劉路，皮璟漁，余永紅，劉小輝，胡紅剛，梁國(guó)東

江西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心 （江西南昌 330000）

現(xiàn)代生活強(qiáng)度高、節(jié)奏快，許多人或因長(zhǎng)期體 力勞動(dòng)，或因長(zhǎng)期對(duì)著電腦及手機(jī)，身體處于亞健康狀態(tài)，并伴肩頸、腰椎、關(guān)節(jié)等疼痛。為緩解此類癥狀，一般選擇貼膏劑藥物和貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品。此兩類產(chǎn)品省時(shí)、方便、見(jiàn)效快，市場(chǎng)前景廣闊。其中貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品包括醫(yī)用冷敷貼、遠(yuǎn)紅外貼、穴位刺激貼、降溫貼、熱療貼、熱灸貼等，屬于第一類醫(yī)療器械。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局于2021 年12 月組織修訂的《第一類醫(yī)療器械產(chǎn)品目錄》[1]中明確強(qiáng)調(diào)，該類醫(yī)療器械產(chǎn)品中不能含有中藥（薄荷、麝香、肉桂、艾葉等）、化學(xué)藥物（水楊酸、水楊酸甲酯、布洛芬、鹽酸利多卡因等）、生物制品（血清白蛋白、細(xì)胞因子、酶、干擾素等）、消毒和抗菌成分（次氯酸、鹽酸奧替尼啶、苯扎溴銨等）、天然植物（洋甘菊、百里香、薄荷腦、薄荷醇等）及其提取物等發(fā)揮藥理學(xué)、免疫學(xué)、代謝作用的成分或者可被人體吸收的成分?；颊呷魧?duì)產(chǎn)品成分潛在風(fēng)險(xiǎn)不了解，長(zhǎng)期大量使用、錯(cuò)誤使用可能會(huì)產(chǎn)生許多不良反應(yīng)，嚴(yán)重?fù)p傷機(jī)體的生命系統(tǒng)，威脅患者的生命安全[2-5]。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定其非法添加化學(xué)成分（如雙氯酚酸鈉、潑尼松、萘普生、布洛芬、吲哚美辛、保泰松、氫化可的松、酮洛芬、醋酸潑尼松、對(duì)乙酰氨基酚等）的報(bào)道較多[6-10]，但對(duì)水楊酸甲酯含量測(cè)定的報(bào)道較少。查詢相關(guān)文獻(xiàn)，水楊酸甲酯的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[11，15-16]和氣相色譜法[12-13]，且多針對(duì)藥品，包括橡膠膏劑[11-12]、藥油[13]、軟膏[14-15]、片劑、膠囊劑等[16-18]，但關(guān)于高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的報(bào)道較少。

目前針對(duì)腰腿疼痛有活血化瘀、消腫止痛的貼膏劑和貼敷類醫(yī)療器械。而貼敷類醫(yī)療器械基質(zhì)復(fù)雜，多含有粘貼層，膠狀物成分不明，一般包括醫(yī)用壓敏膠和遠(yuǎn)紅外陶瓷粉，氣相、液相色譜法檢測(cè)易出現(xiàn)假陽(yáng)性。本研究以貼敷類醫(yī)療器械為對(duì)象，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測(cè)定，利用色譜的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜的高選擇性，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的分離、確認(rèn)和定量分析，旨在為敷貼類醫(yī)療器械的市場(chǎng)監(jiān)督管理提供技術(shù)支持與參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC-XEVO-TQD 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司，配置電噴霧離子源ESI）、ME5 超微量電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]， BT25S 電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，CLXXUVFM2 超純水器（威立雅集團(tuán)上海公司），HH-8 恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司）。

水楊酸甲酯對(duì)照品（純度100.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇（質(zhì)譜純，Honeywell公司）；甲醇（色譜純，Honeywell公司）；氨水（質(zhì)譜純，Aladdin 公司），實(shí)驗(yàn)用水為符合GB/T 6682-2008 的二級(jí)水。

供試樣品為各大藥房和網(wǎng)絡(luò)購(gòu)買(mǎi)所得貼敷類醫(yī)療器械。

1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品0.01 g（精確至0.01 mg），置于10 ml 棕色容量瓶中，加色譜純甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 mg/ml 的對(duì)照儲(chǔ)備溶液。分別取適量對(duì)照儲(chǔ)備溶液于10 ml 棕色容量瓶中，用色譜純甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得1～100 μg/ml 水楊酸甲酯對(duì)照系列溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 供試品溶液的制備

取樣品1 貼，撕開(kāi)粘貼層，貼在定量濾紙上，用剪刀裁去多余濾紙，然后將樣品剪成0.5 cm×0.5 cm的小片，置于150 ml 燒瓶中，加入色譜純甲醇40 ml，置于恒溫水浴鍋內(nèi)70℃連續(xù)回流2 次，每次2 h；合并浸提液并用色譜純甲醇分3 次沖洗燒瓶，再用色譜純甲醇定容至100 ml 容量瓶，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析，同法制備空白溶液進(jìn)行比較。

1.3.2 儀器條件

液相色譜條件：WATERS ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A 為0.05%氨水，B 為質(zhì)譜純甲醇，按表1 進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.2 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl；柱溫為40 ℃。 質(zhì)譜條件：電離方式為電噴霧電離負(fù)離子模式、質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)、毛細(xì)管電壓為2.50 kV、脫溶劑溫度為500 ℃、脫溶劑氣流為1000 L/h，其他參數(shù)見(jiàn)表2。

表1 UPLC 流動(dòng)相梯度洗脫程序

表2 水楊酸甲酯的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

將質(zhì)量濃度為10 μg/ml 的水楊酸甲酯對(duì)照溶液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描和二級(jí)質(zhì)譜轟擊，以目標(biāo)物的分子離子和豐度較強(qiáng)、干擾較小的子離子組成離子對(duì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。同時(shí)對(duì)特征離子及離子間的豐度比作定性分析、豐度最高的特征離子作定量分析，以提高方法的準(zhǔn)確性和專屬性。質(zhì)譜的錐孔電壓和碰撞對(duì)目標(biāo)物的裂解起著重要作用，因此重點(diǎn)優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和碰撞能，以進(jìn)一步提高該方法的靈敏度。實(shí)測(cè)水楊酸甲酯在8.12 min處出現(xiàn)色譜峰，響應(yīng)的MRM 母離子為151 m/z，子離子為91 m/z、121 m/z，選取91 m/z 為定量離子、121 m/z為定性離子，碰撞電壓為18 eV，錐孔電壓為26 eV。

2.2 色譜參數(shù)的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)從靈敏度、分離效果、分析時(shí)間、峰形方面綜合考慮BEH C8 柱、 C18 柱，最終選擇BEH C18 柱。流動(dòng)相的選擇中，觀察乙酸銨（2 mmol/L、10 mmol/L）-甲醇、乙酸銨（2 mmol/L、10 mmol/L）-乙腈、甲酸水（0.05%、0.10%）-甲醇、氨水（0.05%、0.1%、0.2%）-甲醇等多個(gè)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在酸性環(huán)境下，對(duì)水楊酸甲酯的電離具有抑制作用，導(dǎo)致質(zhì)譜沒(méi)有響應(yīng)，需使用堿性試劑提高離子化效率、增加信號(hào)強(qiáng)度，故采用氨水-甲醇系統(tǒng)。通過(guò)考察不同濃度的氨水（0.05%、0.1%、0.2%）發(fā)現(xiàn)氨水濃度為0.05%時(shí)，水楊酸甲酯的峰形、響應(yīng)值均較好，選擇0.05%氨水-甲醇作為流動(dòng)相。鑒于堿性流動(dòng)性對(duì)儀器的損傷較大，分析0.20、0.25、0.30 ml/min 的流速后，采用0.2 ml/min 的流速。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

取“1.2 項(xiàng)下的對(duì)照品溶液的制備”的溶液，按“1.3.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，水楊酸甲酯定性和定量離子對(duì)的MRM 圖見(jiàn)圖1。取陽(yáng)性樣品、空白樣品分別按照“1.3.1”項(xiàng)下方法制備，按“1.3.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，陽(yáng)性樣品、空白樣品的定性和定量離子對(duì)的MRM 圖分別見(jiàn)圖2～3。從圖1、圖2 中可以看出，對(duì)照品和陽(yáng)性樣品的峰型對(duì)稱、尖銳，分離度良好，基線較為平穩(wěn)，且陽(yáng)性樣品中的定性離子、定量離子的保留時(shí)間及離子豐度比均與對(duì)照品的保留時(shí)間、離子豐度比一致，則予以確認(rèn)含有同一物質(zhì)。從圖3 中可看出，空白樣品的定性和定量離子出峰時(shí)間、離子豐度比均不一致，則不予確認(rèn)，表明該方法專屬性較強(qiáng)。

圖1 對(duì)照品定性和定量離子對(duì)的MRM 圖

圖2 陽(yáng)性供試品定性和定量離子對(duì)的MRM 圖

2.3.2 線性關(guān)系考察

配制質(zhì)量濃度為1 、2、4、6、8、10、20、50、80、100 μg/ml 水楊酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按“1.3.2”測(cè)定，以定量離子的峰面積值對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，線性方程為y=0.50307x+191.14（r=0.9997），結(jié)果表明，相關(guān)系數(shù)r>0.999，水楊酸甲酯 1～100 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 檢出限

UPLC-MS/MS 使目標(biāo)物的精確質(zhì)量數(shù)提取，基線噪音很低，信噪比一般較大，因此本實(shí)驗(yàn)不選擇S/N 為3∶1 的濃度作為化合物檢出限，S/N 為10∶1 的濃度作為化合物定量限[8]，而是逐級(jí)稀釋對(duì)照品溶液，以最小響應(yīng)信號(hào)所對(duì)應(yīng)的濃度作為檢出限，然后以檢出限的3 倍確定定量限，實(shí)驗(yàn)測(cè)得檢出限為0.1 μg/ml、定量限為0.3 μg/ml。

2.3.4 精密度

取樣品按“1.3.1”方法制備的供試品溶液、質(zhì)量濃度為50 μg/ml 的對(duì)照品溶液，分別連續(xù)測(cè)定6 次。在MRM 模式下計(jì)算提取定量離子峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard de-viation，RSD）為0.7%（n=6），結(jié)果顯示方法的精密度良好。

2.3.5 回收率

選取陰性樣品分別添加0.1、0.5、2 mg 3 個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平各6 份樣品，按照“1.3.1”處理、“1.3.2”測(cè)定，結(jié)果顯示回收率為90.3%～100.7%，RSD 為0.5%～0.9%，表明回收率良好，見(jiàn)表2。

2.3.6 穩(wěn)定性

取陽(yáng)性樣品，按照“1.3.1”處理、“1.3.2”分析，分別在0、12、24、30、36、48 h 測(cè)定。在MRM模式下計(jì)算提取定量離子峰面積的RSD 為0.6%，RSD<5%（見(jiàn)表3），表明陽(yáng)性樣品中的目標(biāo)物48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 水楊酸甲酯的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品制備方法的分析

本研究對(duì)貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品進(jìn)行探討，患者在使用產(chǎn)品時(shí)貼于患處，一般以1 貼為1 次用量，貼的大小與患者的部位有關(guān)，因此以1 貼為實(shí)驗(yàn)用量。參照相關(guān)文獻(xiàn)[6，14]，選擇甲醇為樣品的浸提溶劑并采取冷凝回流的方式，獲得浸提液。供試樣品為各大藥房和網(wǎng)絡(luò)購(gòu)買(mǎi)所得貼敷類醫(yī)療器械，部分貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品名稱及宣稱功效舉例見(jiàn)表4。以鐵粉或其他粉末致熱為工作原理的熱療貼、熱灸貼等貼敷類醫(yī)療器械一般含有發(fā)熱粉劑，且發(fā)熱粉劑不接觸皮膚，不適用于此樣品制備方法。

表4 部分貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品名稱及宣稱功效舉例

2.5 貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品中水楊酸甲酯的測(cè)定

采用建立的UPLC-MS/MS 方法對(duì)市售和網(wǎng)購(gòu)的貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品（包括醫(yī)用冷敷貼、醫(yī)用冷敷凝膠、遠(yuǎn)紅外鎮(zhèn)痛貼、暈車貼、雞眼貼等）是否添加水楊酸甲酯進(jìn)行檢測(cè)。114 份樣品中，共檢出陽(yáng)性樣品29 份，檢出率為25.4%，含量為每貼1～47 mg，且陽(yáng)性樣品多集中在醫(yī)用冷敷貼、遠(yuǎn)紅外鎮(zhèn)痛貼樣品中。

3 討論

面對(duì)日益復(fù)雜的貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量安全形勢(shì)，檢驗(yàn)、檢測(cè)能力亟需高質(zhì)量發(fā)展，以滿足安全監(jiān)管的需要。氣相、液相色譜法是篩查食品、藥品中非法添加物常用的方法，但由于貼敷類醫(yī)療器械基質(zhì)復(fù)雜，成分不明，基質(zhì)中的其他成分可能與水楊酸甲酯具有相同的保留時(shí)間，所以需高分辨的質(zhì)譜數(shù)據(jù)提供準(zhǔn)確可靠的信息[5]，所以通常利用色譜法進(jìn)行初篩，再用UPLC-MS/MS 法驗(yàn)證，試驗(yàn)過(guò)程步驟多且復(fù)雜，耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)。本研究通過(guò)質(zhì)譜、色譜條件的優(yōu)化及方法學(xué)驗(yàn)證，證明本研究建立的UPLC-MS/MS 法簡(jiǎn)便可靠、快速高效，可有效對(duì)貼敷類醫(yī)療器械產(chǎn)品中是否添加水楊酸甲酯進(jìn)行監(jiān)測(cè)。另外，貼敷類醫(yī)療器械非法添加成分繁雜，可參考文獻(xiàn)[6-9]與本研究方法同時(shí)測(cè)定多種成分，省時(shí)省力，為批量處理分析樣品提供便捷。本研究對(duì)114 份樣品進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣本29 份，滿足對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行精準(zhǔn)分析的要求，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法可用于大批量樣品檢測(cè)的有效性和實(shí)用性。