孫宣鋒，曹慧霞，焦曉靜，張麗娜，閻 磊，邵鳳民

(鄭州大學人民醫(yī)院腎內科/河南省腎臟病免疫重點實驗室,河南 鄭州 450003)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是指由糖尿病所導致的慢性腎臟疾病,是糖尿病重要的并發(fā)癥之一[1]。國際糖尿病聯盟的最新統(tǒng)計數據顯示,2021年全球約5.37億人(20～79歲)患有糖尿病,并且有多達30%～50%的糖尿病患者合并DN[2-3]。DN不僅是糖尿病的重要并發(fā)癥,也是全球終末期腎病最常見的病因[4]。因此,明確DN的發(fā)病機制并采取有效防治措施來延緩病情進展成為當前研究的熱點。DN的發(fā)病機制比較復雜,近期研究發(fā)現,上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在DN發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著不可或缺的作用[5-6],而與糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)相關的EMT在DN發(fā)病過程中的作用尤為重要[7]。本文就GSK-3β通過EMT參與DN發(fā)生發(fā)展的研究進展進行綜述,以期為DN的臨床治療提供參考。

1 GSK-3β

1.1 GSK-3β概述

GSK-3β是一種涉及多個細胞信號轉導通路的絲/蘇氨酸激酶,廣泛存在于各種組織和細胞中[8]。GSK-3β生物學功能復雜,可通過控制糖原的合成來調節(jié)糖原的代謝,并通過影響線粒體的通透性和細胞色素C的釋放來調節(jié)細胞凋亡[9],還在炎癥、免疫調節(jié)、胚胎發(fā)生及組織損傷、修復和再生等生物學過程中發(fā)揮作用[10]。GSK-3β有2個磷酸化位點,分別為Ser9和Thr216。Ser9位點磷酸化可使GSK-3β 活性降低,相反,Thr216位點磷酸化可使GSK-3β 活性升高[11]。由磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)信號轉導激活的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)磷酸化GSK-3β的Ser9位點并抑制GSK-3β的活性,而蛋白磷酸酶2A在Ser9位點可使GSK-3β去磷酸化[12]。GSK-3β的Tyr216位點的酪氨酸磷酸化受鈣依賴性酪氨酸激酶、富含脯氨酸的酪氨酸激酶 2、環(huán)磷酸腺苷激活的蛋白酪氨酸激酶、Zaphod激酶1等的調節(jié)[13]。

1.2 GSK-3β在EMT中的作用

有研究報道,腎纖維化在DN的進展中起重要作用,轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、細胞外因子等作為關鍵的調節(jié)分子參與腎纖維化過程[14-15]。EMT是在生理或病理條件下上皮細胞發(fā)生表型轉變的一種生物學現象[16-17]。細胞在受到高糖誘導時失去原有特征,上皮細胞鈣黏蛋白、緊密連接蛋白及裂隙素等上皮細胞樣分子標志物表達下調,α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、鐵死亡抑制蛋白-1(ferroptosis suppressor protein-1,FSP-1)、基質金屬蛋白酶-9等間充質細胞樣分子標志物表達上調[18]。WAN等[19]在GSK-3β 抑制劑延遲2型糖尿病 db/db小鼠腎臟和足細胞EMT的研究中發(fā)現,高糖可上調足細胞和腎皮質中GSK-3β的活性,(2′Z,3′E)-6-溴茚紅素-3 ′-肟[(2′Z,3′E)-6-bromoindirubin-3′-oxime,BIO)]可下調GSK-3β的活性;高糖可降低上皮標志物裂隙素的表達,BIO可增加上皮標志物的表達,進而導致間充質標志物(如α-SMA和纖連蛋白)表達水平降低;隨著EMT在db/db小鼠腎組織中的發(fā)展,總GSK-3β和第216位酪氨酸位點磷酸化的GSK-3β的表達水平以及GSK-3β的活性均增加,而第9位絲氨酸位點磷酸化的GSK-3β活性下降。因此,推測GSK-3β的激活在EMT中起重要作用,抑制GSK-3β的活性可能會延緩EMT的發(fā)展。

2 GSK-3β參與EMT影響DN發(fā)生發(fā)展的機制

2.1 EMT在DN發(fā)生發(fā)展中的作用

EMT被認為是DN中足細胞損傷的主要原因,且腎小球足細胞對腎小球濾過屏障發(fā)揮正常功能至關重要,足細胞損傷或丟失會導致DN的進展[20]。在高糖刺激下足細胞表型會發(fā)生改變,間充質標志物表達增多,上皮標志物表達減少,導致足細胞脫離或功能障礙,最終導致腎小球濾過功能障礙。TU等[21]研究發(fā)現,姜黃素可通過上調DN大鼠和小鼠足細胞克隆-5細胞中鈣黏蛋白水平,并下調波形蛋白和扭曲蛋白水平來預防DN中足細胞的EMT、蛋白尿和腎損傷。LIU等[22]在體內試驗中使用鏈脲佐菌素在CD-1小鼠中誘發(fā)糖尿病,并通過腹腔注射牛血清白蛋白來加速小鼠腎纖維化,結果發(fā)現,應用重組丙酮酸激酶同工酶M2激活劑TEPP-46抑制EMT可減輕小鼠腎纖維化;在體外實驗中,TEPP-46可抑制由TGF-β1和(或)高葡萄糖培養(yǎng)誘導的EMT,恢復腎小管表型,減輕糖尿病小鼠腎臟纖維化。因此,EMT可能是促進DN進展的潛在途徑。

2.2 GSK-3β通過參與EMT過程影響DN進展

GSK-3β通過參與相關信號轉導通路調控腎臟細胞發(fā)生EMT,改變上皮細胞樣分子標志物和間充質細胞樣分子標志物的表達,造成細胞損傷,影響DN的進展[23]。GSK-3β主要通過介導TGF-β/Smad蛋白(TGF-β/Smad)、Wnt/β聯環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)、整合素/免疫淋巴因子(integrins/immune lymphokines,integrins/ILK)等多個信號轉導通路參與EMT。

2.2.1 GSK-3β通過TGF-β/Smad信號轉導通路 參與EMT

TGF-β/Smad轉導通路作為經典通路,在高糖誘導下參與一系列復雜的機制,引起腎臟上皮細胞發(fā)生EMT[24]。TGF-β與TGF-β Ⅰ型受體和TGF-β Ⅱ型受體形成配體受體復合物,同時,TGF-β Ⅰ型受體在細胞質區(qū)域被磷酸化,導致其下游Smad2和Smad3被磷酸化和激活。磷酸化的Smad2、Smad3與Smad4在細胞質結合形成Smad復合體并發(fā)生核易位[25-26]。Smad復合物進入細胞核后,與基因啟動子區(qū)EMT相關的Smad結合元件整合,發(fā)揮調控作用,進一步影響DN的發(fā)生發(fā)展[27]。有報道指出,GSK-3β參與TGF-β/Smad信號通路的調控,在TGF-β的刺激下,GSK-3β磷酸化Smad1或Smad3,磷酸化后的Smad3與Smad4結合形成 Smad復合物,整合EMT相關的Smad結合元件,調節(jié)DN的發(fā)生發(fā)展[28]。CHEN等[29]用TGF-β1處理小鼠腎小管上皮細胞,結果發(fā)現,細胞中GSK-3β的表達量增加,且鵝卵石樣立方形的腎小管上皮細胞轉化為梭形間充質細胞;該研究還發(fā)現,高選擇性非三磷腺苷競爭性小分子抑制劑4-芐基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮或鋰鹽等GSK-3β抑制劑可減輕TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞形態(tài)學變化;這表明,GSK-3β抑制劑可通過調節(jié)TGF-β1/Smad 信號通路活性驅動腎小管上皮細胞分子變化。趙凱等[30]研究發(fā)現,GSK-3β特異性抑制劑氯化鋰可增加腎小管近端上皮細胞中GSK-3β的Ser9位點磷酸化,抑制GSK-3β過表達,降低TGF-β1誘導的Smad3磷酸化,進而影響Smad復合物進入細胞核調節(jié)基因轉錄,干擾EMT相關DN的進展過程。 除此之外,GSK-3β還參與TGF-β介導的Smad非依賴性通路。TGF-β磷酸化GSK-3β特定絲氨酸殘基可導致其失活,進而誘導snail家族轉錄抑制因子1(snail family transcriptional repressor 1,Snail1)在細胞核中積累,而Snail1積累可導致其相應基因的表達顯著升高,隨之其轉錄效應顯著增加,最終腎臟間充質細胞特異性蛋白(如α-SMA)的表達量增加,促進EMT發(fā)生[31]。KANLAYA等[32]研究指出,具有抗纖維化特性的兒茶素可通過GSK-3β/β-catenin/Snail1通路減弱腎小管細胞中TGF-β1誘導的EMT。 因此,GSK-3β很可能是通過TGF-β/Smad信號通路介導EMT來影響DN的發(fā)生發(fā)展,但具體機制還有待進一步研究。

2.2.2 GSK-3β通過介導Wnt/β-catenin信號轉導通路參與EMT

Wnt/β-catenin信號通路是生物體內必不可少的信號通路,在DN患者發(fā)生EMT過程中發(fā)揮關鍵作用[33]。β-catenin是Wnt信號轉導不可或缺的轉錄共激活因子,在無Wnt信號因子的刺激下,β-catenin在細胞質中受到由支架蛋白、酪蛋白激酶1和GSK-3β組成的支架蛋白復合體的抑制,其中GSK-3β可導致β-catenin氨基末端磷酸化和失活。GSK-3β通過與β-catenin的絲氨酸和蘇氨酸位點靶向結合使β-catenin磷酸化,磷酸化的β-catenin可被識別并由泛素介導的蛋白酶體降解,從而無法進行核易位以到達靶基因而發(fā)揮作用[34]。當高糖誘導或各種細胞間刺激因子激活Wnt信號通路時,Wnt配體可與跨膜蛋白Frizzled (FZD)受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(low density lipoprotein receptor-associated protein 5/6,LRP5/6)結合激活Wnt信號通路,隨之Wnt-FZD-LRP5/6復合物被散亂蛋白磷酸化并激活,激活的Wnt-FZD-LRP5/6復合物靶向調控支架蛋白復合物,導致GSK-3β磷酸化和β-catenin去磷酸化,從而導致β-catenin在細胞質溶膠中積累[35]。隨后,積累的β-catenin被轉移到細胞核,并通過T淋巴細胞因子/淋巴增強因子激活Wnt靶基因[33]。Wnt靶基因表達產物在體內通過參與多種生理機制引起腎臟細胞發(fā)生EMT,進而導致DN的進展[36]。

GSK-3β通過Wnt/β-catenin通路在腎臟細胞EMT的發(fā)生與進展中發(fā)揮重要的作用。CHANG等[37]研究發(fā)現,雷公藤處理后的糖尿病大鼠腎組織中Wnt-1、β-catenin及磷酸化GSK-3β的蛋白表達水平顯著降低,GSK-3β的Tyr216位點磷酸化并使GSK-3β的活性受到抑制,進而改善了糖尿病誘導的大鼠腎臟功能障礙和結構損傷。LEE等[38]在研究高糖誘導的EMT功能障礙與腎近端小管細胞中的GSK-3β、Snail1和β-catenin關系中指出,高糖和氯化鋰可阻斷Snail1和β-catenin活化,高糖可通過GSK-3β、Snail和β-catenin 誘導EMT。有研究表明,GSK-3β在Wnt/β-catenin信號通路中與TGF-β也存在一定的聯系,GSK-3β抑制劑和Wnt信號通路的激活可減弱腎小球間充質細胞中TGF-β1介導的細胞外基質積累,進而影響EMT過程[39]。相反,TGF-β 可以通過抑制GSK-3β對β-catenin和Wnt信號轉導通路的激活來影響 EMT相關的DN過程[40]。

綜上,GSK-3β可能通過Wnt/β-catenin信號通路影響EMT的發(fā)生發(fā)展,從而影響DN的進展。

2.2.3 GSK-3β通過介導integrins/ILK信號轉導通路參與EMT

ILK是一種細胞內絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其與β-catenin相互作用參與細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖和細胞運動等多種細胞生理活動,這些作用與ILK的下游信號通路有關。ILK可直接磷酸化下游效應激酶Akt、p38絲裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)和GSK-3β,導致β-catenin積累,進而引起EMT的發(fā)生[41]。

有研究發(fā)現,ILK/β-catenin通過與其他信號通路相互作用調控GSK-3β水平,參與EMT的發(fā)生發(fā)展[23]。ILK可磷酸化Ser9位點使GSK-3β失活,失活的GSK-3β減少了β-catenin磷酸化,促進β-catenin在細胞質與細胞核內聚集,誘導靶基因的表達,促使EMT發(fā)生。有研究表明,貝那普利可降低高糖誘導的體內外TGF-β1和ILK的表達;在高糖條件下,ILK可以單獨或協同調節(jié)足細胞中α-SMA的表達,進而影響GSK-3β的表達,從而通過調節(jié)EMT影響DN的發(fā)生發(fā)展[42]。白志勛等[43]研究表明,ILK作為TGF-β1信號通路下游的重要效應因子,可誘導成纖維細胞特異標志物FSP-1的表達,促進腎臟成纖維細胞增生,導致腎臟間質纖維化的形成;通過敲除ILK基因可以阻斷TGF-β1誘導FSP-1表達,下調GSK-3β,減輕EMT。因此,推測抑制ILK表達可能會阻斷EMT和TGF-β誘導的DN。

綜上,TGF-β、ILK和Wnt信號通路參與GSK-3β的磷酸化和β-catenin的激活,從而導致 EMT轉錄程序的激活,最終影響DN的發(fā)生發(fā)展。

2.2.4 GSK-3β通過介導其他信號轉導通路參與EMT

GSK-3β不僅參與以上3種信號通路,還參與p38 MAPK、PI3K/Akt等信號轉導通路。p38 MAPK可以從細胞質轉運到細胞核,調節(jié)轉錄因子活性,在腎臟足細胞EMT中起關鍵作用。p38 MAPK作為一種下游激酶,p38 MAPK通路可被多種方式激活[44]。有研究報道,p38 MAPK可通過細胞外信號調節(jié)蛋白激酶激活GSK-3β的Thr43位點(但不影響 GSK-3β活性)導致β-catenin的積累,從而在腎小管EMT中發(fā)揮重要作用[45-46]。因此,磷酸化氨基酸位點不同,所對應的GSK-3β活性也有差異。Akt是GSK-3β上游的蛋白激酶,可被PI3K磷酸化激活,激活的 Akt可以反向調節(jié) GSK-3β。有研究報道,連翹苷可通過激活 PI3K/Akt 信號通路抑制GSK-3β活性[47]。RAI等[48]研究發(fā)現,四甲基吡嗪可通過激活Akt信號通路,增加Akt磷酸化水平,降低GSK-3β磷酸化水平,穩(wěn)定β-catenin的活性,進而抑制EMT的進展。

GSK-3β可參與其他信號通路介導EMT的發(fā)生發(fā)展,但這些信號通路與TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin及integrins/ILK信號通路存在一定聯系,形成一個機制網絡,共同影響DN的過程。

3 結論

GSK-3β通過TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin和integrin/ILK等多個信號轉導通路參與腎組織細胞EMT的過程,影響DN的進展。DN是引起慢性腎病和終末期腎病的重要原因,持續(xù)性蛋白尿和腎小球濾過率下降常會導致患者心腦血管事件及病死率增加。對于DN相關的未知生物學標志物及其機制,也需不斷探索,相信隨著研究的不斷深入,會有更多有關DN的發(fā)病機制和生物學標志物被發(fā)現。