歐雪，余志杰，何瑤，鄭曉媛?

（1. 重慶大學(xué)醫(yī)學(xué)院，重慶 400030；2. 重慶市第四人民醫(yī)院，重慶市急救醫(yī)療中心藥劑科，重慶 400014）

世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）將皮膚創(chuàng)傷定義為全球性公共問題，特別是需要長期治療的慢性傷口，給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[1-2]。 隨著人口老齡化加劇，以及糖尿病和肥胖的影響，慢性創(chuàng)面的患病率不斷升高[3]。 面對該流行趨勢，迫切需要研究人員對其致病機制進行深入研究，動物模型則成為研究發(fā)病機制及治療靶點的主要工具，能彌補在細(xì)胞實驗水平缺乏的整體效應(yīng)影響，為研究人員在整體水平研究皮膚創(chuàng)傷提供了可行性。 目前，皮膚創(chuàng)傷動物模型的構(gòu)建主要以物理方法為主，如由物理因素造成的機械性損傷（擦傷、切割傷、刺傷、撕裂傷、咬傷、碾壓傷）、溫度性損傷（燒傷、燙傷、凍傷）、壓力性損傷和放射性損傷。 而不同的物理方法構(gòu)建的動物模型其生物學(xué)特點有所差異。 因此，本文基于物理方法皮膚創(chuàng)傷動物模型的構(gòu)建方法與評價指標(biāo)，總結(jié)分析不同動物模型的優(yōu)缺點，從而為構(gòu)建科學(xué)合理的皮膚創(chuàng)面動物模型以及研究促進創(chuàng)面愈合的新療法提供參考意義。

1 小鼠模型及評價指標(biāo)

1.1 小鼠全層皮膚創(chuàng)面模型

目前，構(gòu)建小鼠全層皮膚創(chuàng)面模型主要采用近交系C57BL／6 及BALB／c 品系小鼠，通過活檢穿孔器或手術(shù)剪刀切除小鼠背部或后腿部分皮膚，從而制造1 ～6 個3 ～10 mm 直徑的圓形創(chuàng)面[4-8]。 值得注意的是，當(dāng)創(chuàng)面直徑太小時，其傷口愈合時間越短、愈合速度越快，不利于需要長期觀察處理因素對傷口愈合的研究。 小鼠耳部皮膚相對較薄，制造1 mm 深至軟骨的小傷口，可在1 周后變?yōu)槿珜涌祝摬课皇芎粑\動的影響較小，容易觀察血管再生和傷口的愈合情況[9]。 另外，不同部位的創(chuàng)面其收縮程度不同，尾部與背部皮膚相比收縮程度更高，多依賴于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化使傷口閉合，其愈合時間較長，約21 d 才能完全愈合[10]。 同時尾部沒有致密的毛發(fā)，無需進行剃毛處理。 此外，由于裸鼠存在明顯的免疫功能缺陷特點且無毛發(fā)覆蓋，表現(xiàn)出嚴(yán)重的創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，造模成功率較高且能夠動態(tài)的可視化傷口愈合情況，也常作為皮膚創(chuàng)面模型動物，但其傷口愈合時間較長[11-12]。

小鼠全層皮膚創(chuàng)面模型主要通過對不同時間點的創(chuàng)面圖像分析， 利用組織病理檢查（histopathology examination， HPE） 和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）法評價創(chuàng)面微環(huán)境炎性細(xì)胞浸潤及非炎性細(xì)胞遷移增殖分化程度，再通過定量分析炎癥因子如干擾素（interferon，IFN）-γ、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、 IL-10，生長因子如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（ttransforming growth factor，TGF ）-β1、 基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶 （ matrix metalloproteinases，MMP）、CXC 趨化因子等指標(biāo)的表達水平，綜合評價模型的成功與否。 其通常在傷后12 h 炎性細(xì)胞開始浸潤傷口；24 h 內(nèi)上皮開始增厚；48 h 內(nèi)整個傷口表面開始發(fā)生再上皮化；5 d 新生血管生成；7 d 炎性細(xì)胞減少、實現(xiàn)完全上皮化；10 d 傷口完全愈合[4-6，8]。

1.2 小鼠切除性傷口夾板模型

人類皮膚傷口的愈合過程與小鼠不同，人類主要通過表皮再生促進傷口愈合，而小鼠則主要通過收縮反應(yīng)[13]。 為克服這一問題建立切除性傷口夾板模型。 該類模型通常選擇內(nèi)徑大于或等于創(chuàng)面直徑的環(huán)形塑料或硅膠夾板固定在傷口周圍，用強力膠或醫(yī)用粘合劑粘附，5-0 號尼龍線以間斷縫合的方式固定，從而保證其在傷口位置的長時間固定，直至傷口愈合[14-18]。 切除性傷口夾板模型小鼠普遍存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，尤其是糖尿病小鼠的傷口炎癥則更為明顯，并且傷口容易感染且分泌物較多[19]。 因此在模型構(gòu)建成功后多選擇Tegaderm 透明敷料覆蓋傷口，防止細(xì)菌感染和傷口干燥，同時該透明敷料也便于創(chuàng)面愈合情況的觀察。 此外，為避免小鼠轉(zhuǎn)頭咬斷縫合線，也可使用硅膠背心或醫(yī)用繃帶進一步包扎[17，20]。

此類模型已用于評估微移植物技術(shù)、細(xì)胞療法或機制研究對傷口愈合的效力[21-23]。 愈合初期炎癥階段，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞數(shù)量顯著增加；增殖階段主要以CD31、CD34、Ki67、α-平滑肌動蛋白（smooth-muscle actin，SMA）、收縮上皮長度和再生上皮長度為指標(biāo)評估創(chuàng)面血管生成、肉芽組織形成及再上皮化程度；MMP 活性常用來評價細(xì)胞外基質(zhì)向瘢痕組織的重塑[14-18，20-23]。

1.3 小鼠皮膚移植模型

大面積皮膚創(chuàng)傷模型主要采用真皮模板、同種和異種皮膚移植、細(xì)胞片移植至裸鼠或免疫缺陷小鼠全層皮膚創(chuàng)面模型[24-27]。 該類小鼠由于缺乏T淋巴細(xì)胞、無胸腺，具有免疫功能缺陷的特點，因此對移植物的耐受性較好、移植排斥風(fēng)險更低[25，28]。臨床上常用真皮模板修復(fù)皮膚，其可通過創(chuàng)造一個適合宿主細(xì)胞滲透和生成新真皮的微環(huán)境來取代受損的真皮，同時能抑制傷口收縮、減少瘢痕形成和纖維化。 目前，同種和異種皮膚移植也應(yīng)用較廣，通?？蛇x擇中厚度或全厚度皮膚，前者愈合速度、血管重建快，僅需7 周時間就能脫去缺血結(jié)痂，而后者至少需12 周，但全厚度皮膚能更好的概括人類皮膚的完整結(jié)構(gòu)[25-26]。 此外，也有學(xué)者選擇人上皮細(xì)胞片移植以評估工程細(xì)胞片保存技術(shù)，其能完全覆蓋創(chuàng)面、保存良好的細(xì)胞外微環(huán)境減少細(xì)胞凋亡，但移植前需花數(shù)周才能產(chǎn)生可移植物，耗時較長[27]。 此類模型多采用肉眼觀察表皮變化、炎性細(xì)胞浸潤及促（抗）炎因子表達、血管生成和移植物存活率等指標(biāo)進行評價[25-28]。

1.4 小鼠潰瘍模型

潰瘍屬于慢性傷口，其具有時間長、過度炎癥反應(yīng)、持續(xù)性感染及耐藥微生物生物膜形成等特點[29]。 目前，有學(xué)者通過結(jié)扎髂外動脈及切除股淺動脈誘導(dǎo)后肢缺血，再制造膝關(guān)節(jié)下全層創(chuàng)面以構(gòu)建足潰瘍模型[30]；或是用兩個圓形磁鐵夾住小鼠背部皮膚12 h，取下磁鐵使血液正常流通12 h 以構(gòu)建壓力性潰瘍模型[31]。 該模型與全層創(chuàng)面模型相比創(chuàng)面愈合率明顯更低，愈合速度更慢，14 d 仍有結(jié)痂，無法實現(xiàn)完全愈合，可用于研究慢性傷口愈合過程中各個階段相關(guān)參數(shù)的變化，如再上皮化百分率、上皮厚度指數(shù)、角質(zhì)化、肉芽組織厚度和瘢痕抬高指數(shù)（scar elevation index，SEI）等[29-31]。

1.5 小鼠燒傷模型

小鼠燒傷創(chuàng)面模型采用沸水燙、紫外照射等物理損傷方式構(gòu)建。 目前，多采用92 ～100℃水在小鼠背部燙傷，從而制造2 ～4 個燒傷創(chuàng)面或全身20%燙傷[32-33]。 該方法具有燙傷溫度和面積容易控制的優(yōu)點，并且其作用均勻、重復(fù)性好、模型穩(wěn)定。 另外，WONG 等[34]選擇C57BL／6 小鼠和受傷或燒傷后可完全再生皮膚的非洲刺毛鼠（Acomys），將其暴露于200 mJ／cm2的紫外線照射以構(gòu)建小鼠燒傷模型。 48 h 急性紫外照射導(dǎo)致C57BL／6 小鼠表皮厚度增加及明顯的炎癥反應(yīng)，此時角蛋白（keratin，K）14 表達水平顯著高于K10，角質(zhì)形成細(xì)胞處于快速增殖狀態(tài)，而Acomys形成了K14＋／K10＋雙陽性中間層，使得角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生快速分化和凋亡，且無表皮增生和炎癥反應(yīng)，從而實現(xiàn)傷口的快速愈合。 小鼠燒傷模型伴有極少或不出血的特點，可避免止血過程，其主要用于探究細(xì)胞療法促進皮膚組織再生的相關(guān)機制，通常以CD31、α-SMA、K10、K14 為指標(biāo)評價血管生成能力和角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖情況[32-33]。

1.6 小鼠線性創(chuàng)傷模型

線性創(chuàng)傷模型多在小鼠背部或腹部，利用手術(shù)刀對皮膚進行切割以產(chǎn)生線性切口，長度以2 cm 左右為宜，深達筋膜。 此類模型可用于分析經(jīng)皮給藥的藥物治療效果評價[35]。 該模型以創(chuàng)面抗張力強度（tension strength，TS）、瘢痕強度、HE 染色、血液分析為評價指標(biāo)及方法，但不適于組織病理學(xué)與生化學(xué)指標(biāo)的觀察。

其具體造模方法見表1。

表1 小鼠皮膚創(chuàng)面模型的構(gòu)建及評價方法Table 1 Construction and evaluation methods of mouse skin wound model

2 大鼠模型及評價指標(biāo)

2.1 大鼠全層皮膚創(chuàng)面模型

大鼠在生理學(xué)、形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)上都比小鼠更接近人類，因此大鼠成為生物醫(yī)學(xué)的更理想研究動物[36]。 目前，構(gòu)建大鼠全層皮膚創(chuàng)面模型主要采用封閉群Wistar 及SD 白化大鼠，通過無菌活檢穿孔器、手術(shù)剪刀或金屬沖頭切除大鼠背部局部皮膚構(gòu)建創(chuàng)面。 由于大鼠體型較大，因此，可制造1 ～6 個6 ～40 mm 直徑的圓形創(chuàng)面，但其創(chuàng)面愈合時間、模型穩(wěn)定性、最終取材量普遍高于小鼠[37-42]。 其具體造模方法見表2，一般造模后7 d 內(nèi)主要處于炎癥階段，7 ～14 d 主要表現(xiàn)為細(xì)胞增殖階段，第7 天開始細(xì)胞外基質(zhì)重塑，完全愈合的時間受創(chuàng)面大小、位置、造模方式等因素影響[37-41]。 例如，為模擬慢性傷口不同程度的局部組織缺血，通過在大鼠皮下放置硅膜或玻璃蓋玻片的方法顯著延遲傷口的愈合[43-44]。 目前，此模型主要用于評估不同的藥物制劑、納米材料及細(xì)胞療法對傷口愈合的促進作用[45-48]。

表2 大鼠皮膚創(chuàng)面模型的構(gòu)建及評價方法Table 2 Construction and evaluation methods of rat skin wound model

2.2 大鼠燒傷模型

通過熱金屬燙傷、電子束照射等物理損傷大鼠背部或臀部構(gòu)建燒傷創(chuàng)面模型[49-50]。 采用金屬燙傷方法其操作簡單易行且燙傷面積便于控制，但存在金屬塊接觸燙傷區(qū)域的壓力難以控制、燙傷深度誤差較大的缺點。 而電子束照射則無需直接接觸致傷源，有效消除了這一影響，并且該方法在麻醉或者清醒狀態(tài)下均可進行，且無需剃毛，約1 周會發(fā)生脫毛現(xiàn)象，2 周出現(xiàn)大片干性皮膚脫皮，3 周皮膚變濕潤并有毛囊和紅斑出現(xiàn)[49]。 目前，燒傷模型已用于評估新型水凝膠和富氫水促進燒傷創(chuàng)面愈合的相關(guān)機制研究，通常造模1 周內(nèi)IL-6 顯著增加，直到第4 周表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和超氧化物歧化酶（superoxide，SOD）表達水平逐漸升高，丙二醛（malon-dialdehyde，MDA）含量則呈下降趨勢，5 周可實現(xiàn)傷口完全愈合[49-50]。

2.3 大鼠口腔潰瘍模型

主要通過金屬球和30%冰醋酸浸泡的玻璃管按壓下牙齦或上顎以構(gòu)建口腔潰瘍模型[8，51]。 口腔與皮膚組織不同，在愈合過程中表現(xiàn)出較少的炎癥反應(yīng)，一般約12 d 恢復(fù)[51]。 由于口腔潰瘍病因復(fù)雜，發(fā)病機制不明，臨床上尚無特效治療藥物，因此該模型可用于探究治療口腔潰瘍的創(chuàng)新療法。

3 其他動物模型及評價指標(biāo)

兔全層皮膚創(chuàng)面模型的構(gòu)建多選1.5 ～2.5 kg 的新西蘭白兔，通過手術(shù)刀或剪刀切除背部皮膚，制造6 ～20 mm 的圓形或方形創(chuàng)面。 創(chuàng)面形狀不同對應(yīng)的麻醉方式也不同，通常圓形創(chuàng)面采用肌肉注射鹽酸氯胺酮和賽拉津[52-53]，而方形創(chuàng)面則于4 個頂角皮下注射利多卡因[54]。 兔耳皮膚緊致毛發(fā)少，具有較多神經(jīng)和血管，常于腹側(cè)制造6 ～8個7 ～15 mm 圓形創(chuàng)面，由于3 周內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著增加、膠原蛋白過度沉積、慢性炎癥引起SEI顯著增高，從而導(dǎo)致兔耳肥厚瘢痕，形成兔耳增生性瘢痕模型。 因此該模型常作為研究皮膚疤痕形成的細(xì)胞分子機制的首選模型[53，55-58]。

豬全層皮膚創(chuàng)面模型采用大型白色雜交豬、約克夏豬、皮特蘭豬，這類大型動物需在全麻情況下先繪制出傷口圖案，再通過無菌手術(shù)刀于背部單側(cè)或雙側(cè)制造6 ～20 個邊長20 ～50 mm 方形全層創(chuàng)面[59-61]。 豬皮膚的表皮、厚度、毛囊密度、皮脂腺等與人類皮膚相似，被認(rèn)為是與人類皮膚進行比較的最佳實驗?zāi)Ｐ?，但出于其不同位置收縮程度不同的特點，制造創(chuàng)面時必須嚴(yán)格依照標(biāo)準(zhǔn)化程序操作[62-63]。 因此，KUO 等[64]選擇體型、體重和生理狀態(tài)與人相似的小型蘭嶼豬，在背部兩側(cè)的不同位置制造創(chuàng)面陣列，建立最佳創(chuàng)面大小和相鄰創(chuàng)面最小距離的黃金標(biāo)準(zhǔn)，以有效區(qū)分各種干預(yù)措施，證實了背部皮膚的傷口位置不會顯著影響傷口的閉合或收縮。 此類模型可用于精確篩選不同創(chuàng)面敷料、細(xì)胞治療和藥物的有效性。

羊全層皮膚創(chuàng)面模型多選擇綿羊，在局部麻醉下，采用無菌手術(shù)刀片和方形導(dǎo)向器在背部制造1 ～4 個等距、邊長20 ～40 mm 方形創(chuàng)面。 一般需在致傷前1 個月進行驅(qū)蟲處理[65-66]。 然而，目前綿羊模型更偏向于骨骼、韌帶和肌腱方面的創(chuàng)傷研究，對皮膚創(chuàng)傷愈合的研究較少。

大型非嚙齒類動物模型造模后出血量較多，1 ～2 周內(nèi)處于出血和炎癥階段且通常伴有大量滲出液，需定時更換傷口敷料[59-66]；2 ～3 周可觀察到新生肉芽組織形成、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和角質(zhì)形成細(xì)胞再上皮化；2 個月基本可實現(xiàn)再上皮化和傷口完全閉合，但仍存在輕微炎癥；6 個月皮膚的細(xì)胞外基質(zhì)重塑程度和拉伸強度仍未恢復(fù)到正常水平，若要實現(xiàn)完全恢復(fù)需一年或更長時間[52-66]。 詳見表3。

表3 其他動物皮膚創(chuàng)面模型的構(gòu)建及評價方法Table 3 Construction and evaluation methods of other animal skin wound models

4 總結(jié)與討論

大小鼠價格相對低廉、易獲取，而大型動物成本高、飼養(yǎng)難，且皮膚創(chuàng)傷的操作過程及麻醉要求相對較高，因此常選擇大小鼠作為研究皮膚創(chuàng)傷的模型動物。 大小鼠全層皮膚創(chuàng)傷動物模型的構(gòu)建與其他模型相比操作簡單、周期短、成模率較高，是探究皮膚創(chuàng)面愈合相關(guān)機制最常用的創(chuàng)傷模型。而切除性傷口夾板模型、皮膚潰瘍、移植模型和大型動物模型則耗時較長，需考慮夾板的縫合、控制缺血方式的選擇、移植物的準(zhǔn)備及保存等問題，并且由于存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和滲出物較多的特點，需定時更換敷料以保持傷口濕潤以及防止細(xì)菌感染。 但此類模型能夠更好地克服傷口收縮以模擬人表皮再生過程，常用于評估不同細(xì)胞療法對傷口愈合的效力。 通過紫外和電子束照射構(gòu)建的燒傷模型具有燙傷面積易控制、無需直接接觸致傷源的優(yōu)點，能夠有效減少金屬燙傷導(dǎo)致深度誤差較大的缺點，該模型可應(yīng)用于臨床常見的燒傷患者和輻射燒傷患者皮膚創(chuàng)面愈合的相關(guān)研究。 大鼠口腔潰瘍模型是推動人類口腔內(nèi)傷口愈合相關(guān)機制研究的關(guān)鍵一環(huán)，然而按壓金屬球和30%冰醋酸浸泡的玻璃管誘導(dǎo)的口腔潰瘍模型與臨床的口腔潰瘍?nèi)杂幸欢ǖ牟町?，因此如何更好地模擬構(gòu)建臨床口腔潰瘍模型仍需進一步的探索。

物理方法構(gòu)建的皮膚創(chuàng)傷動物模型方法多樣，制造的創(chuàng)面沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，通常為急性傷口，愈合時間較短且伴隨正常的炎癥反應(yīng)，無其它的潛在影響因素。 而臨床上多為慢性傷口（如血管性潰瘍、糖尿病足潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍、壓力性潰瘍），影響因素復(fù)雜多樣，常表現(xiàn)為嚴(yán)重的炎癥風(fēng)暴、細(xì)胞增殖較少、促生長因子表達較低，且常伴有細(xì)菌的感染?？梢姡ㄟ^物理方法構(gòu)建的皮膚創(chuàng)傷動物模型與臨床患者的皮膚創(chuàng)傷微環(huán)境仍有一定的區(qū)別。 因此，下一步研究應(yīng)聚焦于如何構(gòu)建更加符合臨床皮膚創(chuàng)傷復(fù)雜微環(huán)境的動物模型，可通過移菌方式、皮膚移植、基因敲除鼠、物理化學(xué)協(xié)同誘導(dǎo)等方式構(gòu)建多因素誘導(dǎo)的復(fù)合創(chuàng)傷模型，從而為開發(fā)促進皮膚創(chuàng)傷愈合的藥物研究、新療法提供參考依據(jù)。

此外，皮膚創(chuàng)傷動物模型的評價方法和指標(biāo)，主要通過采集圖像進行傷口愈合過程中形態(tài)學(xué)分析，同時觀察炎性細(xì)胞浸潤程度、炎癥因子（IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10）及生長因子（VEGF、EGF、TGFβ1）的表達水平、細(xì)胞增殖Mark 蛋白（CD31、CD34、Ki67、PCNA、α-SMA、K10、K14）表達、細(xì)胞外基質(zhì)重塑（MMP-1／2／9、Collagen-3、SEI）共同評價皮膚創(chuàng)傷模型及藥效指標(biāo)。 然而，目前皮膚創(chuàng)面的圖像采集只限于某個時間點，無法動態(tài)監(jiān)測記錄傷口的愈合過程，因此，創(chuàng)面愈合過程的動態(tài)可視化圖像采集仍存在挑戰(zhàn)和難點，如何通過微型生物傳感器、顯微成像儀等設(shè)備技術(shù)，研究可定量化創(chuàng)面面積、可視化創(chuàng)面圖像、動態(tài)化監(jiān)測創(chuàng)面菌群變化設(shè)備仍需做進一步思考與探索，以確保皮膚創(chuàng)傷動物模型評價指標(biāo)的科學(xué)化和精準(zhǔn)化。

總之，目前皮膚創(chuàng)傷模型的構(gòu)建仍處于探究階段，動物模型無法完全模擬人類皮膚傷口的愈合過程，與臨床患者相比仍有較大差異。 研究人員應(yīng)根據(jù)動物品系多樣性、造模方法優(yōu)缺點、評價指標(biāo)的選擇性以及操作的可行性，充分結(jié)合研究目的，科學(xué)合理的選擇最優(yōu)的皮膚創(chuàng)傷動物模型構(gòu)建方法，旨在構(gòu)建更符合臨床皮膚創(chuàng)面微環(huán)境的動物模型，為促進創(chuàng)面愈合的新療法、新材料、新藥物研究提供參考依據(jù)。