幾種植物醇提物對(duì)血耳木霉病原菌抑菌試驗(yàn)

程 旭 隋 哲 田朋姣 劉興樂 楊 青 王文建 張 舒 王佐乾* 余海忠*

（1 襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北襄陽 441053；2 湖北文理學(xué)院，湖北襄陽 441053；3 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北武漢 430064）

食用菌產(chǎn)業(yè)已成為繼糧、油、果、菜后的第五大產(chǎn)業(yè)，是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)之一，已成為鄉(xiāng)村振興尤其是偏遠(yuǎn)山區(qū)農(nóng)民增收致富的重要途徑[1]。2021年全國(guó)食用菌總量達(dá)4 133.94萬t，總產(chǎn)值達(dá)3 475.63億元，中國(guó)食用菌占全球食用菌總產(chǎn)量的85%以上[2]。血耳（Tremella sanguinea）隸屬銀耳屬（Tremella），是一種珍稀食用菌，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，深受消費(fèi)者歡迎。目前血耳人工段木栽培的技術(shù)剛實(shí)現(xiàn)突破，產(chǎn)地主要集中在湖北省保康縣，2021年栽培總量約5萬棒段木，年產(chǎn)值約500萬元，并呈現(xiàn)逐年遞增的態(tài)勢(shì)，“保康血耳”也獲中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。

但是，目前血耳生產(chǎn)中出現(xiàn)的木霉病害，已成為制約其規(guī)?；a(chǎn)的主要因素之一。木霉病害是一種典型的競(jìng)爭(zhēng)性病害，會(huì)造成母種、原種、栽培種、段木菌棒、栽培袋的污染，常見的木霉病害至少有6種[3-4]。木霉（Trichodermasp.）可侵染平菇、茶樹菇、香菇、銀耳、杏鮑菇、毛木耳、靈芝等多種食用菌的培養(yǎng)料、菌絲和子實(shí)體，是食用菌生產(chǎn)中的第一大污染菌[5]。不同產(chǎn)地食用菌感染的木霉種類各有不同，其中綠色木霉與哈茨木霉是優(yōu)勢(shì)菌種。木霉侵染主要表現(xiàn)為產(chǎn)生綠色、青綠色或者黃綠色霉層，它不僅污染菌種和培養(yǎng)料，造成菌種或菌袋報(bào)廢，同時(shí)還可寄生在食用菌菌絲和子實(shí)體上引起寄生性病害[6]。據(jù)報(bào)道，由木霉造成的食用菌病害每年平均發(fā)病率為8%，食用菌損失率40%～50%，有時(shí)高達(dá)80%，甚至導(dǎo)致絕收[7]。

試驗(yàn)以血耳生產(chǎn)中最常見的綠色木霉（Trichoderma viride）為靶標(biāo)病原物，以鄂西北地區(qū)常見的四種植物60%乙醇提取物為供試藥液，考察其對(duì)為害血耳的木霉病害抑制效果，以期開發(fā)出綠色無公害的木霉病害專用植物源殺菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試植物：襄麥冬（L.spicatavar.prolifera）須根采自襄陽市歐廟鎮(zhèn)，魚腥草（H.cordata）、貓眼草（E.lunulata）、五香菜（H.moslae）全草，采自襄陽市臥龍鎮(zhèn)。按以下步驟對(duì)上述樣品進(jìn)行處理：自來水沖洗，蒸餾水潤(rùn)洗，晾干，65 ℃烘干后，150目粉碎，密封，置于4 ℃保存待用。

（2）供試菌株：綠色木霉（T.viride）菌株，從血耳段木上分離提純。

（3）耗材與設(shè)備：60%乙醇，葡萄糖，瓊脂粉，生理鹽水；FZ-102微型植物粉碎機(jī)；GZX-9030-MBE電熱恒溫干燥箱；YSQ-LS-30SII壓力蒸汽滅菌器；RE-52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；AL204電子天平；熱電微量移液器；KQ-100B型超聲波清洗器；HZ-9211K振蕩器；XB-K-25血細(xì)胞計(jì)數(shù)板；SA3000型顯微鏡。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初始藥液的配制

采用超聲波醇提法，提取供試植物醇提物：分別稱取粉碎物10 g左右，加入500 mL 60%乙醇浸泡24 h，再經(jīng)超聲波提取30 min，抽濾。濾渣分別用150 mL 60%乙醇浸泡48 h、72 h后，再經(jīng)超聲波各處理30 min，抽濾，合并三次濾液，減壓濃縮得浸膏，置4 ℃?zhèn)溆谩o菌條件下，將上述4種浸膏分別用60%乙醇配成初始體積質(zhì)量濃度為0.3 g/mL、0.15 g/mL、0.075 g/mL、0.035 g/mL、0.017 5 g/mL的初始藥液。

1.2.2 木霉菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定[8]

無菌條件下，用滅菌后的打孔器（直徑=7 mm）打出一定數(shù)量的綠色木霉菌餅，備用。PDA培養(yǎng)基滅菌后，晾至45 ℃左右取9 mL培養(yǎng)基，分別與1 mL上述初始藥液或60%乙醇（CK）混勻，然后倒平板，使得上述醇提物的藥液終濃度為0.03 g/mL、0.015 g/mL、0.007 5 g/mL、0.003 5 g/mL、0.001 75 g/mL。將綠色木霉菌餅分別放置在處理組和對(duì)照組平板上，菌絲一面向下，每皿接3餅，置于28 ℃培養(yǎng)。待對(duì)照組菌絲長(zhǎng)至平板一半長(zhǎng)度時(shí)，后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，分別計(jì)算藥液對(duì)菌落的生長(zhǎng)抑制率。

1.2.3 孢子懸浮液測(cè)定[9]

無菌條件，用生理鹽水沖洗長(zhǎng)滿綠色木霉孢子的平板，過濾，得孢子懸浮液。取6個(gè)裝有8 mL PDA液體培養(yǎng)基的錐形瓶，分別加入1 mL孢子懸浮液，再分別加入1 mL不同體積質(zhì)量濃度的初始藥液或60%乙醇（CK），使得上述醇提物的藥液終濃度達(dá)到0.03 g/mL、0.015 g/mL、0.007 5 g/mL、0.003 5 g/mL、0.001 75 g/mL，置28 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)。

對(duì)照組孢子萌發(fā)（孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子短半徑者為萌發(fā)）后，用無菌水稀釋到適當(dāng)倍數(shù)（10×10低倍鏡下，每個(gè)視野30～40個(gè)孢子為宜）[10]，移至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在10×10倍顯微鏡下觀測(cè)，計(jì)算藥液對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率：

孢子萌發(fā)抑制率（%）=（對(duì)照萌發(fā)數(shù)-處理萌發(fā)數(shù)）/對(duì)照萌發(fā)數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理供試綠色木霉菌株的生長(zhǎng)菌絲情況

由圖1可知，總體上，雖然襄麥冬醇提物對(duì)試驗(yàn)綠色木霉菌株菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制作用，但抑制效果有限：在觀察的前22 h內(nèi)，處理組菌落直徑增長(zhǎng)基本上同對(duì)照組（CK），尤其是在菌絲培養(yǎng)14～18 h的菌落直徑基本呈線性增長(zhǎng)。此外，在菌絲培養(yǎng)18～22 h，處理組菌落的增長(zhǎng)速度呈前期突然升高（曲線斜率突然增大）而后期降低的趨勢(shì)。分析其可能的原因?yàn)橄妍湺继嵛镏械囊恍┗钚猿煞直痪G色木霉代謝后將其利用，起到營(yíng)養(yǎng)增效作用。因此出現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)加速現(xiàn)象，但是后階段由于培養(yǎng)基的水分、營(yíng)養(yǎng)等物質(zhì)逐漸被消耗掉，所以菌落增長(zhǎng)變緩。

圖1 襄麥冬醇提物作用下綠色木霉菌株的菌落增長(zhǎng)情況

由圖2可知，魚腥草醇提物對(duì)供試綠色木霉菌株的抑制活性較強(qiáng)，對(duì)照組的菌落增長(zhǎng)速度較處理組的要快，且不同體積質(zhì)量濃度藥液對(duì)綠色木霉的抑制作用差異較大。同襄麥冬醇提物處理一樣，在綠色木霉菌絲培養(yǎng)20 h之后，無論是處理組還是對(duì)照組，由于培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，菌落增長(zhǎng)速度均開始變緩。

圖2 魚腥草醇提物作用下綠色木霉菌株的菌落增長(zhǎng)情況

由圖3可知，總體上，貓眼草醇提物處理組的綠色木霉菌落的增長(zhǎng)速度，比襄麥冬醇提物處理組慢，但是比魚腥草醇提物處理的菌落增長(zhǎng)快，這反映了其對(duì)供試綠色木霉菌株的菌絲生長(zhǎng)抑制活性介于襄麥冬醇提物與魚腥草醇提物之間。同樣，在綠色木霉菌絲培養(yǎng)14 h～18 h內(nèi)，其菌落基本屬于線性增長(zhǎng)，在20 h以后菌落增長(zhǎng)速度變緩。

圖3 貓眼草醇提物作用下綠色木霉菌株的菌落增長(zhǎng)情況

由圖4可知，雖然五香菜醇提物對(duì)供試綠色木霉菌株菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制，但是抑制作用不顯著，在菌絲培養(yǎng)前20 h內(nèi)，菌落的直徑增長(zhǎng)速度較快，基本上屬于線性增長(zhǎng)。

圖4 五香菜醇提物作用下綠色木霉菌株的菌落增長(zhǎng)情況

2.2 不同植物醇提物對(duì)供試綠色木霉菌株的菌絲生長(zhǎng)抑制活性比較

真菌菌絲在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)與時(shí)間變化是非線性的，分析所用數(shù)據(jù)最好選擇線性生長(zhǎng)階段采集的數(shù)據(jù)[11]。由于供試綠色木霉菌株在培養(yǎng)14～18 h內(nèi)菌絲生長(zhǎng)速度比較平穩(wěn)，再考慮到其營(yíng)養(yǎng)狀況（每個(gè)平板只含有9 mL的PDA培養(yǎng)基，隨觀測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)菌株?duì)I養(yǎng)不良老化現(xiàn)象），以及供試藥液的藥效活性隨觀測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)，可能存在熱分解、光分解現(xiàn)象[12-13]。因此，在統(tǒng)計(jì)不同植物醇提物平均抑制率時(shí)，只采用培養(yǎng)18～20 h的數(shù)據(jù)。

由表1可知，當(dāng)醇提物體積質(zhì)量濃度不低于0.015 g/mL時(shí)，魚腥草、貓眼草醇提物對(duì)供試綠色木霉菌株的菌絲生長(zhǎng)抑制率均超過30%，且在最高體積質(zhì)量濃度0.03 g/mL時(shí)分別達(dá)47.23%、35.97%。襄麥冬和五香菜醇提物對(duì)供試綠色木霉菌株的菌絲生長(zhǎng)抑制活性較弱，在最高體積質(zhì)量濃度0.03 g/mL時(shí)僅為23.89%、23.12%。

表1 不同植物醇提取對(duì)綠色木霉菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用比較

2.3 不同植物醇提物對(duì)供試綠色木霉菌株的孢子萌發(fā)抑制活性比較

由表2可知，不同植物醇提物對(duì)供試綠色木霉菌株孢子萌發(fā)的抑制作用均隨藥液體積質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。在最高體積質(zhì)量濃度0.03 g/mL時(shí)，4種植物醇提取物的抑制活性均超過54%，其中魚腥草的抑制率最高，為78.57%，貓眼草次之，為72.89%，五香菜、襄麥冬的抑制率分別為59.70%、54.07%。在最低體積質(zhì)量濃度為0.001 75 g/mL時(shí)，魚腥草、貓眼草對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率仍超過20%?？傮w上，4種植物醇提物對(duì)供試綠色木霉菌株的孢子萌發(fā)抑制活性，與其對(duì)應(yīng)的菌絲生長(zhǎng)抑制活性的結(jié)果相一致。

表2 不同植物醇提取對(duì)綠色木霉菌株的孢子萌發(fā)抑制作用比較

3 小結(jié)

襄麥冬、魚腥草、貓眼草和五香菜均為鄂西北地區(qū)常見植物種。有報(bào)道稱襄麥冬提取物對(duì)灰葡萄孢菌、終極腐霉、立枯絲核菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有較好的抑制作用[14]。此外，研究也發(fā)現(xiàn)魚腥草癸酰（Decanoylacetaldehyde）[15]、貓眼草七葉內(nèi)酯（Aesculetin）及貓眼草素（Maoyancaosu）[16]以及五香菜揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗菌活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，無論是襄麥冬、魚腥草、貓眼草還是五香菜，其醇提物對(duì)供試綠色木霉菌株的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均具有一定的抑制作用，且抑制活性與醇提物的體積質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，均隨藥液濃度的升高而增強(qiáng)。魚腥草、貓眼草的抑制作用最強(qiáng)，在最高體積質(zhì)量濃度（0.03 g/mL），對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率分別達(dá)47.23%、35.97%，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)78.57%、72.89%。整體來看襄麥冬醇提物對(duì)供試菌株的抑制活性最弱，在最高體積質(zhì)量濃度（0.03 g/mL）對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率僅為23.89%，對(duì)孢子抑制率為54.07%，顯著低于其他處理組。