質(zhì)如維生素、黃酮、多酚、萜類和不飽和脂肪酸等已經(jīng)被證明在食品加工過(guò)程中對(duì)抑制AGEs的生成具有巨大的潛力[6-7]。

昆侖雪菊,學(xué)名兩色金雞菊、蛇目菊,為菊科金雞菊屬(Coreopsis)多年生草本植物,在我國(guó)新疆和田地區(qū)、云南部分地區(qū)有一定栽培規(guī)模。昆侖雪菊是藥食兩用性植物,含有多種藥理成分,其作為許多保健品的原料,近年來(lái)已成為營(yíng)養(yǎng)學(xué)家、藥理學(xué)家以及養(yǎng)生專家研究的熱點(diǎn)。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)昆侖雪菊的研究主要集中在黃酮、生物堿、揮發(fā)性油、有機(jī)酸、氨基酸等成分的分離鑒定和活性評(píng)價(jià)等方面[8]。雖然從當(dāng)前研究可以看出昆侖雪菊中的黃酮類活性成分對(duì)糖基化反應(yīng)和氧化反應(yīng)具有一定的抑制作用[9],但是關(guān)于探究昆侖雪菊醇提物抑制食品加工過(guò)程中AGEs的生成鮮有報(bào)道。因此,本研究分別在40、60、80 ℃ 3個(gè)溫度條件下對(duì)昆侖雪菊超微粉進(jìn)行醇提,得到3種醇提物(E1、E2和E3)。通過(guò)測(cè)定三者的總黃酮含量,選取E1為本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象,然后建立乳糖-酪蛋白和葡萄糖-賴氨酸-亞油酸兩種食品模擬體系,探究不同濃度的昆侖雪菊醇提物E1對(duì)模擬體系中AGEs生成的影響,以期為開(kāi)發(fā)價(jià)格低廉、方便易得的食品級(jí)AGEs抑制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆侖雪菊(干花,生產(chǎn)許可證號(hào):QS650114020007),新疆雪菊生物科技有限公司;賴氨酸(純度為98%),上海麥克林生物有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司;3,5-二硝基水楊酸,上海研生生物技術(shù)有限公司;2,4-二硝基苯肼,上海諾泰化工有限公司;葡萄糖、α-乳糖、酪蛋白、亞油酸、茚三酮、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等,均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XL-30C實(shí)驗(yàn)室超微粉碎機(jī),廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司;UV-1750型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),島津國(guó)際貿(mào)易有限公司;RG-18型磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;熒光分光光度計(jì),島津國(guó)際貿(mào)易有限公司;電熱鼓風(fēng)烘箱DHG-9070A,上海浦東物理光學(xué)儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海況勝實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;循環(huán)水式真空泵,上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 昆侖雪菊醇提物的制備

將洗凈的昆侖雪菊在40 ℃下烘干至恒重,用小型超微粉碎機(jī)粉碎后過(guò)200目篩,取10 g過(guò)篩的昆侖雪菊粉末,用75%乙醇進(jìn)行索式提取,溶液分別在40 、60、80 ℃水浴上回流提取,固液比為1∶60,回流30 min。將醇提物在40 ℃、96 kPa條件下旋蒸濃縮后轉(zhuǎn)移到直徑為100 mm的玻璃平皿中,在40 ℃烘箱中干燥至恒重,得到昆侖雪菊醇提物E1、E2、E3,4 ℃冰箱密封避光保存?zhèn)溆谩y(cè)定總黃酮含量時(shí)用75%乙醇溶液溶解并稀釋至一定體積。

1.4 昆侖雪菊醇提物中總黃酮含量的測(cè)定

黃酮類化合物在適當(dāng)?shù)膲A性條件下,與金屬鋁離子能形成穩(wěn)定的黃色絡(luò)合物,在可見(jiàn)光區(qū)域有較大的紫外吸收,該研究采用NaNO2-Al (NO3)3-NaOH比色法測(cè)定雪菊醇提物中的總黃酮含量。參考杜鵑等[10]的方法并適當(dāng)加以改動(dòng)。分別吸取0.3 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 mL于25 mL比色管中,用75%的乙醇將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至5 mL。加入50 mg/mL的亞硝酸鈉溶液2 mL,搖勻,放置6 min,再加入100 mg/mL的硝酸鋁溶液2 mL,搖勻,放置 6 min,最后加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液15 mL,用乙醇定容至刻度,搖勻,放置15 min,于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值并繪制出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取10 mg昆侖雪菊醇提物,溶解后按照以上方法測(cè)定OD值,按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中的總黃酮含量。平行測(cè)定3次取平均值,且根據(jù)測(cè)定結(jié)果選取總黃酮含量最高的醇提物E進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 乳糖-酪蛋白反應(yīng)體系的構(gòu)建

參考葛輝[11]的方法并適當(dāng)加以改動(dòng)。以pH 6.7,0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制24 mg/mL的酪蛋白溶液和50 mg/mL的乳糖溶液。以0.125、0.25、0.5 mg/mL不同質(zhì)量濃度梯度的昆侖雪菊醇提物E1設(shè)置實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照和空白組不添加昆侖雪菊醇提物。其他試劑的添加如表1所示。將混合溶液充分混勻后置于不同溫度(100 ℃和140 ℃)條件下加熱不同時(shí)間(4 h和1 h)。

表1 乳糖-酪蛋白反應(yīng)體系的構(gòu)建

1.6 葡萄糖-賴氨酸-亞油酸反應(yīng)體系的構(gòu)建

參照岳璐[12]的方法并適當(dāng)加以改動(dòng)。精確稱取2 g賴氨酸(20 mg/mL)和2 g葡萄糖用pH 6.7,0.2 mol/L PBS溶解并定容至100 mL,加入0.8 mL吐溫-80,用磁力攪拌器持續(xù)攪拌30 min后,加入0.8 mL亞油酸并繼續(xù)攪拌至溶液澄清,得到葡萄糖-賴氨酸-亞油酸體系。其他試劑的添加如表2所示。將混合溶液充分混勻后置于100 ℃反應(yīng)條件下加熱2 h。

表2 葡萄糖-賴氨酸-亞油酸反應(yīng)體系的構(gòu)建

1.7 不同反應(yīng)體系中熒光性AGEs的測(cè)定

該研究反應(yīng)體系中的熒光性AGEs用熒光分光光度計(jì)測(cè)定[13-14], 精確吸取各反應(yīng)體系樣液1 mL于離心管中,用去離子水稀釋5倍,設(shè)定的激發(fā)波長(zhǎng)λex=345 nm、發(fā)射波長(zhǎng)λem=420 nm,生成的熒光性AGEs強(qiáng)度用AU表示。昆侖雪菊醇提物對(duì)熒光性AGEs形成的抑制率[15]I1為

I1=(F2-F1)/(F2-F3)×100%,

(1)

式中:F2為對(duì)照組的熒光強(qiáng)度,F1為雪菊醇提物實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度,F3為空白組的熒光強(qiáng)度。

1.8 不同反應(yīng)體系中賴氨酸/賴氨酸殘基的測(cè)定

參考全紅麗[16]的方法并適當(dāng)加以改動(dòng)。對(duì)各反應(yīng)體系透析蛋白處理后,根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明,配制工作液并于波長(zhǎng)562 nm處測(cè)定OD值,得到蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取2 mL各反應(yīng)體系樣液于離心管中對(duì)蛋白質(zhì)定量后加入2 mL茚三酮試劑,充分混勻,80 ℃下水浴30 min,然后冷卻至室溫后用PBS定容至10 mL,搖勻,在562 nm處測(cè)定其OD值。以空白組中的賴氨酸/賴氨酸殘基含量為1,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的賴氨酸/賴氨酸殘基相對(duì)含量C為

C=A/A°×100%,

(2)

式中:A表示對(duì)照組或不同濃度雪菊醇提物實(shí)驗(yàn)組的吸光度,A°表示空白組的吸光度。

1.9 反應(yīng)體系中酪蛋白羰基化程度的測(cè)定

參考段麗菊等[17]的方法并適當(dāng)加以改動(dòng)。選取乳糖-酪蛋白體系140 ℃反應(yīng)1 h的各反應(yīng)體系,對(duì)蛋白質(zhì)定量后,取100 μL樣液與400 μL、10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH)溶液充分混合后在室溫下暗處孵育1 h,每隔10 min漩渦1次。反應(yīng)完畢后,向混合溶液中加入500 μL、0.2 g/mL的三氯乙酸(TCA),在4 ℃下,以12 000g的轉(zhuǎn)速離心15 min,棄上清。得到的沉淀用1 mL乙醇和乙酸乙酯混合物洗滌3次,后用1.25 mL、6 mol/L的鹽酸胍在37 ℃條件下水浴15 min,使其溶解并以12 000g的轉(zhuǎn)速離心15 min,取上清,在波長(zhǎng)370 nm處測(cè)定其OD值。乳糖-酪蛋白反應(yīng)體系中酪蛋白羰基化程度抑制率I2為

I2=(A2-A1)/(A2-A3)×100%,

(3)

式中:A2表示370 nm處對(duì)照組的吸光度,A1表示370 nm處雪菊醇提物實(shí)驗(yàn)組的吸光度,A3表示370 nm處空白組的吸光度。

1.10 反應(yīng)體系中葡萄糖余量的測(cè)定

參考趙凱等[18]的方法并適當(dāng)加以改動(dòng)。將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液由1 mg/mL稀釋為0.5 g/L,吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液5次,分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,并逐一補(bǔ)水至1 mL,加入3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)試劑1.5 mL,搖勻,在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定OD值,并繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。取各反應(yīng)體系樣液1 mL,加入DNS試劑1.5 mL,其他操作與上述方法相同,并通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出葡萄糖-賴氨酸-亞油酸各反應(yīng)體系中的葡萄糖余量。

1.11 數(shù)據(jù)處理

本論文中所有試驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)均用Origin作圖,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。使用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異顯著性分析采用方差分析,當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆侖雪菊醇提物中總黃酮含量

以吸光度y為縱坐標(biāo)、濃度x為橫坐標(biāo)繪制出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),通過(guò)線性擬合得到R2為0.999 7的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=27.67x+0.017 6。據(jù)此計(jì)算出不同溫度條件下得到的昆侖雪菊醇提物E1、E2和E3中總黃酮含量(以蘆丁當(dāng)量表示)分別為0.438、0.416、0.384 mg/mL。由圖2可以看出,E1中總黃酮含量最高,因此本研究選取了醇提物E1作為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。徐瑩等[19]報(bào)道過(guò)類似的結(jié)果,其發(fā)現(xiàn)提取溫度超過(guò)55 ℃時(shí),黃酮類化學(xué)物的結(jié)構(gòu)遭到破壞,導(dǎo)致提取量降低。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

注:a～c不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖2 昆侖雪菊醇提物中總黃酮含量

2.2 昆侖雪菊醇提物E1對(duì)酪蛋白-乳糖體系中AGEs生成的影響

2.2.1 不同熱處理?xiàng)l件下E1對(duì)酪蛋白-乳糖體系中熒光性AGEs生成的抑制作用

目前已被發(fā)現(xiàn)的AGEs有近40種,根據(jù)其是否具有特征性熒光,可以分為熒光性AGEs和非熒光性AGEs兩大類[20]。其中,熒光性AGEs因具有檢測(cè)方便、靈敏度高等特點(diǎn)而被大量研究作為目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)分析,間接反映體系中AGEs的總量。由圖3(a)可以看出,與酪蛋白相比,酪蛋白-乳糖體系在100 ℃加熱4 h后,其熒光光譜在420 nm處有一個(gè)顯著的熒光發(fā)射峰。但是,添加了不同濃度的昆侖雪菊醇提物E1后,該熒光發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度逐漸降低。由圖3(b)可知,0.125、0.25、0.5 mg/mL醇提物E1對(duì)熒光性AGEs的抑制率分別為9.89%、21.44%、55.73%。因此,昆侖雪菊醇提物E1能夠抑制酪蛋白-乳糖體系中熒光性AGEs的生成,且具有明顯的濃度依賴性,這與夏秋琴[21]的研究結(jié)果有相同趨勢(shì),其發(fā)現(xiàn)在溫度為100 ℃的酪蛋白-乳糖反應(yīng)體系中,隨著染料木黃酮添加量的增加,抑制熒光性AGEs產(chǎn)生的量逐漸增強(qiáng)。由圖3(c)和圖3(d)可知,在此前的基礎(chǔ)上提高溫度并縮短反應(yīng)時(shí)間,昆侖雪菊醇提物E1在140 ℃加熱1 h的條件下也能夠抑制熒光性AGEs的生成,此時(shí),0.125、0.25、0.5 mg/mL醇提物E1對(duì)熒光性AGEs的抑制率分別為14.30%、55.51%、70.44%,表明昆侖雪菊醇提物E1在該加熱條件下對(duì)熒光性AGEs的抑制效果更強(qiáng)一些。

(a)100 ℃加熱4 h的熒光光譜

2.2.2 E1對(duì)賴氨酸/賴氨酸殘基的保護(hù)能力

賴氨酸是發(fā)生糖基化反應(yīng)形成復(fù)雜的AGEs的主要氨基酸,游離賴氨酸含量能夠反映反應(yīng)體系的糖基化程度,賴氨酸含量越高,認(rèn)為糖基化程度越低[22]。對(duì)照組因發(fā)生非酶糖基化反應(yīng),其所含賴氨酸相對(duì)含量為0.583%,隨著反應(yīng)體系中E1濃度從0.125 mg/mL上升到0.5 mg/mL,賴氨酸的相對(duì)含量由0.608%增加到0.927%(圖4),說(shuō)明隨反應(yīng)體系中醇提物E1濃度的逐漸升高,非酶糖基化反應(yīng)進(jìn)行的程度逐漸降低,E1對(duì)乳糖-酪蛋白反應(yīng)體系中AGEs生成的抑制作用逐漸增強(qiáng)。張宇臣等[23]有過(guò)類似發(fā)現(xiàn),即不同濃度的褐藻多酚可以有效提高牛血清蛋白與葡萄糖體外模擬體系中賴氨酸與葡萄糖的含量。

注:a～d不同字母表示具有顯著性差異(P <0.05)。圖4 E1對(duì)酪蛋白-乳糖體系中賴氨酸/賴氨酸殘基保護(hù)能力對(duì)比圖

2.2.3 E1對(duì)酪蛋白羰基化程度抑制率

蛋白質(zhì)羰基化是在氧化損傷過(guò)程中表現(xiàn)出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能不可逆的損傷[24],通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中酪蛋白羰基化程度可以判斷美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度。如圖5所示,添加3種不同濃度雪菊醇提物E1的反應(yīng)體系中,酪蛋白羰基化程度抑制率從36.40%迅速上升到64.37%,且三者之間存在明顯的顯著性差異(P<0.05),表明昆侖雪菊醇提物E1能夠抑制乳糖-酪蛋白體系中酪蛋白羰基化程度,具有明顯的濃度依賴性。

注:a～c不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖5 E1對(duì)酪蛋白羰基化程度抑制率對(duì)比圖

2.3 昆侖雪菊醇提物E1對(duì)葡萄糖-賴氨酸-亞油酸體系中AGEs生成的影響

2.3.1 不同熱處理?xiàng)l件下E1對(duì)葡萄糖-賴氨酸-亞油酸體系中熒光性AGEs生成的抑制作用

由圖6(a)可知,與酪蛋白-乳糖反應(yīng)體系相似,100 ℃反應(yīng)4 h后,該體系熒光光譜在420 nm處同樣有一個(gè)非常明顯的熒光發(fā)射峰。與對(duì)照組相比,添加醇提物E1的各反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度隨著E1濃度的升高而逐漸降低。由圖6(b)可知,添加濃度為0.5 mg/mL醇提物E1的實(shí)驗(yàn)組,抑制效果最為明顯,抑制率達(dá)到58.25%。夏秋琴[21]得到過(guò)類似結(jié)果,其發(fā)現(xiàn)在賴氨酸-核糖體系中,隨著抑制劑染料木黃酮濃度的不斷增加,其對(duì)熒光性AGEs的抑制效果逐漸增強(qiáng)。

(a)熒光光譜

2.3.2 E1對(duì)賴氨酸/賴氨酸殘基的保護(hù)能力

為進(jìn)一步研究昆侖雪菊醇提物E1對(duì)AGEs生成的抑制作用,本研究測(cè)定了不同反應(yīng)體系中賴氨酸的含量變化并進(jìn)行比較分析。2.2.2中提到,賴氨酸為非酶糖基化反應(yīng)的底物,對(duì)照組賴氨酸相對(duì)含量為0.586%,處于比較低的水平,添加0.125、0.25、0.5 mg/mL醇提物E1的反應(yīng)體系中,賴氨酸的相對(duì)含量分別升高至0.691%,0.754%、0.892%(圖7),均高于對(duì)照組,且四者之間具有顯著性差異,表明E1對(duì)賴氨酸的保護(hù)效果較好。

2.3.3 E1對(duì)葡萄糖余量的影響

通過(guò)線性擬合得到R2為0.999的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.667x-0.066 2,據(jù)此計(jì)算出空白組的葡萄糖余量為4.81 mg/mL,反應(yīng)體系中添加0.125、0.25、0.5 mg/mL E1時(shí),體系中葡萄糖余量分別為4.51、4.03、3.55 mg/mL。葡萄糖余量最高的是添加E1的反應(yīng)組,與2.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證,說(shuō)明葡萄糖余量最高的實(shí)驗(yàn)組中添加的雪菊醇提物E中總黃酮含量最高。

3 結(jié)論

1)昆侖雪菊醇提物對(duì)AGEs的生成具有顯著的抑制作用。熱處理溫度分別為100 ℃和140 ℃時(shí),0.5 mg/mL雪菊醇提物E1對(duì)乳糖-酪蛋白和葡萄糖-賴氨酸-亞油酸反應(yīng)體系中AGEs的抑制率分別可達(dá)70.44%和58.25%。

2)兩反應(yīng)體系中的賴氨酸/賴氨酸殘基相對(duì)含量、酪蛋白羰基化抑制率以及葡萄糖余量均有很大程度提高。昆侖雪菊醇提物可能與賴氨酸殘基反應(yīng)抑制蛋白質(zhì)的糖基化,從而降低AGEs的生成。

3)本研究探討了昆侖雪菊醇提物在抗氧化、抗糖基化方面的食用價(jià)值,并將其應(yīng)用到抑制AGEs生成的研究中,為AGEs抑制劑的研究提供了一定的數(shù)據(jù)參考。