趙 輝，辛國(guó)輝，閆榮軍，韓煥美，張春新，厲淑紅，彭 健，宗春輝（通信作者）

（1.濟(jì)南國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，山東 濟(jì)南 250012；2.濟(jì)南海關(guān)，山東 濟(jì)南 250012）

蜚蠊是重要的口岸病媒生物，可以傳播多種細(xì)菌、病毒及寄生蟲，增加病原體通過(guò)口岸傳播風(fēng)險(xiǎn)，給口岸衛(wèi)生檢疫工作帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)［1］。山東省自然環(huán)境適合蜚蠊的生長(zhǎng)，輸入性蜚蠊對(duì)濟(jì)南海關(guān)轄區(qū)各口岸的公共衛(wèi)生安全造成了威脅。本研究利用宏基因組技術(shù)對(duì)2022 年至2023 年6 月間濟(jì)南海關(guān)轄區(qū)截獲送檢的623 只蜚蠊攜帶病原體進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，可為口岸防控蜚蠊傳播疾病提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 蟲體采集與處理

研究所采用的623 只蜚蠊為濟(jì)南海關(guān)轄區(qū)口岸入境的船舶、集裝箱檢疫截獲。截獲的蟲體使用無(wú)菌密封袋保存，加干冰運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。每批次40～50 只，每組制作成一個(gè)樣本，使用PBS 緩沖液對(duì)蜚蠊體表進(jìn)行反復(fù)沖洗，再用75%乙醇消毒5 min，最后用PBS 緩沖液反復(fù)洗滌3 次，采用液氮研磨的方法破碎勻漿，-80 ℃保存。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材

1.2.1 檢測(cè)試劑盒

霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、諾如病毒PCR檢測(cè)試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司生產(chǎn)）。

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建

ATPOIex RNA 多重PCR 建庫(kù)試劑盒套裝V3.1（包括ATPOIex RNA 多重PCR 擴(kuò)增模塊、內(nèi)參引物池V3.1、MGIEasy DNA 純化磁珠試劑盒）（華大制造）。

1.2.3 酶切文庫(kù)制備試劑盒

MGIEasy Fast PCR-FREE 酶切文庫(kù)制備試劑盒套裝（包括MGIEasy Fast PCR-FREE 酶切文庫(kù)制備模塊、MGIEasy 雙端獨(dú)立標(biāo)簽PF 接頭試劑盒A、MGIEasy DNA 純化磁珠試劑盒）（華大制造）。

1.2.4 DNB 制備

DNBSEQ 一步法DNB 制備試劑盒V2.0（OSDB）（華大制造）。

1.2.5 測(cè)序套裝和芯片

DNBSEQ-G99RS 高通量測(cè)序試劑槽和DNBSEQ-G99RS 測(cè)序載片（華大制造）。

1.3 儀器設(shè)備

1.3.1 核酸提取儀，西安天隆，GeneRotex96

1.3.2 PCR 儀，ABI-Q5

1.3.3 基因測(cè)序儀，華大，DNBSEQ-G99

1.3.4 PNB 濃度檢測(cè)儀，Thermo-Qubit4.0

1.4 宏基因組檢測(cè)分析

1.4.1 體表清洗液和組織液使用GeneRotex96 提取總RNA，RNA 均溶于DEPC 處理水。將檢測(cè)合格的RNA 去除rRNA，保留mRNA 以及其它的非編碼RNA，用于后續(xù)的文庫(kù)構(gòu)建。使用RNA 純化磁珠對(duì)RNA 消化產(chǎn)物進(jìn)行純化，使用NF water 洗脫RNA，制備DNB，用Qubit?ssDNA Assay Kit 和Qubit?Fluorometer 進(jìn)行濃度檢測(cè)。使用DNBSEQG99 測(cè)序儀，將已加載好的芯片放于機(jī)器運(yùn)行測(cè)序程序。

1.4.2 測(cè)序數(shù)據(jù)拼接完成后，使用大數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)模型、分析軟件CLC 和Nextclade 在線網(wǎng)站等進(jìn)行多序列比對(duì)和分析。

2 結(jié)果

2.1 蜚蠊物種鑒定情況

口岸截獲的623 只蜚蠊經(jīng)鑒定均為德國(guó)小蠊。

2.2 病原體檢測(cè)情況

霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、諾如病毒PCR檢測(cè)均為陰性。

2.3 病毒宏基因組檢測(cè)情況

623 只蜚蠊制作的15 組樣本中檢出蟑螂桿狀體細(xì)菌、大腸桿菌、腸球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、魏斯氏菌屬、變形桿菌、克雷伯菌屬等多種條件致病菌。（見表1）。

表1 輸入性蜚蠊病原體宏基因組檢測(cè)情況

3 討論

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和對(duì)外開放速度的提高，入出境人員及交通工具、集裝箱、貨物等逐年劇增，由此帶來(lái)的輸入性病媒生物及媒介傳染病傳入的風(fēng)險(xiǎn)性也進(jìn)一步加大。特別是我國(guó)許多口岸本身處于媒介傳染病的疫區(qū)或與境外疫區(qū)接壤，同時(shí)來(lái)自各種疫區(qū)的交通工具、集裝箱、貨物數(shù)量巨大，其帶來(lái)的危險(xiǎn)性更加突出。

蜚蠊作為口岸監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)病媒生物，具有高度適應(yīng)性，它們可能會(huì)通過(guò)交通工具、集裝箱和貨物等檢疫對(duì)象跨境轉(zhuǎn)移，很容易在入侵地定殖并形成危害。蜚蠊可以攜帶多種致病病原體，如大腸埃希菌可引起各種腸內(nèi)外的感染，是腹瀉和泌尿道感染的主要病原菌；克雷伯菌可引起肺部感染、泌尿道感染、膽道感染、敗血癥和化膿性腦膜炎等嚴(yán)重疾病，對(duì)人類造成嚴(yán)重危害［3］。本研究未檢出高致病病原體和不明病原體，條件致病菌檢出率高于高玉峰等研究［2］，可能與使用的方法學(xué)以及樣本來(lái)源和數(shù)量有關(guān)，本研究的樣本均為海港口岸截獲送樣，來(lái)源國(guó)家多為中東、日本、韓國(guó)等地區(qū)和國(guó)家，環(huán)境對(duì)蜚蠊的種群和攜帶病原體有一定的影響。本研究中，由于病原體豐度等因素，存在部分低辨識(shí)度或無(wú)法鑒定的RNA，可能會(huì)對(duì)病原體的檢出產(chǎn)生影響。

宏基因組分析檢測(cè)技術(shù)為濟(jì)南口岸防控輸入性蜚蠊傳播疾病提供有效技術(shù)支持，且在檢測(cè)靈敏度方面優(yōu)于PCR 檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)加強(qiáng)口岸蜚蠊監(jiān)控，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)并攔截外來(lái)物種，采取措施進(jìn)行防治，從而降低外來(lái)傳染病入侵和傳播的風(fēng)險(xiǎn)。加強(qiáng)對(duì)入境交通運(yùn)載工具的衛(wèi)生檢疫工作，通過(guò)加強(qiáng)口岸蜚蠊監(jiān)控，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理攜帶病原體的蜚蠊，有效預(yù)防疾病的傳播和擴(kuò)散，保障人民生命健康，防止疾病通過(guò)口岸傳入和流行，對(duì)于保障國(guó)民健康和經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)意義重大。