黃柯琪，陳躍平，曾 浩，李加根，陳尚桐

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530000）

近期研究表明半月板損傷與鐵死亡之間存在密切關(guān)聯(lián)。鐵死亡是一種鐵依賴(lài)性的細(xì)胞死亡方式，其發(fā)展受到脂質(zhì)過(guò)氧化的積累影響。鐵死亡在多種疾病中扮演重要角色，包括癌癥、壞死性炎癥性疾病以及器官損傷、手術(shù)和生殖系統(tǒng)的器官變化等［6-8］。研究發(fā)現(xiàn)，半月板軟骨細(xì)胞通常在炎癥和鐵超負(fù)荷條件下發(fā)生鐵死亡。越來(lái)越多的證據(jù)表明，鐵死亡可能成為治療軟骨損傷的新靶點(diǎn)［9-11］。然而，尚未明確不同年齡段半月板損傷診斷和治療中與鐵死亡相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。因此，有必要積極開(kāi)展差異鑒別研究，以期未來(lái)能提供更加個(gè)性化和有針對(duì)性的診療策略。

高通量技術(shù)的進(jìn)展已經(jīng)使得基因芯片分析成為鑒定差異表達(dá)基因的重要方法。已經(jīng)有研究使用基因微陣列分析結(jié)合各種生物信息學(xué)分析和機(jī)器學(xué)習(xí)來(lái)識(shí)別多種疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵基因，這些關(guān)鍵基因有可能成為疾病治療和診斷的潛在生物標(biāo)志物。在本研究中采用了免疫浸潤(rùn)分析來(lái)更準(zhǔn)確地識(shí)別兩個(gè)年齡組之間半月板損傷的差異。通過(guò)綜合生物信息學(xué)分析和LASSO 機(jī)器學(xué)習(xí)，并結(jié)合免疫浸潤(rùn)分析，鑒定了與鐵死亡相關(guān)的基因，這些基因有望成為不同年齡段半月板損傷治療的新靶點(diǎn)。這一發(fā)現(xiàn)為精準(zhǔn)化治療半月板損傷提供了新的方向，為未來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療提供了有價(jià)值的線索。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

從GEO 篩選微陣列數(shù)據(jù)集。搜索關(guān)鍵字“meniscusinjury”，搜 索 方 法 如 下：“meniscusinjury”［MeSH 術(shù)語(yǔ)］，過(guò)濾掉非人類(lèi)相關(guān)的基因芯片，最后得到GSE191157 基因芯片。GSE191157 包含8例行關(guān)節(jié)鏡半月板修復(fù)手術(shù)切除的損壞半月板表達(dá)譜，無(wú)明顯軟骨變性、骨關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等代謝性疾病的患者，其中年輕組4 例患者（年齡＜50）和老年組4 例患者（年齡≥50）。

1.2 差異分析

GSE191157 使用Perl 軟件整理相關(guān)矩陣數(shù)據(jù)，使用 R 語(yǔ)言中“l(fā)imma”包對(duì)表達(dá)矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和差異基因分析，以logFC 的絕對(duì)值＞1 且P＜0.05 篩選差異基因，并使用ggplot2 繪制火山圖和熱圖。

1.3 鐵死亡相關(guān)基因及GO、KEGG 功能分析

從“FerrDb”數(shù)據(jù)庫(kù)中收集和整理鐵死亡相關(guān)基因，使用DEGs 和鐵死亡相關(guān)基因取交集，通過(guò)維恩圖可視化。然后整理DE-FRGs 相關(guān)基因在GSE191157 的 表 達(dá) 矩 陣，使 用R 包“clusterProfiler”進(jìn)行GO 和KEGG 功能富集分析，將相關(guān)富集分析結(jié)果可視化。

1.4 WGCNA 分析

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化處理過(guò)后的基因表達(dá)矩陣使用R 語(yǔ)言 中“WGCNA” 包 和“l(fā)imma”包 進(jìn) 行WGCNA 分析，分別進(jìn)行刪除離群樣本，樣本聚類(lèi)構(gòu)建拓?fù)渲丿B矩陣和無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)，動(dòng)態(tài)模塊分析及合并，以基因與模塊相關(guān)性＞0.9 為過(guò)濾條件，找出臨床信息相關(guān)性最強(qiáng)的基因模塊，整理模塊中的基因?yàn)橄乱徊胶Y選核心基因做準(zhǔn)備。

1.5 交集取核心基因及功能富集分析

將GSE191157 矩陣分析的差異基因、鐵死亡相關(guān)基因和WGCNA 中與臨床最相關(guān)模塊的基因取交集作為不同年齡段半月板損傷的核心基因，用venn 圖可視化。

1.6 LASSO 鑒定核心基因

將得到的venn 圖的交集基因數(shù)據(jù)整合，數(shù)據(jù)分為訓(xùn)練集和測(cè)試集。訓(xùn)練集用于訓(xùn)練LASSO 模型，而測(cè)試集用于評(píng)估模型的性能。使用交叉驗(yàn)證選擇合適的lambda 值，根據(jù)選擇的lambda 值構(gòu)建LASSO 模型。從訓(xùn)練好的LASSO 模型中提取非零系數(shù)，這些非零系數(shù)對(duì)應(yīng)于被選擇的核心基因。

心肌組織中ATP等能量物質(zhì)容易在各種酶的作用下被破壞，本研究從心肌組織離體后凍存（液氮迅速冷凍，-80℃冰箱暫存）、樣本前處理（預(yù)冷處理液、冰水浴下均漿、4℃離心）和上機(jī)檢測(cè)（柱溫15℃）全過(guò)程、關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)都保持在低溫下進(jìn)行，最大限度地保持心肌組織中能量物質(zhì)的穩(wěn)定性，為后續(xù)研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)［2，6］。這也是本研究建立一種HPLC法同時(shí)測(cè)定大鼠心肌組織中能量代謝物質(zhì)的含量的前提條件和關(guān)鍵點(diǎn)，其保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1.7 GSEA 富集分析

此分析使用R 語(yǔ)言中的“fgsea”包執(zhí)行。所使用的基因集為KEGG 公共數(shù)據(jù)庫(kù)， 基因根據(jù)其在樣本中的表達(dá)水平進(jìn)行排序，計(jì)算一個(gè)累積型的得分。通過(guò)對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行隨機(jī)化來(lái)生成多個(gè)隨機(jī)化數(shù)據(jù)集，形成一個(gè)隨機(jī)分布。將計(jì)算出的得分與隨機(jī)分布進(jìn)行比較，計(jì)算基因集合的富集分?jǐn)?shù)，用于衡量基因集合在樣本中的富集程度。通過(guò)比較富集分?jǐn)?shù)分布和真實(shí)數(shù)據(jù)的富集分?jǐn)?shù)，設(shè)P＜0.05 提示基因集合在樣本中顯著富集。然后將相關(guān)的通路可視化。

1.8 SSGSEA

ssGSEA 算法基于29 個(gè)免疫基因集，包括不同免疫細(xì)胞類(lèi)型、功能、途徑和檢查點(diǎn)相關(guān)的基因。通過(guò)R 包（GSVA，GSEABase 和limma）采用ssGSEA 算法來(lái)全面評(píng)估研究中包含的每個(gè)樣本的免疫學(xué)特征和每個(gè)免疫細(xì)胞的相對(duì)浸潤(rùn)豐度。

2 結(jié)果

2.1 年輕組和老年組的對(duì)照差異分析

使用“l(fā)imma”包分析年輕組和老年組的RNA-seq 數(shù) 據(jù)，設(shè) 計(jì)FDR 閾 值＜0.05 和|log2FC|使用＞1，總共通過(guò)篩查確定了2 517 個(gè)DEG，其中661個(gè)被下調(diào)和1 856 個(gè)是上調(diào)基因（圖1A）。然后從“FerrDb”數(shù)據(jù)庫(kù)中提取了鐵死亡相關(guān)基因，與上述差異基因取交集并用venn 圖可視化，結(jié)果可見(jiàn)左邊的計(jì)數(shù)（2 456 個(gè)基因）是指GSE191157 的DEG，中間的計(jì)數(shù)（61 個(gè)基因）是指鐵死亡相關(guān)的DEG，右邊的計(jì)數(shù)（504 個(gè)基因）指的是獨(dú)特的鐵死亡基因（圖1B）。然后將鐵死亡相關(guān)DEG 基因在年輕組和老年組的表達(dá)情況用熱圖可視化（圖1C）。

圖1 差異基因火山圖、熱圖與鐵死亡相關(guān)Venn 圖Fig 1 Differential gene volcano map， heat map， and Venn map related to iron death

2.2 鐵死亡相關(guān)基因及GO、KEGG 功能分析

不同年齡段半月板損傷鐵死亡相關(guān)基因的GO 富集分析結(jié)果顯示，共富集到 616 個(gè)條目，其中生物過(guò)程（biological process，BP）579 條，細(xì)胞組分（cell components，CC）14 條，分子功能（molecularfunction，MF）24 條（圖2A）。生物過(guò)程主要涉及細(xì)胞代謝調(diào)整、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂、細(xì)胞死亡、信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞組分主要涉及過(guò)氧化物酶體、微小體、頂端質(zhì)膜、過(guò)氧化物酶體膜、微小體膜、細(xì)胞質(zhì)應(yīng)激顆粒，分子功能主要涉及抗氧化活性、蛋白質(zhì)絲氨酸激酶活性、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、過(guò)氧化物酶活性、氧化還原酶活性。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，共映射出37 條通路，主要與病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、IL-17 信號(hào)通路和腫瘤壞死因子信號(hào)通路等有關(guān)（見(jiàn)圖2B）。

圖2 鐵死亡相關(guān)基因及GO、KEGG 功能分析Fig 2 Analysis of iron death related genes and GO， KEGG functions

2.3 共表達(dá)模塊的構(gòu)建與關(guān)鍵性狀模塊基因的鑒定

WGCNA 是發(fā)現(xiàn)基因與臨床表型的好方法，通過(guò)結(jié)合DEGs 挖掘出與臨床疾病表型相關(guān)的關(guān)鍵基因。GSE191157 沒(méi)有異常值，數(shù)據(jù)集中未刪除任何樣本。對(duì)本數(shù)據(jù)集中位絕對(duì)偏差的前75%基因進(jìn)行了WGCNA 篩選（圖3B）。當(dāng)軟閾值功率等于6時(shí)，構(gòu)建了β=6 軟閾值能力的無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)表達(dá)譜將基因分類(lèi)為不同的模塊。通過(guò)平均鏈接聚類(lèi)（圖3A）。模塊的顏色越深，提示該模塊相關(guān)性越強(qiáng)。在分析了正相關(guān)系數(shù)后，選擇了相關(guān)系數(shù)最強(qiáng)的模塊。結(jié)果顯示青綠色模塊（r=0.93，P＜0.01）和黃色模塊（r=-0.9，P=0.002）具有最顯著的基因意義，其他沒(méi)有顯著的模塊。最后分別提取了青綠色模塊中的2 072 個(gè)基因和黃色模塊中的397 個(gè)基因。這2 469 個(gè)基因被認(rèn)為是與臨床表型相關(guān)的關(guān)鍵基因（圖3C）。

圖3 通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及特異性模塊鑒定分析相關(guān)的潛在鐵死亡基因Fig 3 Construction of a co expression network and identification and analysis of potential iron death genes through specific modules

2.4 LASSO 機(jī)器學(xué)習(xí)篩查核心基因

WGCNA 結(jié)果得到的青綠色模塊和黃色模塊共有2 469 個(gè)基因，再去與鐵死亡相關(guān)的半月板的61 個(gè)差異基因（F-DEG）取交集顯示在維恩圖中，兩者的交集部分共得到46 個(gè)基因（圖3D）。提取46 個(gè)基因的表達(dá)譜，用于構(gòu)建LASSO 模型。在 LASSO 模型中確定了產(chǎn)生最小分類(lèi)誤差的最佳λ（λ=4）?；?于λ值4，篩 選 出F-DEG 的LASSO 系 數(shù) 譜（圖4A）。隨后鑒定出4 個(gè)非零系數(shù)的核心基因，包括BEX1、MMP13、PTPN18和SLC38A1確定為不同年齡段半月板損傷核心基因（圖4B）。

圖4 LASSO 機(jī)器學(xué)習(xí)和GESA 通路富集分析Fig 4 LASSO machine learning and GESA pathway enrichment analysis

2.5 GESA

GSEA 分析顯示，富集途徑主要與Toll 樣受體信號(hào)通路、FOXO 信號(hào)通路、mTOR 信號(hào)通路、ECM-受體相互作用和信號(hào)通路、免疫球蛋白G 生產(chǎn)者信號(hào)通路、草酰乙酸和乙酰輔酶A 的降解有關(guān)（圖4C）。差異途徑主要集中細(xì)胞代謝和能量供給、細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞受體的相互作用、細(xì)胞黏附、遷移和信號(hào)傳遞、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊、修復(fù)、加工和蛋白質(zhì)合成能在細(xì)胞應(yīng)激和修復(fù)中起作用。GSEA 結(jié)果表明，上述信號(hào)通路可能參與半月板損傷的進(jìn)展，并提示了這些關(guān)鍵通路的預(yù)后價(jià)值，可能會(huì)在調(diào)節(jié)半月板損傷患者進(jìn)展和不良預(yù)后中起重要作用。

2.6 免疫浸潤(rùn)分析

SSGSEA 算法用于檢查老年組半月板與年輕組對(duì)照在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異方面的關(guān)聯(lián)。利用R語(yǔ)言對(duì)GSE191157 數(shù)據(jù)集進(jìn)行的29 種免疫細(xì)胞相關(guān)性分析。創(chuàng)建了一個(gè)熱圖來(lái)描述免疫細(xì)胞之間的差異相關(guān)模式，如圖5A 所示，紅色越深代表二者負(fù)相關(guān)性越高，藍(lán)色越深代表二者正相關(guān)性越高，正相關(guān)性較高的組合有效應(yīng)記憶CD8 T 細(xì)胞與靜CD56dim 自然殺傷細(xì)胞，記憶B 細(xì)胞與未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞等，負(fù)相關(guān)性較高的組合有自然殺傷T 細(xì)胞和激活的CD4 T 細(xì)胞，中央記憶CD4 T 細(xì)胞和效應(yīng)記憶CD8 T 細(xì)胞。此外，通過(guò)探索核心基因相關(guān)性分析證實(shí)，說(shuō)明樞紐基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性，MMP13在效應(yīng)記憶CD8 T 細(xì)胞、CD56dim 自然殺傷細(xì)胞、中央記憶CD4 T 細(xì)胞中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而SLC38A1、BEX1、PTPN18這三個(gè)核心基因則呈正相關(guān)（圖5C）。

圖5 免疫浸潤(rùn)分析Fig 5 Immunoinfiltration analysis

差異熱圖顯示老年組半月板損傷的中激活的B細(xì)胞、激活的CD4 T 細(xì)胞和效應(yīng)記憶CD8 T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞大部分浸潤(rùn)豐度高于年輕組（圖5B）。免疫差異細(xì)胞結(jié)果顯示，老年組中激活的B 細(xì)胞，激活的CD4 T 細(xì)胞，效應(yīng)記憶CD8 T 細(xì)胞在老年組中顯著低于年輕組，未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞顯著高于年輕組（圖5D）。

3 討論

半月板是人體膝關(guān)節(jié)內(nèi)具有彈性和韌性彎曲纖維軟骨結(jié)構(gòu)，主要功能包括增強(qiáng)膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，減少關(guān)節(jié)受力，提供緩沖作用，同時(shí)在膝關(guān)節(jié)屈伸、旋轉(zhuǎn)和側(cè)向運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用［12］。隨著年齡的增長(zhǎng)，身體供血、關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境、半月板的磨損程度都會(huì)出現(xiàn)不同程度的改變，因此可知不同年齡段的半月板損傷存在著差異［13］。面對(duì)兩人群半月板損傷的差異，需要采用不同針對(duì)性的治療策略。鐵死亡是由鐵依賴(lài)性脂質(zhì)過(guò)氧化介導(dǎo)的一種新型調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式［14］。鐵死亡與多種人類(lèi)疾病密切相關(guān)，不僅在許多人類(lèi)惡性腫瘤中觀察到鐵死亡，同時(shí)還與骨關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松疾病有密切關(guān)系［15］。既往研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡參與軟骨細(xì)胞凋亡的進(jìn)展［16］。低濃度的鐵離子可以促進(jìn)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC3T3-E1）的生長(zhǎng)，而高濃度的鐵離子會(huì)抑制它們的生長(zhǎng)并增加ROS 水平［17］。鐵超負(fù)荷可以在一定程度上抑制成骨細(xì)胞的活性，從而影響它們的分化過(guò)程。同時(shí)，它還可以激活破骨細(xì)胞的分化并引起骨破壞［18］。但是具體的作用方式尚不清楚，靶向鐵死亡或許能提供針對(duì)不同人群半月板損傷的有效治療方法。文章在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到年輕組和老年組半月板損傷的表達(dá)基因，鐵死亡基因相關(guān)數(shù)據(jù)從FerrDb 數(shù)據(jù)庫(kù)的得到，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析后，兩者取交集得到不同人群半月板損傷的差異基因，并通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)篩選出鐵死亡相關(guān)的標(biāo)志基因，然后進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析，對(duì)鐵死亡在不同人群半月板損傷中的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，明確不同年齡段半月板損傷鐵死亡的生物標(biāo)志物。

鐵死亡相關(guān)基因GO 分析顯示，生物過(guò)程主要涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、細(xì)胞代謝調(diào)整細(xì)胞死亡、信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控。其中最顯著的分組過(guò)程是涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)度和延長(zhǎng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡，而輕度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過(guò)GRP78 途徑激活自噬并保護(hù)軟骨細(xì)胞免于凋亡［19］。還有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和功能以及骨細(xì)胞的存活來(lái)調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)［20］。另外在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)度和自噬功能障礙可促進(jìn)炎癥介導(dǎo)的骨質(zhì)流失［21］。細(xì)胞組分主要涉及過(guò)氧化物酶體、微小體、頂端質(zhì)膜、過(guò)氧化物酶體膜、微小體膜、細(xì)胞質(zhì)應(yīng)激顆粒。其中多個(gè)顯著的細(xì)胞組分與氧化物酶體相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)氧化物酶體與軟骨細(xì)胞的死亡有著密切關(guān)系。在對(duì)小鼠軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體增殖物激活的受體γ（PPAR-γ）表達(dá)增加可以緩解由高同型半胱氨酸引起的促炎介質(zhì)和基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）的表達(dá)增加，進(jìn)而抑制軟骨細(xì)胞死亡［22］。另外一個(gè)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受 體γ 共 激 活 劑1α 和FoxO3A 通 過(guò)AMP 活 化 蛋 白激酶活化蛋白激酶介導(dǎo)軟骨保護(hù)［23］。KEGG 富集分析顯示，主要與P13K 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、IL-17 信號(hào)通路和腫瘤壞死因子信號(hào)通路等。研究發(fā)現(xiàn)miR-7/EGFR/MEGF9 軸通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路引起骨關(guān)節(jié)炎軟骨降解［24］。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，關(guān)節(jié)內(nèi)注射IL-17 中和抗體可減少關(guān)節(jié)軟骨變性并降低衰老標(biāo)志物Cdkn1a的表達(dá)，主要與關(guān)節(jié)中的IL-17 的降 低 和IL-4 表 達(dá) 的 增 加 有 關(guān)［25，26］。上 述 解 釋 有 關(guān)于鐵死亡在不同人群半月?lián)p傷中的作用機(jī)制，本研究還通過(guò)WGCNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)一步篩選出BEX1、MMP13、PTPN18和SLC38A1四個(gè)關(guān)鍵基因，然后對(duì)其進(jìn)行免疫浸潤(rùn)相關(guān)性分析。

MMP13 是靶向軟骨降解的主要酶，通過(guò)其切割Ⅱ型膠原蛋白的特殊能力參與軟骨降解的主要基質(zhì)金屬蛋白酶［27］。關(guān)節(jié)軟骨合成代謝和分解代謝之間的平衡受復(fù)雜的因素網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，但主要由MMPs 及其金屬蛋白酶（TIMPs）的內(nèi)源性組織抑制 劑 維 持［28］。有 研 究 發(fā) 現(xiàn)CRISPR-Cas9 介 導(dǎo) 的MMP13 位點(diǎn)的DNA 編輯可以降低MMP13 的表達(dá)，可用于有效地建立人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（健康和骨關(guān)節(jié)炎）的細(xì)胞群，顯示出軟骨保護(hù)作用［29］。 Wang等［30］證明關(guān)節(jié)內(nèi)注射摻入果素的熱凝膠通過(guò)下調(diào)MMP13 的表達(dá)來(lái)抑制OA 兔的關(guān)節(jié)炎癥。通過(guò)上述研究得知MMP13 可能是治療半月板損傷的關(guān)鍵靶基因。而PTPN18、BEX1、SLC38A1 在半月板、軟骨等方面相關(guān)的研究文獻(xiàn)不多，但是與鐵死亡關(guān)系密切。PTPN18 敲低增加了細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，并下調(diào)了GPX4 和xCT 表達(dá)，PTPN18 的沉默可能通過(guò)靶向p-p38/GPX4/xCT 軸誘導(dǎo)KLE 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的鐵死亡［31］。PTPN18、BEX1、SLC38A1 能否成為不同年齡段半月板損傷診斷和治療靶點(diǎn)還需要更深入的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究采用SSGSEA 算法對(duì)老年組和年輕組的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)類(lèi)型進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)多種免疫細(xì)胞亞型與半月板損傷的重要生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)。老年組中激活的B 細(xì)胞，激活的CD4 T 細(xì)胞，效應(yīng)記憶CD8 T 細(xì)胞在老年組中顯著低于年輕組，未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞顯著高于年輕組。 此 外，通 過(guò) 對(duì)BEX1、MMP13、PTPN18 和SLC38A1 和免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MMP13 在 效 應(yīng) 記 憶CD8 T 細(xì) 胞、CD56dim 自 然 殺傷細(xì)胞、中央記憶CD4 T 細(xì)胞中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而SLC38A1、BEX1、PTPN18這三個(gè)核心基因則呈正相關(guān)。T 細(xì)胞作為骨關(guān)節(jié)炎滑膜中的主要免疫細(xì)胞之一，可在早期被檢測(cè)出來(lái)［32，33］。但滑膜內(nèi)襯層主要含有 CD4+ 和 CD8+ T 細(xì)胞，內(nèi)膜層主要含有 CD4+ T 細(xì)胞，滑膜T 細(xì)胞浸潤(rùn)可能在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中承擔(dān)重要角色，誘發(fā)癥狀性骨關(guān)節(jié)炎［34，35］。T 細(xì)胞可能還通過(guò) CD40/ CD40L 信號(hào)軸活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，從而通過(guò)免疫細(xì)胞間的相互作用，影響骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展［34］，此外，免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)與細(xì)胞衰老亦關(guān)系密切［36］。因此軟骨細(xì)胞的衰老程度在介導(dǎo)的免疫反應(yīng)方面存在差異，與不同年齡段半月板損傷之間存在差異相符，這值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法和機(jī)器學(xué) 習(xí) 算 法 共 篩 選 出BEX1、MMP13、PTPN18和SLC38A1四個(gè)鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵基因，這些關(guān)鍵基因可能與不同年齡段半月板損傷的差異表達(dá)有著緊密關(guān)系，同時(shí)分析結(jié)果提示鐵死亡在不同年齡段半月板損傷免疫浸潤(rùn)方面發(fā)揮重要作用，對(duì)基礎(chǔ)研究具有一定的參考意義。但此次研究仍存在一定的局限性：第一，芯片數(shù)據(jù)樣本量較少，所以結(jié)果可能出現(xiàn)一定的偏差，第二，雖然不同年齡段半月板損傷相關(guān)的鐵死亡基因已經(jīng)篩出，但對(duì)于篩出的基因研究較少，其具體的作用機(jī)制仍然有待解釋?zhuān)@仍要后續(xù)研究進(jìn)一步深入挖掘。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

黃柯琪：文章設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及手稿撰寫(xiě)；曾浩：相關(guān)文獻(xiàn)搜集與整理，數(shù)據(jù)分析；李加根、陳尚桐：部分文獻(xiàn)搜集與文章格式檢查；陳躍平：提供整體思路和修改意見(jiàn)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。