張俊飛，郭 莉，騫愛榮，黃勇平，張 舒，張 茹

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天生物動力學(xué)教研室，陜西 西安710032；2空軍第九八六醫(yī)院第三門診部，陜西 西安 710068；3西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西 西安 710072；4中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所，昆蟲發(fā)育與進化生物學(xué)重點實驗室，上海 200032)

空間微重力環(huán)境對航天員身體健康造成嚴(yán)重的威脅[1-3]。家蠶胚胎被認為是探索空間生命科學(xué)的理想材料，因為它具有體積小、繁殖率高、遺傳背景清晰、胚胎期生命活動活躍等優(yōu)點[4-5]。一系列實驗結(jié)果表明，空間環(huán)境對家蠶的孵化和發(fā)育過程產(chǎn)生了顯著影響。例如，美國亞特蘭蒂斯號航天飛機搭載的家蠶解滯育的蠶卵在空間中未孵化率較高，未完成胚胎逆轉(zhuǎn)的比例是地面組的2倍[6]。俄羅斯衛(wèi)星搭載的家蠶空間實驗顯示，飛行組的蠶卵孵化時間和交配蠶蛾的產(chǎn)卵時間均提前了2～3 d[7]。我國第12顆返回式衛(wèi)星成功搭載家蠶非滯育卵進行軌道飛行8 d，飛行組的胚胎孵化提前2 d，返回地面后，幼蟲發(fā)育時間縮短了7 d。2016年，我國首顆微重力科學(xué)實驗衛(wèi)星搭載家蠶卵空間飛行12 d，結(jié)果顯示胚胎基因表達受到影響，返回地面后，幼蟲發(fā)育時間縮短了3 d[4]。然而，航天飛行耗資巨大、空間環(huán)境復(fù)雜多變、不易控制。因此，地面模擬研究成為研究空間生物科學(xué)的重要選擇，具有低成本、小占地面積、易操作和多實驗機會的優(yōu)勢。三維回轉(zhuǎn)器，又稱隨機定位儀，是研究地面模擬失重效應(yīng)的設(shè)備。它包含兩個相互垂直的轉(zhuǎn)軸，可以隨機轉(zhuǎn)動內(nèi)框和外框。在一個回轉(zhuǎn)周期內(nèi)，物體受到的重力矢量和為零，從而模擬失重生物效應(yīng)[8]。研究表明，三維回轉(zhuǎn)器可以影響細胞的結(jié)構(gòu)和功能，如通過改變卵母細胞骨架進而影響線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位與功能[9]，降低成骨細胞分化能力[10]，增加乳腺癌細胞外囊泡的釋放并改變細胞間粘附因子的表達[11-12]。然而地面模擬微重力環(huán)境對家蠶胚胎發(fā)育的影響及其作用機制的研究鮮有報道。本研究采用三維回轉(zhuǎn)器模擬空間微重力環(huán)境，研究其對家蠶胚胎發(fā)育和基因表達的影響，為空間基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶品系是中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所提供的非滯育Nistari品系；隨機定位儀(中國科學(xué)院空間科學(xué)與應(yīng)用研究中心)；回轉(zhuǎn)控制器(中國科學(xué)院空間科學(xué)與應(yīng)用研究中心)；RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；DNA消化酶試劑盒(日本Takara公司)；SYBR Green Realtime PCR Master Mix(日本Toyobo公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；PCR擴增儀、離心機、紫外分光光度計、移液器(德國Eppendorf公司)；超凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；垂直板電泳槽、變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 雌雄蠶蛾交配6 h后，雌蛾產(chǎn)卵。蠶卵產(chǎn)下12 h后，置于三維回轉(zhuǎn)器上連續(xù)回轉(zhuǎn)11 d，作為回轉(zhuǎn)組，溫度維持在21 ℃。對照組則是不進行回轉(zhuǎn)處理的同批次家蠶卵。我們從對照組和回轉(zhuǎn)組中分別隨機選取了50粒家蠶胚胎樣本和30頭蟻蠶樣本進行RNA-seq測序。

1.2.2 RNA提取 準(zhǔn)備取材工具，包括剪刀、鑷子、冰盒、進口離心管和預(yù)冷的4 ℃離心機。將500 μL的TRIzol放入滅菌離心管中，并將家蠶胚胎或蟻蠶放入管中，標(biāo)記樣品名稱。使用研磨棒研磨組織，將其靜置在室溫下5 min，然后12 000 r/min離心10 min，取上清液進入新的滅菌離心管，棄去沉淀。加入100 μL三氯甲烷，輕輕搖晃，然后12 000 r/min離心15 min。取上清液進入新的離心管，加入等體積的異丙醇和1/10醋酸鈉，輕輕搖晃，冰上靜置10 min，然后12 000 r/min離心10 min。棄去上清液，取沉淀晾干，加入50 μL的無酶水。使用DNA消化酶試劑盒消化RNA提取液中的DNA。最后，純化RNA，將消化完DNA的RNA溶解液中加入150 μL無酶水+200 μL酚氯仿，然后12 000 r/min離心15 min。取上清液進入新的離心管，加入上清液1/10體積的醋酸鈉和2.5倍體積的無水乙醇，放置在-80 ℃下30 min，然后12 000 r/min離心15 min。去掉上清液，加入1 000 μL的750 mL/L乙醇，然后12 000 r/min離心5 min以洗去雜質(zhì)，洗滌過程重復(fù)3次。晾干沉淀，加入50 μL的無酶水，測量濃度，并進行電泳檢測。

1.2.3 RNA-seq測序 為了檢測三維回轉(zhuǎn)對家蠶胚胎基因表達的影響，我們從對照組和回轉(zhuǎn)組分別隨機選取家蠶胚胎(發(fā)育第5日)和剛孵化蟻蠶進行了RNA-seq測序。通過上述方法提取總RNA，并確保RNA完整性后，送至美吉生物公司進行RNA測序和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析，其目的是分析模擬失重環(huán)境對家蠶胚胎基因表達和通路的影響。RNA-seq分析的參考基因組來自家蠶EST數(shù)據(jù)庫(http：//silkbase.ab.a.u-tokyo.ac.jp/cgi-bin/index.cgi)。

1.2.4 qRT-PCR qRT-PCR使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。以上述cDNA產(chǎn)物為模板，使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix進行qRT-PCR擴增。PCR反應(yīng)體系包含：10 μL的SYBR；0.5 μL的上游引物；0.5 μL的下游引物；2 μL的cDNA模板；7 μL的超純水。PCR反應(yīng)程序包含：95 ℃預(yù)熱1.5 min，然后進行40個循環(huán)，循環(huán)是95 ℃，1 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min。qRT-PCR中使用的引物序列如表1所示。另一個引物對RP49(正向)和RP49(反向)(表1)被用作內(nèi)參[13]。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 三維隨機回轉(zhuǎn)模擬失重使家蠶胚胎發(fā)育提前

利用三維回轉(zhuǎn)器對家蠶胚胎樣本進行失重效應(yīng)的模擬?；剞D(zhuǎn)組的家蠶胚胎在回轉(zhuǎn)器上連續(xù)回轉(zhuǎn)11 d，溫度保持在21 ℃。對照組則為未回轉(zhuǎn)的同時期家蠶胚胎(圖1A)。在蠶胚胎發(fā)育的第10日，回轉(zhuǎn)組的蠶胚胎開始點青，而對照組沒有發(fā)生變化。第11日，對照組的蠶胚胎也開始點青。第12日，回轉(zhuǎn)組的胚胎開始孵化，而對照組沒有發(fā)生變化(圖1B)。通過三維回轉(zhuǎn)模擬失重效應(yīng)，我們觀察到回轉(zhuǎn)組的家蠶胚胎比對照組發(fā)育提前。這說明模擬失重對家蠶胚胎的發(fā)育產(chǎn)生了顯著影響。

A：三維回轉(zhuǎn)器對家蠶胚胎樣本進行失重效應(yīng)的模擬；B：對照組與回轉(zhuǎn)組胚胎發(fā)育照片。

2.2 RNA-seq分析差異表達基因

為了研究模擬失重對家蠶胚胎發(fā)育的影響機制，提取對照組和回轉(zhuǎn)組家蠶胚胎(發(fā)育第5日)，以及剛孵化的蟻蠶的總RNA。隨后，對提取的樣本進行RNA-seq分析。測序完成并經(jīng)過質(zhì)控后，對照組胚胎的測序讀段數(shù)量為52 750 876，回轉(zhuǎn)組胚胎為43 404 750。對照組蟻蠶的測序讀段數(shù)量為41 858 620，回轉(zhuǎn)組蟻蠶為58 435 660(表2)。同時，對照組胚胎的測序綜合質(zhì)量值為96.72%，回轉(zhuǎn)組胚胎為96.81%。對照組蟻蠶的測序綜合質(zhì)量值為95.85%，回轉(zhuǎn)組蟻蠶為97.07%(表2)。將質(zhì)控后的測序數(shù)據(jù)，即clean data(reads)與參考基因組進行比對，獲得能定位到基因組上的測序數(shù)據(jù)，用于后續(xù)分析。值得注意的是，四組樣品的數(shù)據(jù)定位率都遠遠高于合格值70%(表3)。以上數(shù)據(jù)提示轉(zhuǎn)錄組測序成功且數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。

表2 樣品質(zhì)控數(shù)據(jù)統(tǒng)計表

表3 clean reads與參考基因組的比對結(jié)果情況統(tǒng)計

差異表達基因篩選的條件：兩個樣本間顯著差異的轉(zhuǎn)錄本表達篩選閾值Padjust<0.005，且兩個樣本中轉(zhuǎn)錄本表達倍數(shù)大于2，即FC>2。在家蠶胚胎對照組和回轉(zhuǎn)組之間，發(fā)現(xiàn)1 247個顯著差異表達的基因，其中1 047個基因表達上調(diào)，200個基因表達下調(diào)(圖2A)。在家蠶對照組和回轉(zhuǎn)組蟻蠶之間，發(fā)現(xiàn)4 993個顯著差異表達的基因，其中3 533個基因表達上調(diào)，1 460個基因表達下調(diào)(圖2B)。隨著家蠶胚胎在失重環(huán)境中暴露的時間延長，差異表達的基因數(shù)量也會增加。

A：對照組與回轉(zhuǎn)組家蠶胚胎發(fā)育第5日差異表達基因；B：對照組與回轉(zhuǎn)組蟻蠶差異表達基因。

2.3 差異表達基因的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

為進一步研究模擬失重對家蠶胚胎和蟻蠶基因表達的影響，我們進行了GO和KEGG通路的富集分析。在GO功能注釋分析中，差異基因被歸為30個條目中，包含3個生物過程，8個細胞成分和9個分子功能。在篩選的胚胎期差異基因中，生物過程中催化活性富集的基因數(shù)量最多(151個)，細胞成分中膜結(jié)構(gòu)富集的基因數(shù)量最多(95個)，分子功能中代謝過程富集的基因數(shù)量最多(134個，圖3)。此外，KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，回轉(zhuǎn)組胚胎相對于對照組胚胎，表達發(fā)生顯著變化的基因主要富集于核糖體和RNA轉(zhuǎn)運通路，這提示模擬失重可能通過這些信號通路影響家蠶胚胎發(fā)育。

圖3 胚胎發(fā)育第5日對照組與回轉(zhuǎn)組家蠶胚胎差異基因的GO功能注釋分析

此外，在蟻蠶期篩選的差異基因中，生物過程中催化活性通路的富集數(shù)量最多(742個)；細胞成分中膜結(jié)構(gòu)通路的富集數(shù)量最多(489個)；分子功能中代謝過程的富集數(shù)量最多(691個，圖4)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，回轉(zhuǎn)組蟻蠶相對于對照組蟻蠶，表達顯著變化的基因主要富集于多個代謝相關(guān)通路，包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解代謝，果糖和甘露糖的代謝，脂肪酸的降解，鞘脂信號通路等。除此之外，還富集于黏著斑、緊密連接等通路(表4)。這些結(jié)果提示隨著家蠶胚胎回轉(zhuǎn)時間的延長，差異基因及其富集的通路數(shù)量也隨之增加。

圖4 對照組與回轉(zhuǎn)組蟻蠶差異基因的GO功能注釋分析

表4 對照組與回轉(zhuǎn)組蟻蠶差異基因的KEGG通路富集分析

2.4 差異表達基因的體外驗證

通過qRT-PCR進一步驗證了對照組和回轉(zhuǎn)組家蠶胚胎中篩選出的差異顯著基因的表達情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，回轉(zhuǎn)組胚胎中有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白、突觸囊泡糖蛋白2B、蛻皮甾體激酶22、組蛋白H1、卵巢絲氨酸蛋白酶異構(gòu)體1、嗅覺受體16、保幼激素環(huán)氧化物水解酶樣蛋白1、線粒體心磷脂水解酶同工酶x2以及生殖細胞發(fā)育必需的nanos-M基因的轉(zhuǎn)錄表達水平顯著升高(圖5)。以上結(jié)果表明，模擬失重可能通過調(diào)控上述基因的表達促進早期家蠶胚胎的發(fā)育。

圖5 模擬失重下家蠶胚胎相關(guān)基因的表達變化(bP<0.01)

qRT-PCR驗證對照組與回轉(zhuǎn)組蟻蠶中表達顯著上調(diào)的基因(A)與下調(diào)的基因(B)。aP<0.05，bP<0.01。

此外，我們也利用qRT-PCR驗證了篩選出的對照組與回轉(zhuǎn)組蟻蠶差異顯著基因的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，回轉(zhuǎn)組蟻蠶中葛老素2抗菌肽、肌醇加氧酶、胰蛋白酶、造血表達同源盒蛋白、膽固醇-25-羥化酶、toll樣受體、氨肽酶N、甘氨酸轉(zhuǎn)運蛋白1、脂多糖誘發(fā)腫瘤壞死因子α同族體、糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶前體基因的轉(zhuǎn)錄表達水平顯著升高(圖6A)。然而，表皮蛋白RR2、膠原蛋白α-1、msta多效蛋白樣蛋白、膠原蛋白和鈣結(jié)合表皮生長因子結(jié)構(gòu)域基因的轉(zhuǎn)錄表達水平顯著降低(圖6B)。以上結(jié)果暗示，模擬失重可能通過促進或抑制上述基因的表達促使蟻蠶孵化時間提前。

3 討論

本研究使用三維隨機回轉(zhuǎn)器模擬失重環(huán)境處理家蠶胚胎，發(fā)現(xiàn)模擬失重使家蠶胚胎發(fā)育提前。RNA-seq分析結(jié)果顯示，模擬失重影響了家蠶胚胎中期和蟻蠶期基因的表達。隨著在失重環(huán)境中暴露時間的延長，差異表達基因的數(shù)量以及這些基因所參與的富集通路數(shù)量也呈遞增趨勢。

目前，我國的空間站已經(jīng)完成建造，并進入應(yīng)用與發(fā)展階段。隨著航天員在軌時間的增加，他們所面臨的環(huán)境也變得更加復(fù)雜，包括輻射、失重、振動噪聲和晝夜節(jié)律的變化等。其中，失重作為一個重要的影響因素對航天員的身心健康產(chǎn)生影響[1-3]。然而，由于空間飛行實驗機會少，在軌航天員數(shù)量有限，導(dǎo)致實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)相對較少，無法滿足對失重生物學(xué)效應(yīng)進行深入研究的需求。因此，地面模擬失重研究成為一種重要的選擇。在空間生物學(xué)領(lǐng)域，已經(jīng)應(yīng)用了多種地面模擬失重的研究方法，包括頭低位臥床、后肢尾懸吊、水下模擬失重、回轉(zhuǎn)模擬器、抗磁懸浮超導(dǎo)磁體、飛機拋物線飛行等[14-19]。而三維隨機回轉(zhuǎn)器具有占用空間小，能夠長時間模擬失重環(huán)境的優(yōu)勢。因此，本研究選擇采用三維隨機回轉(zhuǎn)器模擬失重。

家蠶胚胎是進行空間搭載和地面模擬失重實驗的理想材料。家蠶胚胎在發(fā)育階段細胞不斷增殖和分化，形成各種器官，并且基因表達活躍，這些遺傳信息可以反映整個家蠶生命過程。此外，家蠶具有很高的繁殖率，一只雌蛾可以產(chǎn)卵約400粒，這為實驗提供了大量的胚胎材料。家蠶胚胎的孵化周期為10 d，在此期間它們不需要進食，為實驗的連續(xù)開展提供了便利。家蠶的遺傳背景清晰，早在2004年就已完成了家蠶全基因組測序[20]，為后續(xù)的遺傳分子實驗奠定了基礎(chǔ)。綜上所述，家蠶胚胎具有許多優(yōu)點，使其成為實驗研究的理想材料。根據(jù)俄羅斯第10號生物衛(wèi)星搭載中國蠶的實驗結(jié)果顯示，飛行組蠶卵的孵化時間比對照組早2～3 d，且航天飛行中滯育卵的孵化率高于對照組[7]。地面抗磁懸浮超導(dǎo)磁體模擬失重環(huán)境處理家蠶胚胎的實驗結(jié)果顯示，胚胎的孵化時間比正常蠶卵縮短了約3 d[21]。本研究發(fā)現(xiàn)三維回轉(zhuǎn)模擬失重環(huán)境處理家蠶胚胎導(dǎo)致胚胎發(fā)育時間比對照組縮短。這些研究結(jié)果一致表明，失重處理能夠縮短家蠶胚胎的發(fā)育時間。然而，失重對家蠶胚胎發(fā)育影響的潛在分子機制尚不明確。

本研究分別對家蠶胚胎中期和孵化期的對照組和回轉(zhuǎn)組(模擬失重環(huán)境)樣本進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果顯示，隨著失重環(huán)境處理時間的延長，差異表達基因數(shù)量增加，并且影響到更多的蛋白通路。這表明失重環(huán)境對家蠶胚胎的影響與處理時間呈正相關(guān)，而且在較長時間的處理下，影響的生物過程和通路范圍更廣泛。根據(jù)KEGG通路富集分析的結(jié)果，模擬失重對家蠶胚胎發(fā)育中期的核糖體和RNA轉(zhuǎn)運通路產(chǎn)生影響。這兩個通路是相互關(guān)聯(lián)的，并在蛋白質(zhì)合成和細胞功能中起著至關(guān)重要的作用[22]。因此，模擬失重可能會通過影響家蠶胚胎中期的蛋白質(zhì)合成途徑來促進胚胎發(fā)育。利用qRT-PCR進行驗證，發(fā)現(xiàn)模擬失重導(dǎo)致家蠶胚胎相關(guān)基因表達顯著增加。其中一些基因包括有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白和突觸囊泡糖蛋白2B基因，它們參與離子轉(zhuǎn)運功能[23]。另外，蛻皮甾體22激酶和保幼激素環(huán)氧化物水解酶樣蛋白1參與蛻皮功能的調(diào)控[24]，卵巢絲氨酸蛋白酶異構(gòu)體1和nanos-M參與性別調(diào)控[25]，線粒體心磷脂水解酶同工酶x2參與代謝調(diào)控[26]，嗅覺受體16參與嗅覺調(diào)控[27]。綜合KEGG通路富集分析和體外實驗結(jié)果，提示模擬失重通過調(diào)控早期家蠶胚胎中離子轉(zhuǎn)運、蛻皮、性別、代謝和嗅覺關(guān)鍵基因的RNA轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)合成來影響家蠶胚胎發(fā)育。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們更好地理解模擬失重對生物體發(fā)育過程的影響機制。

對照組與回轉(zhuǎn)組孵化的蟻蠶進行的KEGG通路富集分析顯示，模擬失重處理后孵化的蟻蠶中代謝通路發(fā)生了顯著變化。通過qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)，模擬失重導(dǎo)致蟻蠶中氨肽酶N和膽固醇-25-羥化酶的表達顯著增加。氨肽酶N主要負責(zé)從蛋白質(zhì)或肽段的N端逐個去除氨基酸殘基，從而產(chǎn)生較短的肽段或游離氨基酸。這些肽段和游離氨基酸可以被其他酶和代謝途徑利用，參與能量產(chǎn)生、氨基酸代謝和新的蛋白質(zhì)合成等生物過程[28]。膽固醇-25-羥化酶則催化膽固醇的羥化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為25-羥基膽固醇，在膽固醇和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[29]。這表明模擬失重可能通過調(diào)控家蠶胚胎末期氨肽酶N和25-羥基膽固醇基因的表達，影響家蠶的氨基酸和脂質(zhì)代謝，從而最終影響胚胎發(fā)育。此外，模擬失重還導(dǎo)致孵化的蟻蠶中緊密連接和粘著斑通路發(fā)生了顯著變化。模擬失重引起了蟻蠶中糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶前體和胰蛋白酶的表達顯著增加。糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶參與了蛋白酶活化受體和基質(zhì)金屬蛋白酶-2的激活過程，并調(diào)節(jié)了緊密連接蛋白claudin-5的表達，從而維持腸上皮屏障功能的穩(wěn)態(tài)[30]。而緊密連接位于相鄰細胞間隙的頂端側(cè)面，具有封閉細胞間隙，保持滲透性和維持細胞極性的功能[31]。另外，胰蛋白酶和糜蛋白酶在皮膚角質(zhì)脫落過程中降解細胞間的粘附分子，促進皮膚細胞的脫落[32]。這提示模擬失重可能通過促進家蠶胚胎末期糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶和胰蛋白酶的表達，調(diào)控家蠶胚胎末期細胞的極性、滲透性和細胞粘附性，最終加速胚胎發(fā)育。

然而，目前對于模擬失重環(huán)境影響家蠶胚胎發(fā)育的具體分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制還需進一步探究。盡管如此，我們相信本研究中對模擬失重環(huán)境對家蠶胚胎發(fā)育的影響以及基因表達特征的分析，將為空間生物學(xué)研究提供可靠的實驗和理論基礎(chǔ)。