徐 峰,姚 快,曲瑞雪,牟莎莎,鄧舒元,孫珊珊*,佘躍惠,王正良

(1.江漢油田石油工程技術研究院,湖北 武漢 430000;2.非常規(guī)油氣省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 武漢 430100;3.油氣鉆采工程湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430100;4.長江大學石油工程學院,湖北 武漢 430100;5.中國地質大學(北京)能源學院,北京 100083;6.長江大學化學與環(huán)境工程學院,湖北 荊州 434000)

稠油是世界原油資源的重要組成部分,與輕質原油相比,其黏度高、流動性差、開采難度較大[1]。江漢油田普通稠油油藏大多屬難動用儲量,難以實現(xiàn)經濟有效的開發(fā)。微生物提高原油采收率(microbial enhanced oil recovery,MEOR)技術是一種環(huán)境友好、成本較低、高效、可持續(xù)作用的方法[2]。油藏是一個寡營養(yǎng)的極端環(huán)境,通過向油藏中注入碳源、氮源及磷源等有機或無機營養(yǎng)物質來激活某些內源采油功能菌[3-4],利用內源微生物的繁殖產生代謝物(如小分子有機酸、氣體、生物表面活性劑、生物聚合物等),達到乳化原油、降解原油組分、改變儲層物性等目的,進而提高采收率[5-6]。由于油藏微生物的種類繁多,針對性激活內源采油功能菌、維持微生物高效可持續(xù)作用原油是MEOR技術的關鍵。目前,針對稠油油藏的微生物生態(tài)學研究是解決該關鍵問題的基礎。鑒于此,作者通過二代測序技術對江漢油田稠油油藏4個中高溫高礦化度區(qū)塊采出液中的細菌和古菌群落多樣性進行研究,為后續(xù)激活中高溫油藏內源微生物提高原油采收率技術的發(fā)展和應用提供理論支撐。

1 實驗

1.1 材料

采出液取自江漢油田的4個中高溫區(qū)塊,分別標記為H2-12、Z-2X、YP-9、W-1X;其中,H2-12和Z-2X取自60～70 ℃油藏,YP-9和W-1X取自50 ℃油藏。將采出液樣品放入?yún)捬跗恐?置于實驗室-4 ℃冰箱中冷藏保存,防止與空氣接觸。

1.2 方法

1.2.1 采出液的離子組成分析

1.2.2 DNA提取與檢測

用無菌磷酸緩沖液沖洗樣品(去除采出液中的原油組分),抽濾,收集樣品中的菌體,提取 DNA,采用瓊脂糖凝膠電泳對其中細菌和古菌的群落組成進行檢測。檢測后樣品置于-20 ℃下保存[8],進行后續(xù)分析。

1.2.3 PCR 擴增[9]

采用引物對 338F、806R對細菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)進行PCR擴增;采用引物對519F(5′-CAGCCGCCGCGGTAA-3′)、915R(5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′)對古菌16S rRNA基因V4-V5區(qū)進行PCR擴增。PCR體系為:Q5 high-fidelity DNA polymerase 0.25 μL,5×Reaction Buffer 5 μL,dNTP(10 mmol·L-1)2 μL,模板 DNA 2 μL,正向引物(10 μmol·L-1)1 μL,反向引物(10 μmol·L-1)1 μL,水 8.75 μL。擴增程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸10 min,保持4 ℃,30個循環(huán)。前引物中的barcode是7個堿基的寡核苷酸序列,用來區(qū)分同一文庫中的不同樣品。PCR 采用 NEB Q5 DNA 高保真聚合酶,用 2%瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳;切取目的片段,并用 Axygen 凝膠回收試劑盒回收。

在Microplate Reader(BioTek,FLx800)上利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對PCR產物進行定量,然后將每個樣品按照其所需的數(shù)量進行混合。

1.2.4 文庫構建

利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構建文庫。首先利用試劑盒中的EndRepair Mix2將DNA 5′端突出的堿基切除,然后將3′端缺失的堿基補齊,同時在5′端加上1個磷酸基團,進行末端修復。

2 結果與討論

2.1 采出液的離子組成

4種樣品的離子組成如表1所示。

表1 4種樣品的離子組成/(mg·L-1)

2.2 細菌群落組成分析

2.2.1 物種分類學注釋

采用QIIME2的classify-sklearn算法[10](https://github.com/QIIME2/q2-feature-classifier),具體步驟如下:對于每個ASV(擴散序列變異)的特征序列或每個OTU(操作分類單元)的代表序列,在QIIME2軟件中使用默認參數(shù),使用預先訓練好的Naive Bayes分類器進行物種注釋,即與參考序列數(shù)據(jù)庫進行比對,根據(jù)比對結果進行打分判定。通過16S rDNA測序,對4種樣品中的細菌進行分類學統(tǒng)計及多樣性揭示,物種分類學注釋結果如圖1所示。

圖1 4種樣品中細菌的分類學注釋Fig.1 Taxonomic notes on bacteria in four samples

從圖1可知,H2-12樣品中細菌種類最多,其次是W-1X樣品,Z-2X樣品中細菌種類最少,不足H2-12樣品中的一半。

2.2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指在一個生態(tài)系統(tǒng)內或者特定區(qū)域內反映物種豐度和均勻度的綜合指標[11]。4種樣品中細菌的稀疏曲線如圖 2 所示。

從圖2可知,隨著測序深度的增加,4種樣品中細菌群落的ASV/OTU總數(shù)均先增加后逐漸趨于穩(wěn)定,說明測序深度合適、取樣合理。4種樣品中細菌群落的Alpha 多樣性指數(shù)如表2所示。

圖2 4種樣品中細菌的稀疏曲線Fig.2 Sparse curves of bacteria in four samples

表2 4種樣品中細菌群落的Alpha多樣性指數(shù)

Chao1和Observed species指數(shù)表征豐度,Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性[12]。從表2可知,H2-12樣品的Chao1、Shannon和Observed species指數(shù)均最高,分別為655.106、5.510 76和652.1,其Simpson指數(shù)為 0.927 947,僅次于YP-9樣品的Simpson指數(shù)(0.938 390),表明H2-12樣品的物種豐度和多樣性均最高;Z-2X樣品的Chao1、Shannon和Observed species指數(shù)均最低,表明Z-2X樣品的物種豐度和多樣性均最低,這與物種分類學注釋結果一致。

2.2.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性聚類分析多采用層次聚類(hierarchical clustering)法,以等級樹的形式展示樣本間的相似度,通過聚類樹的分枝長度衡量聚類效果。聚類分析可以采用任何距離評價樣本之間的相似度。 4種樣品中細菌群落在屬水平上的層次聚類分析結果如圖 3所示。

從圖3可知,YP-9和H2-12樣品的距離最近,且同為一支,說明YP-9和H2-12樣品中細菌的微生物群落最為相似;W-1X 樣品屬于單獨一支,離其它樣品較遠,說明W-1X樣品與其它樣品中細菌的微生物群落差距較大。

圖 3 4種樣品中細菌群落在屬水平上的層次聚類分析Fig.3 Hierarchical clustering analysis of bacterial communities in four samples at genus level

2.2.4 物種組成分析

高通量測試結果通過BLAST比對后,將4種樣品的細菌群落組成在門水平和屬水平上進行分類統(tǒng)計,結果如圖4所示。

圖 4 4種樣品在門水平(a)和屬水平(b)的細菌群落組成Fig.4 Bacterial community composition of four samples at phylum level(a) and genus level(b)

從圖4a可知,在門水平上,Proteobacteria在4種樣品中占有絕對優(yōu)勢,占比在53%～96%之間。研究[13-14]發(fā)現(xiàn),Proteobacteria在自然水體、人工水體中均占比較大,在污水處理及氮磷形態(tài)轉換方面具有十分重要的作用 。H2-12 和 Z-2X 樣品中還有較多的Firmicutes(33%、42%)。

從圖4b可知,在屬水平上,4種樣品的細菌群落主要由Pseudomonas(9%～47%)、Thauera(0%～52%)、Halobacillus(0%～27%)、Marinobacter(0%～30%)、Acinetobacter(1%～12%)、Hydrogenophilus(0%～13%)、Rehaibacterium(0%～10%)、Oligoflexus(0%～4%)、Tepidiphilus(0%～5%)和Methylobacterium(0%～4%)組成。

其中,H2-12和YP-9樣品中細菌的優(yōu)勢菌群為Pseudomonas(29%、47%)、Halobacillus(27%、8%)和Acinetobacter(12%、7%)。Pseudomonas是革蘭氏陰性好氧棒狀細菌,能從大多數(shù)環(huán)境中分離出來,可產鼠李糖脂型表面活性劑,具有降解石油烴、驅油、修復烴類污染、降黏等作用。馬鑫等[15]研究發(fā)現(xiàn),Pseudomonasaeruginosa發(fā)酵液在模擬實驗中的驅油率較水驅提高了33.5%。Halobacillus屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae),分離自鹽湖、鹽土、海洋太陽能鹽場等高鹽環(huán)境中,屬嗜鹽菌。Halobacillusspp.在石油烴類化合物的生物降解中具有重要作用[16]。Acinetobacter具有代謝多樣性,能降解己內酰胺、除草劑、有機磷農藥和多種石油烴組分等,可產鼠李糖脂型表面活性劑,也可進行反硝化和氨氧化作用。

W-1X樣品中細菌的優(yōu)勢菌群為Thauera(52%)、Hydrogenophilus(13%)和Rehaibacterium(10%)。Thauera屬于脫氮菌,在反硝化系統(tǒng)運行 51 d以上時,Thauera的相對豐度在 60%以上[17-18]。

Z-2X樣品中細菌的優(yōu)勢菌群為Pseudomonas(13%)和Marinobacter(30%)。Marinobacter是目前國外報道較多的一類能夠耐高鹽環(huán)境的反硝化微生物,具有潛在的工業(yè)應用價值[19-21]。

2.2.5 代謝通路分析

微生物生態(tài)學研究也需要關注菌群所具備的功能潛能,了解檢測樣本中菌群功能潛能的概況,能最大化擴增子測序性價比高的優(yōu)勢,此外,分析結果或許還能幫助指導后續(xù)實驗的設計(如宏基因組測序)。獲得的功能單元可以依據(jù)代謝通路數(shù)據(jù)庫和一定的計算方法獲得代謝通路的豐度。4種樣品中的細菌代謝通路主要分為生物合成、降解/利用/同化、脫毒、前體代謝物和能量的產生、聚糖途徑、高分子修飾和代謝簇。通過對4種樣品中細菌群落的代謝通路分析可知,生物合成中豐度最高的是輔因子、輔基、電子載體、維生素生物合成和氨基酸生物合成;降解/利用/同化中豐度最高的是芳香族化合物降解、碳水化合物降解及核苷和核苷酸降解;前體代謝物和能量的產生中豐度最高的是TCA循環(huán)和發(fā)酵作用。

2.3 古菌群落組成分析

2.3.1 物種分類學注釋

通過16S rDNA測序,對4種樣品中的古菌進行分類學統(tǒng)計及多樣性揭示,物種分類學注釋結果如圖5所示。

圖5 4種樣品中古菌的分類學注釋Fig.5 Taxonomic notes on archaea in four samples

從圖5可知,H2-12樣品中古菌種類最多,這與細菌的物種分類學注釋結果一致,其次是YP-9樣品,W-1X樣品中古菌種類最少。4種樣品中古菌種類均高于細菌種類,表明樣品中古菌種類很豐富。

2.3.2 Alpha多樣性分析

4種樣品中古菌的稀疏曲線如圖6所示。

圖6 4種樣品中古菌的稀疏曲線Fig.6 Sparse curve of archaea in four samples

從圖6可知,隨著測序深度的增加,4種樣品中古菌群落的ASV/OTU總數(shù)均先增加后逐漸趨于穩(wěn)定,說明測序深度合適,取樣數(shù)量合理,取樣數(shù)量更多只會產生少量新的OTU。

4種樣品中古菌群落的Alpha多樣性指數(shù)如表3所示。

表3 4種樣品中古菌群落的Alpha 多樣性指數(shù)

從表3可知,H2-12樣品的物種豐度最高,Chao1和Observed species指數(shù)分別為823.511和761.7,這與物種分類學注釋結果一致;YP-9樣品的物種多樣性最高,Shannon和Simpson指數(shù)分別為5.127 64和0.917 360;W-1X樣品的物種豐度和多樣性均最低。根據(jù)Chao1和Observed species指數(shù)可知,4種樣品中古菌群落的豐度均高于細菌群落。

2.3.3 Beta多樣性分析

4種樣品中古菌群落在屬水平上的層次聚類分析結果如圖7所示。

圖7 4種樣品中古菌群落在屬水平上的層次聚類分析Fig.7 Hierarchical clustering analysis of archaea communities in four samples at genus level

從圖7可知,Z-2X和H2-12樣品的距離最近,且同為一支,說明Z-2X和H2-12樣品中古菌的微生物群落最為相似;W-1X樣品屬于單獨一支,離其它樣品較遠,說明W-1X 樣品與其它樣品中古菌的微生物群落差距較大。

2.3.4 物種組成分析

4種樣品在門水平和屬水平的古菌群落組成如圖8所示。

圖8 4種樣品在門水平(a)和屬水平(b)的古菌群落組成Fig.8 Archaea community composition of four samples at phylum level(a) and genus level(b)

從圖8a可知,在門水平上,4種樣品的古菌群落主要以Euryarchaeota(29%～96%)為主;此外,H2-12樣品中的優(yōu)勢菌門還有Crenarchaeota(11%),Z-2X樣品中的優(yōu)勢菌門還有Thaumarchaeota(5%)。

從圖8b可知,在屬水平上,4種樣品的古菌群落主要由Halogeometricum(0%～69%)、Methanobacterium(0%～36%)、Methanothermobacter(0%～22%)、Salinarchaeum(0%～17%)、Halogranum(0%～9%)、Nitrososphaeraceae(0%～5%)、Methanohalophilus(0%～5%)、Methanohalobium(0%～4%)、Halodesulfurarchaeum(0%～1%)和Halapricum(0%～1%)組成。

W-1X樣品中古菌的優(yōu)勢菌群主要為Salinarchaeum(17%)、Halodesulfurarchaeum(1%)和Halapricum(1%)。Salinarchaeum和Halapricum均為嗜鹽菌屬,能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,是一種較強的SRB抑制劑。Halapricum由革蘭氏染色陰性的球狀或卵球形多形性細胞組成,在含2.5～5.1 mol·L-1NaCl的培養(yǎng)基中生長,最適生長溫度為37 ℃。Halodesulfurarchaeum隸屬于嗜鹽菌綱,由專性厭氧、極端嗜鹽的廣古菌門組成,以單質硫、二甲基亞砜或硫代硫酸鹽為電子受體,通過 H2或甲酸氧化生長。

2.3.5 代謝通路分析

通過對4種樣品中古菌群落的代謝通路分析可知,生物合成中豐度最高的是核苷和核苷酸生物合成,其次是氨基酸生物合成;降解/利用/同化中豐度最高的是C1化合物利用與同化;前體代謝物和能量的產生中豐度最高的是TCA循環(huán)和發(fā)酵作用,這與細菌群落中的前體代謝物和能量的產生豐度是一致的。

3 結論

利用二代測序技術對江漢油田普通稠油油藏的4個采出液樣品中的細菌和古菌群落組成進行了多樣性分析。物種分類學注釋結果表明,H2-12樣品中的微生物種類最多,4種樣品中古菌種類均高于細菌種類,表明樣品中古菌種類很豐富。Alpha多樣性分析結果表明,4種樣品中古菌群落的豐度均高于細菌群落。在門水平上,細菌群落主要以Proteobacteria(53%～96%)為主;古菌群落主要以Euryarchaeota(29%～96%)為主。在屬水平上,細菌的優(yōu)勢菌群主要為Pseudomonas(9%～47%)、Thauera(0%～52%)、Halobacillus(0%～27%)和Marinobacter(0%～30%);古菌的優(yōu)勢菌群主要為Halogeometricum、Methanobacterium和Methanothermobacter。細菌群落組成分析可知,4種樣品中的內源微生物群落均具有降黏和脫氮的性能,表明江漢油田內源微生物具有降黏和脫氮的巨大潛力,可通過不同培養(yǎng)基富集篩選高效的降黏和脫氮菌株,進而大大提高江漢油田的原油采收率。