潘 虹,陸天炆,王曉軍,洪一楠

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,陜西 西安 710048)

0 引 言

生物酶是一類具有催化效率高、專一性強的生物催化劑[1],其本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)。因此,生物酶通常需在常溫常壓等溫和條件下才能表現(xiàn)出其高催化性能,當(dāng)離開特定環(huán)境就會出現(xiàn)酶活性和穩(wěn)定性迅速降低的缺點[2]?；钚蕴靠梢晕秸崽敲高M(jìn)行蔗糖水解,且保持了蔗糖酶較好的催化活性[3]。由此,固定化酶的思想被首次提出。隨后,研究人員開始通過一系列酶固定化技術(shù)來改善游離酶存在的缺點。

酶固定化技術(shù)就是指將游離酶通過一定的技術(shù)手段固定在某些不溶性載體上,進(jìn)而使其在敏感環(huán)境下仍然表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性和酶活性[4]。經(jīng)固定化后的酶,可以借助載體的保護(hù)作用或者與載體之間相互作用,保護(hù)了酶蛋白的空間構(gòu)象[5],進(jìn)而提高了對pH、溫度、重金屬離子等影響因素的耐受性。同時,固定化酶可以通過簡單的離心過濾等手段從反應(yīng)體系中分離出來,促進(jìn)漆酶的回收和重復(fù)使用[6]。

目前,固定化酶技術(shù)已經(jīng)在食品加工[7]、生物傳感器[8]、紡織印染廢水處理[9-10]、生物漂白[11]等諸多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用,其固定化技術(shù)也表現(xiàn)出愈發(fā)成熟的發(fā)展。本文綜述了近五年酶固定化技術(shù)的發(fā)展,重點表現(xiàn)在固定化方法和固定化載體上,以及酶固定化技術(shù)在多個領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 酶固定化方法

酶固定化方法可分為傳統(tǒng)固定化方法和新型固定化方法。表1列出來近五年的一些酶固定化技術(shù)所用的方法。

表 1 固定化酶所用固定化方法

1.1 傳統(tǒng)固定化方法

1.1.1 吸附法

吸附法即物理吸附,物理吸附是一種簡單易行的方法,通過氫鍵、疏水作用和范德華力等相互作用使酶吸附到不溶于水的載體表面,該方法操作步驟簡潔且不需要額外添加化學(xué)試劑,但其固定效果較差且容易受外界條件影響[29]。WANG等采用吸附法將漆酶固定在堿改性生物炭(A-MB)上實現(xiàn)對孔雀石綠(MG)的吸附降解,結(jié)果表明,A-MB對MG表現(xiàn)出最大吸附量757.58 mg/g,固定化漆酶A/lac@A-MB對MG的去除率可達(dá)97.70%,10次循環(huán)后仍然表現(xiàn)出超過75%的去除率[12]。ACET等以沸石顆粒(PPA)為原料,通過簡單方法制備了Cu2+-APPaC包埋型復(fù)合晶凝膠(Cu2+-APPaC)用于α-淀粉酶吸附固定,結(jié)果表明,α-淀粉酶最大吸附量可達(dá)858.7 mg/g,同時相較于游離酶,其操作穩(wěn)定性和存儲穩(wěn)定性也表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢[13]。

1.1.2 結(jié)合法

結(jié)合法是利用酶的側(cè)鏈基團(tuán)與載體表面的基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)形成共價鍵,利用共價鍵將酶固定在載體上[30]。GHASEMI等將MIL-53(Fe)通過表面官能化對2種脂肪酶進(jìn)行共價固定,結(jié)果顯示脂肪酶固定化體系雖然沒有實現(xiàn)對酶的高負(fù)載,但仍然表現(xiàn)出更廣泛的溫度和pH值穩(wěn)定性,同時實現(xiàn)了酶的可重復(fù)使用能力和穩(wěn)定性的顯著改善[14]。此外,共價結(jié)合法由于化學(xué)鍵的形成,容易使酶的蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變,從而降低酶活性[31]。FAN等采用戊二醛多點共價結(jié)合法和吸附-交聯(lián)法,以球形二氧化硅為載體,固定化皺紋假絲酵母脂肪酶(CRL),結(jié)果表明,多點共價處理后脂肪酶二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使酶的殘余活力下降[15]。但相比之下,共價結(jié)合法制備的酶體系具有更好的重復(fù)使用性和穩(wěn)定性,使其在酸化油脂催化水解中更有潛力。

1.1.3 化學(xué)交聯(lián)法

交聯(lián)法是通過一些雙功能試劑將酶和載體進(jìn)行連接[31],主要用到的交聯(lián)劑有戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、二醛淀粉和二醛纖維素[30,32-33]等。CHEN等以戊二醛作為交聯(lián)劑制備了一種具有超順磁性的固定化漆酶Fe3O4@SiO2-NH2-Lac,該固定化體系表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性,對有機(jī)溶劑、金屬離子有顯著的耐受性和良好的循環(huán)使用性,同時在對酚類化合物的去除降解方面也表現(xiàn)出巨大的潛力[16]。QIU等以二醛淀粉為交聯(lián)劑,采用共價固定法將漆酶在離子液體改性的磁性納米載體上進(jìn)行固定,較于其他固定化漆酶,在處理含酚廢水中表現(xiàn)出更大優(yōu)勢[17]。然而常見的交聯(lián)劑在固定化過程往往會表現(xiàn)出一定的負(fù)面影響[34],為此研究人員著手發(fā)掘綠色安全的新型交聯(lián)劑來避免這種負(fù)面影響。例如,OUYANG等提出了一種新的綠色高效固定化酶的方法——京尼平苷酶解物作為交聯(lián)劑固定化漆酶[18]。與直接使用京尼平或戊二醛作為交聯(lián)劑,該方法綠色、安全,可應(yīng)用于需要嚴(yán)格控制毒性的食品和醫(yī)藥行業(yè)。DANIELLI等研究了一種雙功能交聯(lián)劑2,5-二甲酰基呋喃 (DFF) 將葡糖淀粉酶固定在氨基官能化甲基丙烯酸樹脂上[19]。使用海洋細(xì)菌費氏弧菌進(jìn)行了生態(tài)毒性測定,相比于戊二醛,DFF表現(xiàn)出更低的生物毒性。

1.1.4 包埋法

包埋法是將酶固定在聚合物材料的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)或微囊結(jié)構(gòu)等多空隙載體中[35]。這種方法可以提供更好的保護(hù)和穩(wěn)定性,限制了酶的擴(kuò)散。但同時也存在孔隙的擴(kuò)散阻礙,使得該方法的循環(huán)使用效率下降。例如,LATIF等采用包埋法將漆酶固定化在海藻酸銅微球上進(jìn)行雙酚A的降解[20]。相比于游離酶,固定化漆酶表現(xiàn)出更高的pH、溫度穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性,但在循環(huán)使用5次后剩余酶活降到了21.5%。

1.2新型固定化方法

1.2.1 傳統(tǒng)固定化方法的改進(jìn)

傳統(tǒng)的單一固定化方法進(jìn)行酶固定往往存在各自的缺點,因此出現(xiàn)了將單一方法進(jìn)行兩兩結(jié)合來固定化酶的改進(jìn)方法。常見的包括吸附-交聯(lián)法[21-22]、吸附-包埋法[23-24]、交聯(lián)-包埋法[25]等。例如,FATHALI等以介孔二氧化硅為載體,采用交聯(lián)-包埋相結(jié)合的固定化方法制備了包埋交聯(lián)漆酶聚集體(E-CLEA)[25]。相對于游離漆酶,條件優(yōu)化后的固定化漆酶顯示出較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。此外E-CLEA存儲21 d仍然具有較高的相對活性,在重復(fù)使用20次后,其活性保持率可達(dá)初始活性的79%。對污染廢水中苯酚的去除率可達(dá)73%[25]。

1.2.2 共固定化酶法

共固定化酶是指將多種酶同時固定化在同一載體上的一種方法。ARANA-PEA等實現(xiàn)了將5種酶進(jìn)行逐層固定化的策略,使得整個固定化酶體系的活性明顯增強[26]。與單一酶的固定化相比,共固定化酶法通常具有更大的優(yōu)勢。在保證了固定化后酶穩(wěn)定性提高的同時,不同酶在共固定后,由于處于同一載體上,酶之間可以發(fā)揮協(xié)同作用,且反應(yīng)底物可以連續(xù)在酶之間傳遞,從而簡化了反應(yīng)步驟。GAO等制備了一種化學(xué)酶級聯(lián)反應(yīng)體系(GA&GOx@Au-SiO2),實現(xiàn)葡萄糖淀粉酶(GA)和葡萄糖氧化酶(GOx)共固定化[27]。借助于雙酶和載體之間的級聯(lián)效應(yīng),實現(xiàn)了從可溶性淀粉中高效提取葡萄糖酸。在保證了固定化雙酶穩(wěn)定性的同時,Au的加入可以使中間產(chǎn)物H2O2快速脫除,顯著提高固定化體系的重復(fù)利用率。類似地,LIU等制備了一種具有可逆熱響應(yīng)釋放的雙酶固定化體系共固定GOx和辣根過氧化物酶(HRP),在葡萄糖濃度檢測過程中表現(xiàn)出優(yōu)于單酶檢測試劑盒的良好性能[28]。

此外,有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),對于如漆酶這種綠色催化劑,較低的氧化還原電位大大限制了其在各個領(lǐng)域中的應(yīng)用。但發(fā)現(xiàn)在固定化體系中引入具有高氧化還原電位的介體可以彌補漆酶的這一不足[36]。LOU等基于MOFs膜實現(xiàn)了漆酶和介體ABTS的共固定化,結(jié)果顯示,固定化漆酶的底物親和力要高于游離漆酶[37]。

2 酶固定化載體

用于酶固定化的載體主要包括天然載體、人工合成載體和納米載體,見表2。在選擇固定化載體時要充分考慮具體的應(yīng)用領(lǐng)域和需求等。

表 2 固定化酶所用載體材料

2.1 天然載體材料

天然載體最大的優(yōu)點就是來源廣泛、低成本和低生物毒性。常用的天然載體有纖維素[38]、瓊脂糖[39]、殼聚糖[40]和藻酸鹽[41-42]等。同時,將天然載體雜化后用于酶固定化可以表現(xiàn)出更優(yōu)良的固定化能力。MEHANDIA[43]等利用天然載體制備了殼聚糖-黏土復(fù)合微球(CCB-L),采用包埋法對漆酶和介體進(jìn)行共固定。微球在洗滌和儲存期間均未觀察到酶泄漏。同時固定化漆酶-介體體系通過填充床反應(yīng)器系統(tǒng)(PBRS),對紡織廢水的脫色率可達(dá)78%,COD、BOD以及毒性水平均下降。類似地,BAI等將海藻酸鈉和殼聚糖交聯(lián)形成復(fù)合凝膠球,采用包埋法固定中性蛋白酶[44]。固定化酶在較寬的pH(5～8)和溫度(30～80 ℃)范圍表現(xiàn)出高于游離酶的相對活性,循環(huán)使用性和存儲穩(wěn)定性也保持在良好水平。

2.2 人工合成載體材料

2.2.1 無機(jī)材料

無機(jī)材料來源廣泛、合成簡單、機(jī)械強度高,可以直接用于酶的固定。常見的無機(jī)材料有二氧化硅[45]、二氧化鈦[48]、硅酸鹽[49-50]和氧化鋁[51]等。為了提高固定化效率,常常會先對無機(jī)材料進(jìn)行表面改性再用于固定化。ZHAI等使用聚乙烯亞胺(PEI)和多巴胺的共沉積對二氧化硅微球進(jìn)行改性,用于CO2酶促轉(zhuǎn)化甲酸鹽。優(yōu)化后PDA/PEI-SiO2載體使得甲酸鹽合成的初始反應(yīng)速率從13.4倍增加至27.2倍。再通過固定化碳酸酐酶(CA)后,甲酸鹽的合成速率增加到48.6倍[46]。隨后,LIU等同樣對SiO2微球進(jìn)行PEI的表面改性后用來固定化甲酸脫氫酶,同樣實現(xiàn)了CO2酶促轉(zhuǎn)化甲酸鹽的高效合成[47]。

2.2.2 高分子材料

人工合成的高分子材料具有良好的結(jié)構(gòu)剛性和其他優(yōu)良的力學(xué)性能。如聚酰胺、聚乙烯醇等具有良好的固定化能力。ZHAO等采用3種胺類試劑將聚酰胺-胺樹枝狀大分子(PAMAM)接枝到Fe3O4納米粒子上,利用戊二醛作為交聯(lián)劑得到了不同代數(shù)的Fe3O4@SiO2/PAMAM磁性納米載體[52]。固定化酶表現(xiàn)出相對游離酶更高的活性,而且改善了其在更寬的pH和溫度范圍內(nèi)的耐受性。ALAG?Z等先用聚乙烯醇水凝膠包裹烯還原酶(ER),再固定到氨基官能化的硅膠上。包埋后的ER比游離ER的熱穩(wěn)定性高34.4倍。在重復(fù)使用10次后,固定后的 ER仍保持其初始活性的85%[53]。

2.2.3 復(fù)合材料

針對有機(jī)、無機(jī)材料在實際應(yīng)用中存在的不足,不少文獻(xiàn)報道了將2類材料通過物理或化學(xué)手段進(jìn)行復(fù)合得到新型復(fù)合材料,可以得到性能更優(yōu)的固定化載體。例如,GIRELLI等將二氧化硅和殼聚糖雜化得到復(fù)合材料,相比單材料擁有更好的機(jī)械強度、熱穩(wěn)定性及生物相容性。存儲30 d后仍具有大于70%的相對活性。對漆酶進(jìn)行固定化后,固定化率達(dá)到92%,在較寬的溫度和pH范圍內(nèi)固定化后漆酶表現(xiàn)出的穩(wěn)定性也要高于游離漆酶,重復(fù)循環(huán)利用15次剩余活性仍在61%以上[54]。

2.3 納米材料載體

納米材料憑借其小尺寸、高表面積和易改性等特點,成為了酶固定化載體研究的焦點。各種改性后的納米材料也在酶固定化領(lǐng)域得到蓬勃發(fā)展。

2.3.1 磁性納米載體

磁性納米載體是一種可以通過外部磁場實現(xiàn)固定化酶快速分離的良好材料。憑借這種磁學(xué)性質(zhì)和低生物毒性[16],其在固定化載體的選擇上表現(xiàn)突出。Fe3O4是被廣泛使用的一種磁性材料。但由于純Fe3O4自身的表面惰性和高團(tuán)聚,往往需要對其進(jìn)行表面改性后再應(yīng)用于固定化。RAN等制備了一種殼核結(jié)構(gòu)的磁性納米載體Fe3O4@MoS2@PEI用于漆酶固定。在二硫化鉬(MoS2)和聚乙烯亞胺(PEI)的修飾下,磁性載體擁有較大的比表面積并減弱了自身團(tuán)聚效應(yīng),對漆酶的負(fù)載量可達(dá)120 mg/g,酶活回收率可達(dá)90%,同時對于水中持久性致癌有機(jī)污染物也表現(xiàn)出了良好的降解效率[55]。

2.3.2 介孔納米載體

介孔材料作為一種多孔材料,憑借多孔結(jié)構(gòu)和大的比表面積,也是酶固定化的理想載體。金屬有機(jī)框架(MOFs)[56]憑借著可調(diào)控的孔徑和較大的比表面積在酶固定化方面得到廣泛應(yīng)用。LI等采用水熱法合成氨基官能化的MOF材料制備固定化漆酶,在最優(yōu)條件下實現(xiàn)了95%的剛果紅去除率,6次循環(huán)后降解率仍達(dá)到84.63%[56]。LU等以酵母為生物模板,將ZIF-8自組裝到酵母上得到雜合Y@ZIF-8,再用交聯(lián)劑固定過氧化物酶得到Y(jié)@ZIF-8@t-CAT。固定化酶的溫度、pH耐受性得到提高,更值得一提的是固定化酶在存儲45 d后活性仍保持在99%以上[57]。

除此以外,TANG等還制備了具有中空結(jié)構(gòu)的共價有機(jī)骨架微球(H-COF-OMe)[58]。這種孔缺陷的中空結(jié)構(gòu)有助于加快反應(yīng)物的擴(kuò)散,從而改善催化反應(yīng)過程,對四環(huán)素具有優(yōu)秀的降解效果。

2.3.3 金屬納米載體

金屬納米材料由于引入了金屬離子,可以提高載體的理化性質(zhì),在酶固定化過程中表現(xiàn)出重要作用。FU等將Fe3+/Fe2+固定到納米花形的共價有機(jī)框架(COF)中實現(xiàn)了固定化酶的磁分離[59]。LI等研究了以磁性Fe3O4為核,將單寧酸(TA)與不同類型金屬離子(Cu、Fe、Zn、Mn、Au)配位獲得了用于固定化的金屬酚醛網(wǎng)絡(luò)(MPN)涂層[60]。不同金屬離子的不同極化能力對MPN涂層的親水性和疏水性造成影響,從而給酶的固定化效率、催化活性和穩(wěn)定性帶來影響。對于漆酶而言,引入Cu2+對漆酶的活性中心具有正向的促進(jìn)作用,可以大大提高固定化漆酶的催化活性和底物親和力[61]。

3 結(jié)論與展望

生物酶作為一種極具潛力的生物催化劑,通過固定化技術(shù)使其在污染物的降解、食品加工、生物傳感器等諸多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。酶固定化技術(shù)促使酶在較寬的pH值和溫度范圍下表現(xiàn)出更優(yōu)良的催化活性,大大提高了生物酶在敏感環(huán)境下的穩(wěn)定性,實現(xiàn)了生物酶的可分離性及循環(huán)使用性。但目前看來,酶固定化技術(shù)依然存在一些不足。

1) 酶在固定化后,由于載體的存在使得底物擴(kuò)散受阻,無法與酶充分接觸,導(dǎo)致酶活性降低?？梢酝ㄟ^基因工程技術(shù)從酶本身出發(fā),利用定點突變或基因重組改變酶結(jié)構(gòu)來提高酶活。同時,通過摻雜合適的單一過渡金屬離子或多金屬離子協(xié)同作用激發(fā)酶活也值得深入研究。

2) 目前固定化酶技術(shù)在污染物降解等領(lǐng)域的實際應(yīng)用已經(jīng)頗為成熟,但對于更深層次的作用機(jī)制還停留在較為淺薄的層面。在未來,隨著生物信息技術(shù)的不斷發(fā)展,將固定化酶技術(shù)與計算機(jī)模擬技術(shù)交叉,利用計算機(jī)軟件模擬分析更深層次的機(jī)制原理,可以更好地掌握酶固定化技術(shù)。

3) 酶固定化技術(shù)仍處在實驗室研究階段,在實現(xiàn)更大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用仍然存在較大的挑戰(zhàn)。同時,考慮到有些固定化載體制備的時間成本和資金成本,載體若僅用于一次固定化后就無法回收再利用就會造成過度浪費。如何實現(xiàn)固定化酶失活后固定化載體與酶的高效分離,從而實現(xiàn)載體的循環(huán)使用是一個新的挑戰(zhàn)。因此,酶固定化技術(shù)仍然處在不斷發(fā)展進(jìn)步的階段,需要更多的科研者來完善研究。