萬(wàn)瑞融 王希斌

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,廣西南寧市 530021

免疫療法是惡性腫瘤繼手術(shù)、放療和化療之外的第四種治療新方法,其中把T淋巴細(xì)胞作為腫瘤殺傷的效應(yīng)細(xì)胞稱之為過(guò)繼療法,是腫瘤免疫治療的良好策略之一[1]。但是傳統(tǒng)的T細(xì)胞過(guò)繼治療肝癌方法,難以獲得滿意的募集效應(yīng)細(xì)胞至腫瘤部位效應(yīng),同時(shí)缺乏靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的能力,因此需要尋找新的策略來(lái)提高T細(xì)胞過(guò)繼治療的效果。

雙特異性抗體(Bispecific antibody,BsAb)是指能夠同時(shí)靶向兩個(gè)抗原或者一個(gè)抗原的兩個(gè)不同表位的基因工程抗體。由于其特異性和雙功能性,現(xiàn)已在腫瘤治療及自身免疫病等領(lǐng)域中引起廣泛關(guān)注[2]。適配體是一類分子量小、易于修飾合成、低毒低免疫原性、組織滲透性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的靶向識(shí)別分子,也已在生物醫(yī)藥領(lǐng)域開(kāi)展了廣泛研究[3]。本項(xiàng)目設(shè)想通過(guò)CTLA-4納米抗體阻斷T細(xì)胞活化過(guò)程中的負(fù)性共刺激分子而進(jìn)一步誘導(dǎo)T細(xì)胞的殺傷腫瘤效應(yīng),同時(shí)聯(lián)合適配體的腫瘤細(xì)胞靶向識(shí)別能力,構(gòu)建一種新型的BsAb,希望其能將更高效能的T細(xì)胞靶向募集至腫瘤部位,從而發(fā)揮腫瘤的特異性殺傷作用。因此,本研究利用前期工作已經(jīng)篩選出的CTLA-4特異性納米抗體Nb16[4],結(jié)合能特異性結(jié)合肝癌細(xì)胞HepG2的TLS11a適配體,制備一種新型的BsAb,有望為腫瘤的免疫治療提供一條有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的新策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料 1-棕櫚?；?2-硬脂?；?POPC)、雙十八烷基溴化銨(DDAB)、膽固醇(Chol)、二硬脂?；字Ｒ掖及贰垡叶?000 (DSPE-PEG2000)、磷脂聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺[DSPE-PEG(2000)-MAL],購(gòu)自美國(guó)Avanti polar lipids公司。修飾巰基的適配體由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其序列為:5’-ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTC-ATGGACGTGCTGTTTTTTTTTT-SH-3’。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 高速離心機(jī)(Thermo,德國(guó)),冷凍干燥機(jī)(Martin Christ,德國(guó)),小型噴霧干燥器,Nano-S 型激光粒度分析儀(Malvern,英國(guó)),透射電子顯微鏡(日立,日本),流式細(xì)胞儀(Beckman,美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雙靶向脂質(zhì)體的制備。(1)采用薄層水化法制備空載脂質(zhì)體(Lipo):將POPC、Chol、DSPE-PEG2000、DDAB和DSPE-PEG(2000)-MAL按質(zhì)量摩爾比52∶40∶5∶3∶0.3比例溶解到圓底燒瓶的氯仿溶液中,然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(設(shè)定溫度為60℃)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min便可得到脂質(zhì)薄膜狀固體。連同圓底燒瓶將所得脂質(zhì)薄膜放置于真空干燥儀中干燥過(guò)夜,除去殘留有機(jī)溶劑。然后將瓶底的脂質(zhì)薄膜用1ml 300mmol/L的枸櫞酸緩沖液 (pH=4.0) 進(jìn)行水化,隨后置于50℃的水浴中超聲20min,再使用液氮和60℃水浴循環(huán)凍融5次。將所得產(chǎn)物裝入脂質(zhì)體擠推器,依次通過(guò)200nm、100nm的聚碳酸酯膜各20次,最后便可得到直徑約100nm的空白脂質(zhì)體。(2)制備適配體和納米抗體共修飾的雙靶向脂質(zhì)體:納米抗體、適配體、脂質(zhì)體按照質(zhì)量摩爾比1∶1∶10的比例混合到PBS溶液中,混勻,然后4℃條件下震蕩孵育 24h,最后使用HEPES透析后即可獲得Nb16-Lipo-TLS11a。(3)制備熒光脂質(zhì)體:在全程避光條件下,將納米抗體、適配體、脂質(zhì)體、FITC熒光染料按質(zhì)量摩爾比1∶1∶10∶1混合到PBS溶液中,然后按照制備Nb16-Lipo-TLS11a一樣的步驟進(jìn)行,便可得到帶熒光的F-Nb16-Lipo-TLS11a。(4)為了驗(yàn)證雙靶向脂質(zhì)體的體外靶向性能,我們還制備了單一修飾的熒光脂質(zhì)體,包括只修飾適配體脂質(zhì)體(Lipo-TLS11a)和只修飾納米抗體的脂質(zhì)體(Nb16-Lipo),即在上述空白脂質(zhì)體中分別只加入適配體或納米抗體溶液混勻,余步驟同前。

1.3.2 雙靶向脂質(zhì)體的表征。使用Zetasizer粒度電位儀測(cè)量和分析脂質(zhì)體的粒徑和電位;通過(guò)透射電子顯微鏡觀察并拍攝脂質(zhì)體的形態(tài)特點(diǎn)。

1.3.3 雙靶向脂質(zhì)體體外靶向活性檢測(cè)。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從健康供體的全血中分離出人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)(已提供知情同意書(shū))。將PBMCs懸浮于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中1h。去除未貼壁細(xì)胞,然后用尼龍羊毛纖維分離T細(xì)胞。所有流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均在4℃下進(jìn)行。使用植物血凝素PHA( 10μg/ml)刺激T細(xì)胞,然后將3×105刺激的T細(xì)胞在30min內(nèi)用PBS/2% BSA溶液振蕩飽和,以避免非特異性結(jié)合。在PBS/2% BSA中加入熒光雙靶向脂質(zhì)體F-Nb16-Lipo-TLS11a(設(shè)置另外一組加入只修飾適配體的脂質(zhì)體Lipo-TLS11),孵育30min。PBS洗滌3次后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)合情況。

檢測(cè)雙靶向脂質(zhì)體與肝癌細(xì)胞HepG2和人正常肝細(xì)胞HL-7702的結(jié)合:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置不能與適配體TLS11a結(jié)合的HL-7702細(xì)胞作為對(duì)照,分別取3×105細(xì)胞于50μl PBS溶液中重懸,然后加入40μl PBS溶液、10μl胎牛血清和熒光雙靶向脂質(zhì)體F-Nb16-Lipo-TLS11a混勻(設(shè)置另外一組加入只修飾納米抗體的脂質(zhì)體Nb16-Lipo),混勻,于4℃、避光條件下孵育30min,最后使用PBS 洗滌細(xì)胞并離心5min,重復(fù)洗滌3次,最后重懸細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。以上流式細(xì)胞術(shù)所獲得數(shù)據(jù)均采用Flow Jo軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 雙靶向脂質(zhì)體的表征 通過(guò)TEM觀察可以看到(見(jiàn)圖1a),雙靶向脂質(zhì)體Nb16-Lipo-TLS11a具有圓球形或橢圓球形形態(tài),大小均質(zhì),而且分散性良好。空載脂質(zhì)體Lipo的平均水化粒徑是94.57nm,在逐步修飾納米抗體和適配體后,平均粒徑分別增大至99.67nm與103.43nm(見(jiàn)圖1b)。電位檢測(cè)顯示(見(jiàn)圖1c),無(wú)修飾的空載脂質(zhì)體的平均電位為18.76mV,由于適配體核酸序列和納米抗體蛋白表面為負(fù)電荷,因此在修飾雙靶向分子后,靶向脂質(zhì)體電位發(fā)生了負(fù)向偏移。經(jīng)過(guò)檢測(cè),雙靶向脂質(zhì)體表面平均電位為9.14mV,這說(shuō)明適配體修飾成功。

圖1 雙靶向脂質(zhì)體的表征

2.2 流式細(xì)胞儀分析雙靶向脂質(zhì)體的體外靶向能力 為了分析雙靶向脂質(zhì)體Nb16-Lipo-TLS11a結(jié)合PHA刺激的人T細(xì)胞的能力,進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)。結(jié)果表明,只修飾適配體的脂質(zhì)體Lipo-TLS11a不能結(jié)合活化的T細(xì)胞,而雙靶向脂質(zhì)體Nb16-Lipo-TLS11a能識(shí)別活化的T細(xì)胞 (見(jiàn)圖2a),說(shuō)明雙靶向脂質(zhì)體修飾納米抗體后擁有了靶向結(jié)合T細(xì)胞上的CTLA-4位點(diǎn)的能力。同時(shí),雙靶向脂質(zhì)體Nb16-Lipo-TLS11a也能識(shí)別表達(dá)肝癌HepG2細(xì)胞 (見(jiàn)圖2b),卻無(wú)法靶向結(jié)合HL-7702細(xì)胞(見(jiàn)圖2c),說(shuō)明雙靶向脂質(zhì)體通過(guò)修飾適配體后,具備了特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)雙靶向脂質(zhì)體的體外靶向能力

3 討論

細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4 (Cytotoxic Tlymphocyte-associated Antigen-4,CTLA-4) 受體是第一個(gè)用作臨床靶標(biāo)的免疫檢查點(diǎn)[5],也是T 細(xì)胞表面最具代表性的免疫抑制點(diǎn)分子。目前,人們利用CTLA-4抗體阻斷T細(xì)胞活化過(guò)程中CTLA-4對(duì)T細(xì)胞活化后的抑制,從而促進(jìn)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答,使獲得滿意的抗腫瘤效應(yīng)成為可能。然而傳統(tǒng)抗體在實(shí)際應(yīng)用中仍存在問(wèn)題亟待解決,如抗體分子量大,在瘤內(nèi)的穿透性欠佳等,因此有必要建立更加高效、穿透力強(qiáng)的新型抗體用于腫瘤治療。抗體人源化、高效化及小型化均已成為當(dāng)前抗體藥物研究的主要趨勢(shì)[6]。納米抗體(Nanobody,Nb)是目前可以得到的穩(wěn)定的可結(jié)合抗原的最小單位[7]。納米抗體是一種小型的基因工程抗體,由于它具備良好穩(wěn)定性、強(qiáng)組織穿透力及較弱的免疫原性,使其在腫瘤免疫治療等方面展現(xiàn)巨大的應(yīng)用潛力[8]。本課題組前期已篩選出了CTLA-4特異性的納米抗體Nb16,實(shí)驗(yàn)證明其與CTLA-4抗原有較好的結(jié)合力與活性[4],具有巨大的應(yīng)用潛力。

阻斷CTLA-4對(duì)T細(xì)胞活化后的抑制還不夠,如何將腫瘤殺傷效應(yīng)T細(xì)胞富集至腫瘤部位也是目前研究的熱點(diǎn)方向。適配體能夠通過(guò)三維結(jié)構(gòu)以高親和力特異性結(jié)合在靶標(biāo)上,能夠?yàn)橹鲃?dòng)靶向腫瘤細(xì)胞提供理想的靶向分子,被廣泛應(yīng)用于藥物靶向治療及腫瘤檢測(cè)等領(lǐng)域[9-10]。因此,本研究首次將納米抗體和適配體聯(lián)合,結(jié)合納米技術(shù),以脂質(zhì)體為連接介質(zhì),將這兩種具有不同靶向效能的小分子連接,從而構(gòu)建一種具有BsAb功能的雙靶向脂質(zhì)體Nb16-Lipo-TLS11a。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明了Nb16-Lipo-TLS11a構(gòu)建成功,并且其具有同時(shí)靶向結(jié)合PHA活化的T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞HepG2的能力。但是,Nb16-Lipo-TLS11a是否能將活化T細(xì)胞定向募集至腫瘤細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的高效且特異性殺傷,還有待本課題組在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之,本研究制備了一種CTLA-4納米抗體與腫瘤適配體共修飾的雙靶向脂質(zhì)體Nb16-Lipo-TLS11a。理論上,這種脂質(zhì)體能通過(guò)Nb16阻斷T淋巴細(xì)胞活化過(guò)程中的負(fù)性共刺激分子而進(jìn)一步誘導(dǎo)T細(xì)胞的殺傷腫瘤效應(yīng),同時(shí)基于適配體對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向識(shí)別能力,可以將腫瘤殺傷T淋巴細(xì)胞靶向募集至腫瘤部位進(jìn)行特異性殺傷。而且,通過(guò)替換靶向不同靶標(biāo)的適配體,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)各種腫瘤的靶向治療,為腫瘤的免疫治療提供了新思路。