氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺殺滅或抑制病原體的活性研究

蘇思雨，陳楠楠，趙志博，朱戰(zhàn)波，2，周玉龍，2，張澤財，2，劉宇，2

（1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.黑龍江省牛病防控工程技術研究中心）

近年來，我國的畜禽集約化養(yǎng)殖模式發(fā)展迅速，致病微生物對于畜禽業(yè)健康發(fā)展的影響越來越大。由細菌和病毒引起的畜禽疫病不僅能嚴重影響畜禽健康及其相關產品的品質和產量，造成畜牧業(yè)嚴重的經濟損失[1-2]，還威脅著人類健康。因此，畜禽養(yǎng)殖場的疫病防控工作是至關重要的，其中消毒劑的廣泛使用發(fā)揮了重要作用。當前畜禽業(yè)常用的消毒劑主要包括鹵素類、酸類、堿類、醇類、酚類、醛類、強氧化劑類以及季銨鹽類等[3]。其中，強氧化劑類消毒劑能快速殺菌，但其化學性質不穩(wěn)定，容易分解，甚至釋放有毒有害氣體。在日常生活中廣泛使用的含氯消毒劑對金屬具有腐蝕性，對人皮膚和黏膜有刺激性，釋放有毒氣體。另外，醇、酚和醛類消毒劑也存在易揮發(fā)，釋放有毒有害氣體以及遇明火易燃等安全問題。因此，低毒安全，對人和物品無腐蝕性的季銨鹽類消毒劑引起了人們的關注。

季銨鹽類化合物（Quatemary ammonium compounds，QACs）屬于陽離子表面活性劑，無色無味，無腐蝕性，刺激性低，可對畜禽的體表和飲水消毒，具有長效、高效、廣譜殺菌等特點，得到了廣泛的應用[4-5]。畜禽生產中QACs 常用于環(huán)境消毒、器具消毒、體表消毒、術前手部消毒、創(chuàng)面消毒以及農作物飼料的防霉[6]，在預防動物疾病中發(fā)揮著重要作用[7]。此外，QACs 易吸附于物體表面，化學性質穩(wěn)定，且與防凍劑有較好的相容性，所以在長效抑菌和低溫消毒方面也有廣闊的應用前景。QACs 按化學結構可以分為單鏈季銨鹽和雙鏈季銨鹽，兩種季銨鹽的消毒殺菌機制基本相同，表現為QACs 溶解時解離出的季銨鹽陽離子吸附到表面有負離子的病原體上，破壞膜結構，增強膜的通透性，使蛋白質和其他營養(yǎng)物質泄露，影響細胞的呼吸和糖代謝過程，引起蛋白質變性，呈現殺菌作用[8]。而雙鏈季銨鹽與單鏈季銨鹽的不同，主要表現在雙鏈季銨鹽能夠干擾病原體合成核酸和蛋白質的過程[9]。多項研究發(fā)現，QACs 能夠殺滅多種細菌和親脂病毒，如苯扎氯銨能夠有效殺滅大腸桿菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌及克雷伯菌等革蘭陰性菌，對鏈球菌、葡萄球菌、真菌、厭氧菌和霉菌也有殺滅作用[4]。此外，0.2%的苯扎氯銨溶液可在15 s內殺滅新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）[10]，10 mg·L-1羥乙基/羥丙基季銨鹽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率達到了100%，且毒性低[11-12]，烷基二甲基芐基氯化銨和雙癸基二甲基氯化銨消毒劑可在-18 ℃下殺滅脊髓灰質炎病毒[13]。QACs 對真菌也有殺滅作用，研究發(fā)現以苯扎溴銨和六亞甲基四胺為主要成分的復合消毒劑，不僅可以殺滅大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，還能有效地殺滅黑曲霉孢子和白色念珠菌[14]。

試驗旨在明確自主合成的季銨鹽表面活性劑氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺（N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide，C12cmpC）對黑龍江部分地區(qū)禽源病原菌和牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）的殺滅或抑制活性，為基于季銨鹽表面活性劑消毒劑的開發(fā)和應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 菌株、病毒株和細胞

鵝源大腸桿菌（DQ207234、QE1-2-1、XH197291、QE1-3-1、YZE191205、QE191291、QS195313[15]）、雞巴氏桿菌（DQ203719）、雞鏈球菌（DQ205134）、雞金黃色葡萄球菌（DQ204741）分離株由實驗室分離鑒定。ATCC 標準菌株：大腸桿菌（ATCC10536）和金黃色葡萄球菌（ATCC6538）。CP 型BVDV（NADL 株），牛腎細胞（Madin-darby bovine kidney，MDBK）保存于黑龍江省牛病防控工程技術研究中心。

1.2 主要試劑

氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺（N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide，C12cmpC）由齊齊哈爾大學郭祥峰教授團隊合成（見表1）。甘氨酸購自鄭州市千盛化工原料有限公司；卵磷脂購自鄭州福宏生物科技有限公司；吐溫-80 購自江蘇省海安石油化工廠。營養(yǎng)瓊脂（NB）和營養(yǎng)肉湯（NA）購自青島海博生物技術有限公司；胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司；Penicillin-Streptomycin Solution 購自Invitrogen 公司；反轉錄試劑盒購自TaKaRa 公司；TB Green Premix Ex Taq II 購自TaKaRa 公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司；CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒購自Dojindo Laboratories 公司。

1.3 方法

1.3.1 抗細菌活性測定

1.3.1.1 最低抑菌濃度（MIC）測定

依據VAH 方法7 和EN 14885[16-17]，通過微量稀釋法測定C12cmpC 對不同致病菌的最低抑菌濃度。用滅菌蒸餾水將C12cmpC 原液（濃度為2 000 mg·L-1）進行二倍稀釋，得到8 個不同濃度的C12cmpC。用PBS 將指示菌濃度稀釋至5×105～5×106CFU·mL-1。使用96 孔細胞培養(yǎng)板進行檢測。試驗組：每孔添加80 μL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、10 μL C12cmpC 和10 μL 細菌懸液；空白對照組：每孔添加100 μL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；陽性對照組：每孔添加90 μL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和10 μL 細菌懸液。隨后將細胞板置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細菌的生長狀況，確定最低抑菌濃度，試驗做了3 次重復。

1.3.1.2 最低殺菌濃度（MBC）測定

參照德國衛(wèi)生標準，微生物學（DGHH）方法和EN 14885[16-18]以及最低抑菌濃度試驗方法，將不同濃度的C12cmpC 與相應試驗菌的懸液混合，吸取100 μL混合液加入到營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基中，用玻璃涂布棒涂抹均勻，37 °C 恒溫培養(yǎng)24 h。隨后進行菌落計數，確定C12cmpC 的MBC，試驗重復3 次，懸浮液細菌檢出量為1.0～5.0×108CFU·mL-1。

殺菌率=（對照組菌數-樣品組菌數）/對照組菌數×100%

1.3.1.3 時間殺菌試驗

參照VAH 方法8 和EN 14885[16-17]，將不同稀釋度的C12cmpC 和試驗菌混勻，置于20 ℃水浴中。將0.1 mL 細菌懸液和10 mL C12cmpC 混合，分別作用1、5、15、30 min。然后，立即吸取0.1 mL 混液與10 mL中和劑在試管中混勻，持續(xù)作用10 min，再取0.1 mL混合液與10 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基在試管中混勻，置于37 °C 下培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長狀況，試驗做3次重復。

1.3.2 抗病毒活性測定

1.3.2.1 C12cmpC 對細胞生長狀況的影響

待接種于24 孔板的MDBK 細胞貼壁生長密度達到80%時，加入各試驗濃度的C12cmpC 溶液，混合均勻。終濃度分別為1、2.5、5、10、20 mg·L-1。另設置一個不加C12cmpC 的對照組。隨后將細胞板在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)12、24、48、72 h，分別在顯微鏡下觀察各時間點的細胞生長狀況。

1.3.2.2 C12cmpC 對細胞活性的影響

根據CCK-8 試劑盒說明書的操作步驟，設置5個試驗組，每組分別含有1、2.5、5、10、20 mg·L-1C12cmpC 溶液的MDBK 細胞。設置2 個對照組，分別為無細胞組和不添加C12cmpC 溶液組。每個組設有5 個重復孔，將96 孔板置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)72 h。然后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS 輕緩地洗滌細胞2 次，添加100 μL DMEM 培養(yǎng)基和10 μL CCK-8 試劑，輕敲細胞板混勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱5%、CO2條件下避光孵育2 h，最后用酶標儀檢測各組溶液的OD450值，計算各試驗組的細胞存活率。

1.3.2.3 C12cmpC 抗BVDV 病毒效果

參照EN 14885[16]方法，選取濃度為5 mg·L-1的C12cmpC 與BVDV 分別作用1、5、30、60 min。隨后，從各試驗孔吸取50 μL 混合液加入到MDBK 細胞中。設置3 個對照組，分別為MDBK 細胞組，MDBK細胞+C12cmpC 組以及BVDV+MDBK 細胞組。將細胞板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h，收集細胞，Trizol 法提取RNA，再用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，采用SYBR Green 法和CFX96 Touch Real-Time PCR 系統(tǒng)檢測分析MDBK細胞中BVDV mRNA 的表達水平，反應體系參照TaKaRa 的實時熒光定量PCR 試劑盒操作說明書。BVDV 的引物序列為5′-GAG TAC AGG GTA GTC GTC AG-3′和5′-CTC TGC AGC ACC CTA TCA GG-3′[19]。β-actin 引物序列為5′-CGC ACC ACT GGC ATT GTC AT-3′和5′-TCC AAG GCG ACG TAG CAG AG-3′[19]。實時熒光定量PCR 的詳細反應條件為95 ℃30 s，95 ℃10 s，56 ℃30 s，72 ℃15 s，40 個循環(huán)。每個樣品3 次重復，差異基因的表達分析參照2-ΔΔCt方法。

1.3.3 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 6.0 中的One-way ANOVA、Two-way ANOVA 以及Student’s unpaired t-test分析方法進行數據統(tǒng)計分析。P＜0.05 時，組間差異具有統(tǒng)計學意義，* 代表P＜0.05，** 代表P＜0.01，***代表P＜0.001，所有數值表示均為平均值±相對標準偏差的形式統(tǒng)計分析數據。

2 結果與分析

2.1 C12cmpC 的MIC 試驗結果

C12cmpC 的MIC 檢測結果表明，C12cmpC 對鵝大腸桿菌（DQ207234）、鵝大腸桿菌（YZE191205）和雞鏈球菌（DQ205134）的MIC 均為500 mg·L-1，對其余7 株分離株的MIC 均為250 mg·L-1。對大腸桿菌標準株（ATCC 10536）和金黃色葡萄球菌標準株（ATCC 6538）的MIC 均為31.25 mg·L-1，低于10 株 分離株（見表2）。

2.2 C12cmpC 的MBC 及時間殺菌試驗結果

C12cmpC 的MBC 及時間殺菌檢測結果表明，C12cmpC 對鵝大腸桿菌（QS195313）的殺菌效果最好，500 mg·L-1的C12cmpC 作用1 min 可達到99.9%的殺菌率。500 mg·L-1的C12cmpC 作用5 min 時，對鵝大腸桿菌（QE191291）、雞巴氏桿菌（DQ203719）和雞金黃色葡萄球菌（DQ204741）的殺菌率為99.9%（見表3）。

表3 氯化－N－十二烷基吡啶－1－乙酰胺的最低殺菌濃度試驗結果Table 3 Test results of the minimum bactericidal concentration of N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide

2.3 C12cmpC 對MDBK 細胞生長狀態(tài)的影響

選擇不同濃度的C12cmpC 處理MDBK 細胞，分別在作用12、24、48、72 h 時，顯微鏡下觀察各試驗組MDBK 細胞的生長狀態(tài)。結果顯示（圖1），在相同作用時間點，C12cmpC 的濃度越高，MDBK 細胞的生長狀態(tài)越差。此外，同一濃度C12cmpC 作用MDBK 細胞的時間越長，細胞的生長狀態(tài)越差。依據檢測結果，選擇1、2.5、5、10、20 mg·L-1作為下一步細胞活性檢測所用的C12cmpC 濃度參考范圍。

圖1 不同濃度氯化－N－十二烷基吡啶－1－乙酰胺作用不同時間時MDBK 細胞的形態(tài)（100×）Fig.1 Morphology of MDBK cells treated with different concentrations of N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide for different time（100×）

2.4 C12cmpC 對MDBK 細胞活性的影響

選取濃度為1、2.5、5、10、20 mg·L-1的C12cmpC溶液作用MDBK 細胞，不加C12cmpC 的MDBK 細胞為對照。各試驗組細胞培養(yǎng)72 h，通過CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒檢測MDBK 細胞的存活率。結果顯示，當C12cmpC 濃度為10 mg·L-1（P＜0.001）和20 mg·L-1（P＜0.001）時，MDBK 細胞的存活率顯著下降。依據結果（圖2），選定5 mg·L-1為C12cmpC 對MDBK 細胞的最大安全濃度。

圖2 不同濃度氯化－N－十二烷基吡啶－1－乙酰胺對MDBK 細胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of chlorinated-Ndodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide on survival rate of MDBK cells

2.5 C12cmpC 抗BVDV 活性檢測

選取5 mg·L-1的C12cmpC 與BVDV 分別作用1、5、30、60 min。處理后的病毒液加入MDBK 細胞中培養(yǎng)72 h，qRT-PCR 檢測BVDV mRNA 的表達水平。結果如圖3 所示，C12cmpC 處理后BVDV mRNA的表達水平顯著降低（1 min，P＜0.05；5 min，P＜0.05；30 min，P＜0.01；60 min，P＜0.01）。

圖3 氯化－N－十二烷基吡啶－1－乙酰胺對BVDV mRNA 表達水平的影響Fig.3 Effect of N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide on the expression level of BVDV mRNA

3 討論

消毒劑的使用在畜禽養(yǎng)殖場的疫病防控中占據至關重要的地位，消毒效果的好壞直接影響?zhàn)B殖場的經濟效益。季銨鹽類消毒劑因其低毒性、低腐蝕性、高效且廣譜抑菌等優(yōu)點得到廣泛的關注和應用，對多種細菌的殺滅作用和抗病毒功能也被逐漸發(fā)現。苯扎氯銨是季銨鹽類消毒劑的第一代產品，當濃度為1 000 mg·L-1時，作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌2 min，可以殺滅99.8%和99.9%的細菌[20]。同樣為單鏈季銨鹽類消毒劑的十八烷基三甲基氯化銨對大腸桿菌的MIC 為125 mg·L-1[21]。雙鏈季銨鹽類消毒劑雙癸基二甲基氯化銨對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 均為400 mg·L-1[22]。研究中C12cmpC 對大腸桿菌（ATCC 10536）和金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）標準株的MIC 均為31.25 mg·L-1，以62.5 mg·L-1的濃度作用1 min 時，即可達到99.9%以上的殺菌率，C12cmpC 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值更小。然而，試驗中C12cmpC 對10 株分離菌株的殺菌活性低于標準菌株。后續(xù)臨床試驗時，應根據實際情況相應地提高濃度進行檢測與分析。

季銨鹽消毒劑主要通過作用于生物膜來發(fā)揮作用，可殺滅有囊膜的病毒[23]。BVDV 含有囊膜，是影響?zhàn)B牛業(yè)經濟的重要病毒[24]。研究發(fā)現，C12cmpC 對BVDV 作用1 min，可以顯著抑制BVDV 復制，具有抗BVDV 的作用。此外，程晶等[25]在探究多種消毒劑對非洲豬瘟病毒的滅活作用中發(fā)現，季銨鹽消毒劑苯扎溴銨對豬原代肺泡巨噬細胞的最高安全濃度為2.5 mg·L-1。Verena 等[26]研究發(fā)現，苯扎氯銨對斑馬魚肝細胞和人肝細胞活力的半數效應濃度分別為8.5×10-4mg·L-1和2.74×10-3mg·L-1。試驗中C12cmpC 對MDBK 細胞的最大安全濃度為5 mg·L-1。在保證較高的抗病毒活性下避免了C12cmpC 對MDBK 細胞活性的不良影響，這為后續(xù)深入探索C12cmpC 抗病毒作用提供了依據。

目前，季銨鹽類消毒劑已經發(fā)展到了第七代，僅通過改變季銨鹽類化合物的結構來增強消毒劑的殺菌效果越來越難，并且這種方式的研發(fā)成本也相對較高。將季銨鹽類消毒劑復配其他種類消毒劑，制備新型復合消毒劑逐漸成為消毒劑開發(fā)領域新的發(fā)展趨勢[9]。多種消毒劑成分的復配，不僅能夠彌補單一消毒劑組分殺菌效果不足的缺點，也能通過產生協(xié)同作用增強復合消毒劑的殺菌效果。劉歡等[27]在評估一種季銨鹽和醛類的復合消毒劑時發(fā)現，復合消毒劑不僅能夠減弱醛類的毒性和刺激性，還能提高殺菌效果，并且能殺滅新城疫病毒和豬瘟病毒。此外，由于季銨鹽類化合物屬于陽離子表面活性劑，不能與陰離子表面活性劑和氧化劑同時使用，也不能接觸拮抗劑和有機物[28]?？傊_發(fā)低毒、高效、殺菌作用持久的季銨鹽類表面活性劑消毒劑，對于畜禽養(yǎng)殖場的臨床消毒具有重要意義。

4 結論

季銨鹽類表面活性劑氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺（C12cmpC）對禽源致病菌（大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌）和牛病毒性腹瀉病毒均有殺滅作用，研究結果為C12cmpC 的臨床應用和新型季銨鹽類消毒劑的開發(fā)提供了依據。