■ 盧俊言 鄒松巖 徐宏建 王明亞 吳春會(huì) 李秋鳳* 李樹靜 張秀江

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071001；2.河北天和肉牛養(yǎng)殖有限公司，河北石家莊 050200；3.保定農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北保定 071051）

犢牛階段是腸道菌群發(fā)育迅速的時(shí)期。犢牛出生時(shí)，腸道內(nèi)環(huán)境由于吞咽和腸黏膜毛細(xì)血管的彌散處于有氧狀態(tài)，此時(shí)有利于需氧菌和兼性需氧菌的繁殖，隨著犢牛的生長發(fā)育，厭氧菌不斷增多，腸道微生物菌群逐漸相對(duì)穩(wěn)定[1]。此時(shí)，犢牛腸道微生物菌群組成除了受初乳、年齡、環(huán)境及基因型等相關(guān)因素影響之外，飼料也是影響腸道菌群的主要因素之一。因此，在此階段攝入一定的開食料，才可滿足犢牛生長發(fā)育需要[2]。低蛋白日糧不僅可避免蛋白質(zhì)的浪費(fèi)，還可以節(jié)能減排，但較低蛋白水平的日糧對(duì)動(dòng)物的生長會(huì)產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)，因此在飼喂低蛋白日糧時(shí)需補(bǔ)充適當(dāng)?shù)陌被?。研究表明，亮氨酸（Leu）作為一種必需氨基酸和支鏈氨基酸（BCAA），在骨骼肌中，大約80%被作為底物用于蛋白質(zhì)合成[3]，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，而其余的則轉(zhuǎn)化為α-酮異己酸酯（α-KIC）和β-羥基-β-甲基丁酸酯（HMB）[4]，其還可以作為信號(hào)分子參與多種生理功能的維持與調(diào)控[5]。胡軍等[6]研究表明，日糧添加亮氨酸可以降低早期斷奶仔豬腸道的活性氧水平。此外，亮氨酸對(duì)早期斷奶湖羊羔羊瘤胃細(xì)菌菌群組成產(chǎn)生影響，從而影響瘤胃發(fā)酵[7]。Chen 等[8]研究表明，在哺乳期山羊日糧中添加亮氨酸可以提高糞便纖維降解菌的豐度等。色氨酸（Trp）及其代謝產(chǎn)物在抗應(yīng)激、動(dòng)物采食、免疫反應(yīng)和抗氧化等方面均發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，腸道內(nèi)的微生物也能夠有效地利用色氨酸進(jìn)行代謝，因此會(huì)出現(xiàn)色氨酸影響腸道微生物某些細(xì)菌豐度的情況。在實(shí)際應(yīng)用中，日糧缺乏色氨酸會(huì)引發(fā)腸道炎癥并改變腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)[9]。在斷奶仔豬飼糧中添加色氨酸可顯著提高腸道微生物的α多樣性和β多樣性，并且能降低腸道病原菌梭狀芽孢桿菌數(shù)量[10]。此外，色氨酸缺乏會(huì)降低SD 大鼠盲腸微生物多樣性，主要影響擬桿菌門物種（普雷沃氏菌等）的多樣性[11]。目前關(guān)于亮氨酸與色氨酸對(duì)犢牛直腸微生物影響的研究相對(duì)較少，因此本試驗(yàn)擬研究在低蛋白質(zhì)日糧中補(bǔ)充Leu 和Trp 對(duì)斷奶期犢牛直腸微生物的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2022 年6—8 月，在河北省邢臺(tái)市威縣君凱牧業(yè)有限公司開展。

1.2 開食料及氨基酸

試驗(yàn)動(dòng)物開食料原料由億如科技（北京）有限公司加工制作；Leu 和Trp（純度均為99%），購自北京亞禾營養(yǎng)高新技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)在君凱牧業(yè)有限公司進(jìn)行。選擇初生體重[（40±2） kg]相近、健康狀況良好的荷斯坦奶牛犢牛共75 頭，采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將犢牛按照初生體重隨機(jī)分為5個(gè)組，分別為HK組（飼喂22% CP水平開食料）、LK組（飼喂19% CP水平開食料）、L組（飼喂19% CP水平開食料+1.15% Leu）、T組（飼喂19% CP水平開食料+0.26% Trp）、LT組（飼喂19% CP水平開食料+1.15% Leu+0.26% Trp）。試驗(yàn)期共49 d，飼養(yǎng)全期犢牛在犢牛島飼喂，新生犢牛2 h內(nèi)飼喂4 L初乳，12 h內(nèi)額外再飼喂2 L。犢牛10日齡開始自由采食不同成分的開食料，自由采食燕麥干草，自由飲水。犢牛開食料組成及營養(yǎng)水平見表1。牛乳及干草營養(yǎng)水平見表2。

表1 犢牛開食料組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

表2 牛奶及干草營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

1.4 樣品采集

于犢牛59 日齡采集直腸糞便微生物樣本，各組分別隨機(jī)選擇8 頭犢牛，在犢牛排便15 min 內(nèi)，用一次性無菌手套采集2～3 g 糞便于凍存管（滅菌）中，即刻放入液氮罐里，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，待測。

1.5 指標(biāo)測定

糞便微生物由南京派森諾基因科技有限公司檢測，測定步驟及具體流程見表3。

表3 糞便微生物測定方法

1.6 數(shù)據(jù)整理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2017 軟件進(jìn)行整理與計(jì)算，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan’s 法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果用“平均值”和“標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 低蛋白日糧補(bǔ)充Leu和Trp對(duì)哺乳犢牛直腸細(xì)菌豐富度和多樣性的影響

如圖1 所示，犢牛59 日齡時(shí)，所有糞便樣品測序條趨近于40 000條時(shí)，Shannon指數(shù)趨近于飽和，且測序數(shù)量大于10 000條時(shí)稀釋曲線趨于平緩，說明測序數(shù)量和測序深度合理，可以反映各個(gè)糞便樣品中的微生物群落，能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖1 犢牛糞便微生物稀釋曲線

如圖2所示，犢牛59日齡，不同組犢牛共有分類操作單元（OTU）數(shù)量為641個(gè)。其中，HK組特有OTU數(shù)量為3 549 個(gè)，LK 組特有OTU 數(shù)量為2 514 個(gè)，L 組特有OTU數(shù)量為2 598個(gè)，T組特有OTU數(shù)量為2 572個(gè)，LT組的特有OTU數(shù)量為2 673個(gè)。

圖2 犢牛糞便微生物Venn圖

如圖3 所示，犢牛59 日齡時(shí)，犢牛糞便微生物經(jīng)主坐標(biāo)分析（PCoA），第一主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率為14.5%，第二主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率為8.4%，各組之間至少有三個(gè)樣品比較集中。說明群落組成相似，不同組間的距離也較近，不同組間的糞便微生物群落組成也較為相似。

圖3 犢?；赪eighted Unifrac距離PCoA分析

低蛋白日糧補(bǔ)充Leu 和Trp 對(duì)斷奶期犢牛的糞便微生物Alpha多樣性的影響見表4，犢牛59日齡時(shí)，各組 間Shannon、Simpson、Observed species、Chao1、Goods coverage和Pielou-e指數(shù)差異不顯著（P>0.05）。

表4 低蛋白日糧中補(bǔ)充Leu和Trp對(duì)犢牛糞便微生物Alpha多樣性影響

2.2 低蛋白日糧補(bǔ)充Leu和Trp對(duì)哺乳犢牛直腸微生物菌群相對(duì)豐度的影響

低蛋白日糧補(bǔ)充Leu 和Trp 對(duì)犢牛糞便微生物門水平上的影響見表5。犢牛59 日齡時(shí)，低蛋白日糧補(bǔ)充Leu和Trp對(duì)犢牛糞便微生物對(duì)門水平上前10個(gè)物種相對(duì)豐度無顯著影響（P>0.05）。

表5 低蛋白日糧中補(bǔ)充Leu和Trp對(duì)犢牛糞便微生物門水平的影響

低蛋白日糧補(bǔ)充Leu和Trp對(duì)犢牛糞便微生物屬水平上的影響見表6。犢牛59 日齡時(shí)，LK 組與HK 組相比，糞桿菌屬（Faecalibacterium）相對(duì)豐度顯著降低（P<0.05）；與LK組相比，L、T、LT組糞桿菌屬（Faecalibacterium）相對(duì)豐度提高，且L組顯著提高（P<0.05）。其他菌屬各組間相對(duì)豐度差異不顯著（P>0.05）。

表6 屬水平上TOP 10的物種相對(duì)豐度（%）

3 討論

3.1 低蛋白日糧補(bǔ)充Leu和Trp對(duì)哺乳犢牛直腸細(xì)菌豐富度和多樣性的影響

犢牛免疫系統(tǒng)進(jìn)化的一個(gè)主要驅(qū)動(dòng)力是保持腸道微生物群落的穩(wěn)態(tài)[17]。且眾多研究表明，腸道微生物對(duì)腸道黏膜系統(tǒng)和組織發(fā)育有重要作用[18]。腸道微生物的基因庫數(shù)量龐大，隨著Illumina 測序技術(shù)平臺(tái)的發(fā)展，用16S 高通量測序技術(shù)可以全面反映動(dòng)物機(jī)體腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)[19]。對(duì)哺乳犢牛糞便微生物OUT進(jìn)行分析，其中Chao1和Observed species 指數(shù)能夠反映樣品中菌種豐富度，Pielou-e 指數(shù)可以反映糞便中微生物均勻度，Goods coverage則反映測序深度[20]。本試驗(yàn)中，LK、L、T 組和LT 組Chao1 和Observed species 指 數(shù) 低 于HK 組。T 組Chao1 和Observed species指數(shù)均高于LK組，說明降低日糧蛋白質(zhì)水平補(bǔ)充Trp后，與LK組對(duì)比可以影響哺乳犢牛直腸菌種豐富度。本試驗(yàn)中，犢牛糞便微生物經(jīng)PCoA分析可以發(fā)現(xiàn)，各組微生物結(jié)構(gòu)差異較小，這說明降低日糧蛋白水質(zhì)水平且補(bǔ)充Leu 和Trp 未對(duì)犢牛腸道微生物結(jié)構(gòu)造成影響，也未對(duì)犢牛的生長發(fā)育造成不良影響。

3.2 低蛋白日糧補(bǔ)充Leu和Trp對(duì)哺乳犢牛糞便微生物豐度的影響

本試驗(yàn)直腸樣品的測序條數(shù)趨近于10 000條時(shí)，曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大。從門水平上看，哺乳動(dòng)物胃腸道中的兩大優(yōu)勢菌種為厚壁菌門和擬桿菌門[23]。擬桿菌門有利于機(jī)體吸收多糖和促進(jìn)蛋白質(zhì)合成[21-22]，厚壁菌門有利于機(jī)體中脂質(zhì)的沉積[24-25]。Durso 等[26]通過測序?qū)θ馀５奈概c腸道中細(xì)菌豐度進(jìn)行了分類比較，結(jié)果表明占優(yōu)勢的菌門為厚壁菌門和擬桿菌門。Oliveira 等[27]對(duì)健康牛腸道不同部位進(jìn)行采樣，并進(jìn)行了高通量測序，結(jié)果表明門水平上豐富度無顯著差異，豐度較大的菌門是厚壁菌門和擬桿菌門。本試驗(yàn)中，優(yōu)勢菌門也為厚壁菌門和擬桿菌門，占比為90.03%，犢牛糞便微生物在門水平上的相對(duì)豐度均差異不顯著，這可能是犢牛日齡變大，犢牛腸道微生物區(qū)系逐漸趨于穩(wěn)定。

在屬水平上，相對(duì)豐度較高的菌有糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）和擬普雷沃菌屬（Prevotella）。糞桿菌屬屬于厚壁菌門，是腸道中丁酸鹽的生產(chǎn)者，丁酸鹽可以調(diào)節(jié)機(jī)體抵抗外來病原體的入侵，增強(qiáng)腸道上皮屏障的完整性，降低動(dòng)物機(jī)體炎癥反應(yīng)[28-29]。本試驗(yàn)中，L、T組和LT組糞桿菌屬相對(duì)豐度高于LK組，且L 組顯著高于LK 組。這可能是支鏈氨基酸在分解代謝過程中經(jīng)氧化脫氨和脫羧產(chǎn)生異位酸(包括2-甲基丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸)共同作用于瘤胃微生物的結(jié)果[30]。研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌屬（Bacteroides）在哺乳期犢牛糞便中相對(duì)豐度較高，具有多種功能（如免疫調(diào)節(jié)和抗炎等作用）[31]。本試驗(yàn)中，擬桿菌屬是優(yōu)勢菌屬，各組間差異雖不顯著，但在低蛋白開食料中補(bǔ)充Leu 和Trp 組擬桿菌屬相對(duì)豐度高于LK 組，可以在一定程度上調(diào)節(jié)犢牛的免疫力，減少腹瀉的發(fā)生。普雷沃氏菌屬能夠降解淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、半纖維素等[32]，具有協(xié)助降解纖維的能力，本試驗(yàn)中，L、T、LT 組普雷沃氏菌屬相對(duì)豐度高于LK組，與HK組接近，說明在低蛋白日糧中添加Leu 和Trp 可加強(qiáng)瘤胃細(xì)菌對(duì)纖維的消化能力，提高纖維飼料的消化率，促進(jìn)瘤胃消化。擬普雷沃菌屬為普雷沃氏菌科中發(fā)酵產(chǎn)物主要為乙酸的菌屬[33]。張玉瑩等[34]研究表明，正常組犢牛糞便中檢測到了擬普雷沃氏菌屬的存在，而腹瀉組沒有發(fā)現(xiàn)。本試驗(yàn)中，擬普雷沃菌屬豐度較高，說明本試驗(yàn)中犢牛腸胃可能處于一個(gè)健康的環(huán)境。

4 結(jié)論

在低蛋白日糧中補(bǔ)充Leu 和Trp 對(duì)哺乳犢牛直腸微生物門屬水平豐度（除糞桿菌屬外）均無顯著差異，說明低蛋白日糧補(bǔ)充Leu 和Trp 對(duì)哺乳犢牛直腸微生物影響較小，但在低蛋白日糧中補(bǔ)充Leu 和Trp，哺乳犢牛直腸微生物門屬水平豐度可基本達(dá)到正常蛋白質(zhì)營養(yǎng)水平豐度。