孫詩琪劉路胡雙元王雨巖孫銘聲趙凌

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，成都 610075；2. 針灸治療老年病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都中醫(yī)藥大學(xué)），成都 610075）

近年來，腸道微生物在健康和疾病中的作用成為熱點(diǎn)，其中糞便微生物移植，即糞菌移植（fecal microbiota transplant，F(xiàn)MT），是一種以腸道微生物為靶向，通過將供體糞菌移植到受體胃腸道，以重構(gòu)受體腸道菌群的治療方式[1]。 大量研究表明FMT不僅在治療潰瘍性結(jié)腸炎[2]、腸易激綜合癥[3]等腸道疾病中作用顯著，且對(duì)包括神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ò顾钃p傷[4]、阿爾茨海默癥[5]）、代謝性疾?。ǚ逝职Y[6]、糖尿病[7]）等因腸道菌群紊亂引起的腸道外疾病同樣具有治療價(jià)值。 FMT 將腸道微生物變化與病理聯(lián)系起來，為疾病的治療及深入研究提供了新的思路和手段。 但FMT 應(yīng)對(duì)不同疾病的作用機(jī)制及不良反應(yīng)尚未明確，因而無法廣泛應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中，仍需依賴臨床前研究的深入。 當(dāng)前報(bào)道的FMT 臨床前研究中實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)高度不一致或不完整，嚴(yán)重影響了其研究的可重復(fù)性和結(jié)果解釋，阻礙了成果的臨床轉(zhuǎn)化。 本綜述從FMT 常用的小鼠受體著手，對(duì)其中包括受體選擇、飼養(yǎng)環(huán)境、抗生素使用、樣本采集及儲(chǔ)存條件、移植材料制備、移植途徑等在內(nèi)的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行了討論，并對(duì)不同選擇的優(yōu)勢及局限性進(jìn)行分析。 上述影響因素的繁雜性提示亟需提供FMT 臨床前研究標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)以減少異質(zhì)性及非必要損耗、提升嚴(yán)謹(jǐn)性及可復(fù)制性的必要性。 本文回顧并分析近年的相關(guān)報(bào)道，從FMT 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟及重要影響因素著手，提出針對(duì)實(shí)現(xiàn)其研究可復(fù)制及標(biāo)準(zhǔn)化的建議，并對(duì)未來的研究提出展望。

1 受體動(dòng)物選擇

1.1 不同品種及特征受體差異

嚙齒動(dòng)物由于生理解剖結(jié)構(gòu)與人類相似，被廣泛應(yīng)用于臨床前研究。 得益于腸道微生物在屬水平與人類的相似性，小鼠被廣泛應(yīng)用于FMT 的相關(guān)研究，盡管其豐度存在差異[8-9]，但研究人員在小鼠中發(fā)現(xiàn)了與人類相似的腸型，且不同菌株豐度差異導(dǎo)致的疾病表現(xiàn)與人類研究中結(jié)果一致，為小鼠在FMT 臨床前研究中的應(yīng)用提供了更多的可能[10]。LLEAL 等[11]在評(píng)估小鼠和大鼠作為人類微生物移植臨床前模型的性能時(shí)發(fā)現(xiàn)，較小鼠而言，大鼠的腸道環(huán)境表現(xiàn)出與人類更高的相似性，且大鼠捕獲人類腸道微生物的效率更高，未來或能成為日后建立人源化腸道微生物模型的重要工具。 但當(dāng)前，F(xiàn)MT 的基礎(chǔ)研究仍以小鼠為主，大鼠的使用仍有待更多研究的認(rèn)可。 除品系外，設(shè)計(jì)FMT 實(shí)驗(yàn)時(shí)還需考慮性別、年齡等影響因素，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果在不同性別、年齡中都能得到解釋。 研究表明，腸道微生物狀態(tài)因性別及年齡而異，其豐度在不同性別受體中不盡相同[12]，F(xiàn)MT 療效也受受體年齡的影響[13-15]。 綜上所述，受體的選擇需要依據(jù)研究目的選擇最相適的品種及特征。

1.2 受體腸道微生物控制途徑

1.2.1 選擇無菌動(dòng)物或無特定病原體動(dòng)物限制常駐微生物

無菌（germ-free，GF）物由于缺乏常駐腸道微生物，在接收外源性腸道微生物時(shí)無須競爭，表現(xiàn)出對(duì)供體微生物的高效“吸收”，因而GF 動(dòng)物被認(rèn)為是該領(lǐng)域的最佳受體模型[16-17]。 但GF 狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致小鼠的異常發(fā)育或生理性改變，如：免疫及代謝系統(tǒng)異常、神經(jīng)系統(tǒng)異常等[18-20]；如選擇GF 模型則需要考慮規(guī)避其特異性改變對(duì)目標(biāo)疾病的影響（表1）。 同時(shí)，GF 動(dòng)物在運(yùn)輸、飼養(yǎng)及處理中對(duì)成本投入、環(huán)境設(shè)施的高要求限制了其廣泛應(yīng)用，加之人類不存在等效的無菌狀態(tài)，因此使用GF 動(dòng)物的研究從臨床前向臨床的轉(zhuǎn)化存在尚待解釋的環(huán)節(jié)。常規(guī)無特定病原體（specific pathogen free，SPF）動(dòng)物，即指不攜帶潛在感染或條件致病的病原體的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 與GF 動(dòng)物的無菌飼養(yǎng)不同，SPF 動(dòng)物腸道菌群易受出生及成長環(huán)境的影響，通過對(duì)GF 與SPF 模型疾病表征異同的比較，能夠分析常駐腸道微生物對(duì)疾病的影響，更能進(jìn)一步聚焦其中單菌或多菌的具體作用。 簡化腸道微生物動(dòng)物亦屬于悉生動(dòng)物，如被報(bào)道的最小微生物群落（OligoMM12）小鼠或謝德勒菌群ASF（Altered Schaedler Flora）模型，作為含有明確微生物的受體模型，能實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道微生物的更準(zhǔn)確把控[21-22]。 綜上，可選擇單獨(dú)通風(fēng)籠（Individual ventilated caging，IVC）系統(tǒng)在降低無菌飼養(yǎng)對(duì)環(huán)境設(shè)施及成本的雙重高要求的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)菌群一定程度的控制[23]。 針對(duì)GF 動(dòng)物存在的特異性改變，或能通過ex-GF 鼠，即出生后立即飼養(yǎng)于微生物充足但無病原體環(huán)境的鼠作為對(duì)照，以提供由于先天因素對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響的證據(jù)。

表1 不同受體動(dòng)物模型間比較Table 1 Comparison between different receptor animal models

1.2.2 抗生素預(yù)處理消耗腸道微生物

通過抗生素預(yù)處理破壞菌群，有操作簡單、成本低、環(huán)境及設(shè)施要求低、可控性強(qiáng)的優(yōu)勢，是當(dāng)前普遍采用的誘導(dǎo)腸道微生物消耗的有效方法。 抗生素預(yù)處理不僅能實(shí)現(xiàn)FMT 前的腸道清理[24]，還能有效增強(qiáng)異體微生物的定殖能力[25]。 但研究者對(duì)攜帶不同微生物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行抗生素預(yù)處理后，表現(xiàn)出抗生素?cái)_動(dòng)后菌群的個(gè)體間變異[26]；并在不同抗生素單獨(dú)使用后觀察到對(duì)特定類別微生物的特異性改變[27-28]，提示不同抗生素及不同受體在腸道微生物消耗過程中存在個(gè)性化差異，建議選擇由多種抗生素混合的抗生素雞尾酒以實(shí)現(xiàn)腸道微生物的有效消除。 另有研究表明，使用抗生素將促生耐抗生素菌株，并增強(qiáng)病原體的腸道定植力，提升炎癥及感染風(fēng)險(xiǎn)[29]；部分抗生素使用存在毒性反應(yīng)，包括誘發(fā)心血管疾病[30]、破壞血腦屏障[31]，甚至誘發(fā)認(rèn)知障礙[32]等。 因此建議使用被報(bào)道的不可吸收的抗生素，以規(guī)避由抗生素使用造成的額外影響[33]，如若目標(biāo)疾病存在使用抗生素?zé)o法規(guī)避的影響，則考慮采用其他替代方法[34]。 此外，據(jù)報(bào)道，給藥7 d 足以在保證受體腸道微生物耗盡的同時(shí)避免耐抗生素菌的過度生長或耐藥性的產(chǎn)生[35-36]，但不排除部分研究為保證微生物的徹底清除而選擇了更長的給藥時(shí)間。 在給藥方式中，口服灌胃能更好的控制給藥劑量及時(shí)間，但單次給藥能維持的抗生素作用時(shí)間有限；飲用水給藥雖能長時(shí)間維持藥效，但難以確保攝入藥品的劑量，需刻意記錄其飲水量以估算每日攝入抗生素劑量，不適于群居動(dòng)物，還需要考慮抗生素在飲用水中的放置時(shí)間與穩(wěn)定性[37-39]。

基于上述的影響因素，研究人員提出建議：（1）在抗生素選擇方面建議選用被報(bào)道的不可吸收的抗生素類型，以規(guī)避抗生素對(duì)模型動(dòng)物造成的額外影響，并以抗生素雞尾酒的形式配置，以涵蓋更廣泛的目標(biāo)微生物；從整理的結(jié)果來看，氨芐西林、新霉素、甲硝唑及萬古霉素的組合是最廣泛使用的；（2）建議采取間斷重復(fù)灌胃為主，飲用水添加抗生素維持為輔的給藥方式，在保證抗生素?cái)z入量的同時(shí)延長抗生素作用時(shí)間，以更徹底的清除腸道微生物；（3）給藥時(shí)間建議保持在7 ～10 d，在有效清除腸道微生物的同時(shí)盡可能避免產(chǎn)生抗生素毒性。由于當(dāng)前不同報(bào)道中抗生素給藥類型、給藥方式、持續(xù)時(shí)間及劑量等存在差異，基于上述建議研究人員整理了當(dāng)前高質(zhì)量報(bào)道中抗生素使用的配方及細(xì)則，以期為后續(xù)研究者提供參考（見表2）。

表2 抗生素腸道預(yù)處理方案細(xì)則Table 2 Details of the antibiotic enteral pretreatment program

1.2.3 其他替代方式

腸道清潔溶液（bowel cleansing，BC）是臨床腸道檢查常用的腸道清潔方法，但研究發(fā)現(xiàn)BC 溶液使用后，小鼠腸道微生物群同未處理小鼠一樣維持原始狀態(tài)，且異體微生物的定殖效率不及抗生素制備的腸道環(huán)境[92]；又或微生物群的結(jié)構(gòu)和組成在短期內(nèi)發(fā)生變化，但迅速恢復(fù)了初始狀態(tài)[93]。 盡管并不建議使用這樣的處理方式，但在抗生素不適用情況下BC 溶液可作為替代方法，或與抗生素聯(lián)合使用以增強(qiáng)對(duì)腸道微生物的清除效果[94]。 人源化菌群模型是通過移植人類患者的菌群到受體動(dòng)物，使受體動(dòng)物攜帶大部分的人類腸道微生物，以表現(xiàn)出一種或多種疾病特征，模擬疾病發(fā)病狀態(tài)。 該模型是藥物篩選或疾病發(fā)病機(jī)制等需要模擬還原疾病狀態(tài)人類腸道環(huán)境研究的重要工具[95]。 研究表明，當(dāng)前僅約47%的人類腸道菌群可以在小鼠中重建，其中超過1／3 發(fā)生顯著改變[16]；FMT 的療效因跨物種移植中外源性微生物定植受阻而減弱[34]，人類腸道環(huán)境在嚙齒動(dòng)物中的完整重建仍有待后續(xù)研究的深入，如需選擇該模型則應(yīng)當(dāng)明確是否需要建立對(duì)照以對(duì)跨物種移植產(chǎn)生的紊亂作出合理解釋。

1.3 飲食及環(huán)境對(duì)腸道微生物的影響

腸道微生物的組成和比例是動(dòng)態(tài)的，同時(shí)受內(nèi)部（年齡和遺傳背景）和外部（飲食和環(huán)境）因素的影響[96-97]。 通過控制飲食攝入及環(huán)境溫度可以誘導(dǎo)能量消耗、腸道菌群及代謝物的改變[98-101]。 基于飲食-環(huán)境-微生物群間相互作用的復(fù)雜性，研究者在使用相同飲食方案但光暗周期及環(huán)境溫度不同的嚙齒動(dòng)物中觀察到腸道微生物組成的顯著差異，并在每日明暗循環(huán)及季節(jié)變化中觀察到腸道微生物的規(guī)律性改變[102-103]。 因此可考慮使用時(shí)間限制喂養(yǎng)（TRF）將飲食攝入控制在24 h 周期的特定時(shí)間內(nèi)，避免生物鐘改變對(duì)腸道菌群的影響[104]。此外，由于嚙齒類動(dòng)物具有食糞習(xí)性，研究發(fā)現(xiàn)同籠飼養(yǎng)幾周后，微生物相關(guān)表型能夠在共同安置的小鼠間轉(zhuǎn)移，因而要避免將準(zhǔn)備接受來自不同組別供體的受體置于同一飼養(yǎng)區(qū)域[105]。 未來的FMT 臨床前研究當(dāng)謹(jǐn)慎選擇并在報(bào)告中交代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所接受的飲食、環(huán)境（如溫度、濕度以及明／暗循環(huán)），以完整解釋飲食或環(huán)境因素對(duì)結(jié)果的影響。

2 移植前操作

2.1 樣本收集及儲(chǔ)存的建議

采集糞便樣本時(shí)建議先用75%乙醇消毒嚙齒動(dòng)物肛門，然后用無菌棉球輕壓肛門同時(shí)按揉腹部，引起自發(fā)排便后立即將糞便顆粒轉(zhuǎn)移到冰上的無菌離心管或凍存管中；如果無法誘導(dǎo)即時(shí)排便可以將供體動(dòng)物轉(zhuǎn)移到高壓滅菌籠或已消毒的獨(dú)立環(huán)境中，待其自然排便后再立即收集[106-109]。 嚙齒動(dòng)物供體樣本除糞便外還可能涉及腸腔內(nèi)容物，可待動(dòng)物麻醉后直接在厭氧無菌條件下采集[110]。 相較于局部內(nèi)容物而言全腸菌群移植（Wholeintestinal microbiota transplantation，WIMT）能夠相對(duì)完整的重建整個(gè)胃腸道環(huán)境[111]，且來自特定位置的微生物能夠選擇性地定殖到同源區(qū)域，因此當(dāng)需要重建整個(gè)胃腸道微生物狀態(tài)或?qū)δc道不同區(qū)域微生物進(jìn)行靶向分析、干預(yù)時(shí)WIMT 可作為最佳選擇。 上述空間異質(zhì)性提示胃腸道中不同部分間微生物不可相互替代，且其組成及豐度存在差異，據(jù)報(bào)道，與空腸和回腸相比，盲腸、結(jié)腸和糞便中的微生物含量更高，因而多被選擇[112]。 在采集時(shí)間上，基于報(bào)道的嚙齒動(dòng)物24 h 內(nèi)腸道微生物豐度變化規(guī)律，建議在7：00 ～11：00 或15：00 ～17：00 進(jìn)行，以避免晝夜節(jié)律影響樣本成分的穩(wěn)定性[112-113]。

研究表明哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)多數(shù)微生物屬于厭氧菌，在氧氣中暴露將使這些菌群失去活性[114]，為最大限度保留微生物活性，糞便樣本的采集及勻質(zhì)化、過濾等操作需要在厭氧條件下進(jìn)行。 糞便的采集難以在絕對(duì)厭氧的環(huán)境中進(jìn)行，因此建議使用厭氧袋或在裝有二氧化碳的開放式容器中進(jìn)行的半?yún)捬跆幚矸ā?若采集腸腔內(nèi)容物則可當(dāng)動(dòng)物處死后在厭氧室內(nèi)進(jìn)行，并使用脫氧溶液進(jìn)行稀釋和均質(zhì)。

低溫凍存是保持糞便樣本中微生物組成及豐度的有效方式，樣本在采集后及運(yùn)輸過程中需保持4 ℃或臨時(shí)冰上保存，短期保存時(shí)-20 ℃可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其中微生物定殖能力的保護(hù)，如需凍存超過6 個(gè)月則需要-80 ℃儲(chǔ)存，以保證定植能力不受影響[115-117]，但理想模式是采集后1 h 內(nèi)制備并立即移植[118]。 需要強(qiáng)調(diào)的是，凍融循環(huán)比持續(xù)長時(shí)間凍存更傷害微生物活性，如不能持續(xù)低溫凍存，可以暫存于較低溫環(huán)境，避免反復(fù)的凍融循環(huán)。 樣本長期零度以下儲(chǔ)存時(shí)需添加冷凍保護(hù)劑（cryoprotectants，CPA），如15%或20%（v／v）甘油及5%（v／v）二甲基亞砜亦或麥芽糊精與海藻糖混合物（1 ∶3）等[119]，以減少凍融環(huán)節(jié)對(duì)細(xì)胞的損傷，并保持凍存樣本的菌株活性[120]。 此外，凍干樣品能更大限度保持微生物穩(wěn)定性[121]，糞便等分吸管技術(shù)（Fecal Aliquot Straw Technique，F(xiàn)AST）能實(shí)現(xiàn)不解凍情況下的二次取樣[122-123]，研究者可持續(xù)關(guān)注新報(bào)道的方法以選擇成本及設(shè)施范圍內(nèi)的最佳儲(chǔ)存方案。

2.2 移植材料制備的建議

制備移植材料時(shí)樣本需先稀釋并過濾后，再按照比例懸浮在磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）中靜置沉淀，然后以預(yù)設(shè)參數(shù)反復(fù)離心[124-127]，制備完成后應(yīng)立即進(jìn)行移植（圖1）。 為避免微生物成分在移植前發(fā)生改變，建議在移植前10 min 臨時(shí)制備移植材料，以保證最短的氧氣暴露時(shí)間。 如果不具備新鮮制備條件，可以將新鮮樣本立即制成移植材料然后低溫凍存，至使用時(shí)再解凍[126]。 本文回顧了近年的相關(guān)研究，在移植材料的制備過程中盡管具體配置比例及離心參數(shù)有所不同，但大致步驟相似，研究人員總結(jié)了其中相對(duì)完整的操作方案以供參考（表3）。

圖1 糞菌移植的關(guān)鍵步驟Figure 1 Critical steps in fecal bacteria transplantation

表3 糞菌移植前關(guān)鍵操作細(xì)則Table 3 Details of key operations before fecal bacteria transplantation

3 移植途徑的選擇

口服灌胃或灌腸給藥是嚙齒動(dòng)物FMT 最為常見的移植途徑（圖1），口服灌胃給藥因具有給藥量可控且無需麻醉的優(yōu)勢而更廣泛采用，移植時(shí)通過彎頭灌胃針將移植材料注入受體胃內(nèi)，以盡可能避免與氧氣的接觸，保持厭氧菌活性。 通?？梢赃x擇每天給予受體動(dòng)物100 ～200 μL 的移植材料，持續(xù)7 ～ 14 d 以確保異體腸道微生物的成功定植[150-151]；亦可選擇集中連續(xù)給藥3 d，而后每隔1 d 給藥1 次，能達(dá)到同等的移植效果[152-153]。 不同報(bào)道中移植材料的使用量存在差異，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的建議是根據(jù)每10 g 體重給予0.1 mL 液體（微生物移植或生理鹽水）的比例個(gè)性化給藥[108]，或明確將每只受體動(dòng)物每日接受的移植量控制在200 μL（108CFU／mL）內(nèi)[112，154]。 肛門給藥時(shí)將涂抹石蠟油的置入管輕插入肛門，再把加熱到體溫的懸浮液緩慢注入，拔下置入管后用棉簽按壓肛門處，并倒置動(dòng)物1 min，防止液體流出[155-156]。 研究表明，灌腸給藥在壞死性結(jié)腸炎等相關(guān)腸道疾病中可以更好的發(fā)揮減輕炎癥等作用[157]，研究者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適宜的移植途徑。 報(bào)道中亦有通過將移植材料涂抹于受體動(dòng)物皮毛等基于接觸共生環(huán)境中微生物接受定植的方式，但這類方式無法明確攝入量且無法實(shí)現(xiàn)微生物群的完整傳遞[75，158-159]，在結(jié)果解釋上或存在疑慮。 人類FMT 往往需要多輪移植來保證定值效果，但相對(duì)無菌條件下的受體動(dòng)物是否同樣需要多輪移植尚無定論，通常認(rèn)為當(dāng)目標(biāo)微生物較為復(fù)雜時(shí)，建議進(jìn)行一輪以上的定植以保證定殖效率。 亦或者通過熒光染色、16S rRNA 全長測序等方式對(duì)其定植情況進(jìn)行監(jiān)測[160]，以保證成功移植。

4 展望

一篇關(guān)于洗滌菌群移植（washed microbiota transplantation，WMT）的報(bào)道[161]基于智能化糞菌分離系統(tǒng)及嚴(yán)格質(zhì)控相關(guān)漂洗過程的概念，通過以具體菌群數(shù)量作為精確劑量的衡量依據(jù)，并且通過自動(dòng)凈化系統(tǒng)去除了大部分病毒及促炎物質(zhì)，在量化和質(zhì)控移植材料、提高治療安全性等方面將未來FMT 研究引入機(jī)械化精度把控時(shí)代。 研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群產(chǎn)生的脂質(zhì)能夠進(jìn)入循環(huán)并控制與微生物組成相關(guān)的表型變化，同時(shí)能顯著影響包括炎癥信號(hào)在內(nèi)的多種信號(hào)通路[162]，未來腸道微生物源脂質(zhì)的應(yīng)用或能通過靶向特定受體調(diào)控信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)針對(duì)性個(gè)性化治療，同時(shí)有效避免病原體的伴隨轉(zhuǎn)移。 基于當(dāng)前對(duì)FMT 后微生物定植規(guī)律的不明晰，IANIRO 等[163]發(fā)表的一項(xiàng)分析供體菌株植入率與療效關(guān)系的研究提出，建立可預(yù)測FMT 后菌株定植情況的機(jī)器學(xué)習(xí)模型，能夠幫助選擇最匹配受體的菌群供體，提示在未來研究中通過智能算法的廣泛應(yīng)用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)FMT 后受體腸道菌群的精準(zhǔn)預(yù)測，以確定最佳供體。 此外，未來若能基于機(jī)器學(xué)習(xí)等手段預(yù)測藥物成分-腸道微生物-宿主間的復(fù)雜作用，或能有效助力化學(xué)結(jié)構(gòu)及調(diào)控機(jī)制網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜的藥物作用機(jī)制的闡釋、應(yīng)用思路的拓展[164-165]

5 總結(jié)

基于當(dāng)前FMT 臨床前研究的報(bào)道中實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)的高度不一致，亟需標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)指導(dǎo)。 本文回顧并討論了FMT 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟細(xì)節(jié)，其目的在于提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、耗材及勞動(dòng)力等因素的利用率，其中部分是基于當(dāng)前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，其他則是綜合參考了評(píng)議性文章[166-167]。 受限于回顧的文獻(xiàn)以小鼠為目標(biāo)對(duì)象，以上提及的方法學(xué)建議或存在偏倚，期待更多關(guān)于FMT 臨床前研究方法學(xué)建議的文章，并最終提出“黃金標(biāo)準(zhǔn)”的方法學(xué)指導(dǎo)。