畢赤酵母中外源蛋白表達(dá)量的提升策略

茹扎·也里扎提 楊宇

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

外源蛋白的重組表達(dá)是指將一個(gè)物種的蛋白質(zhì)編碼基因引入另一個(gè)物種的細(xì)胞（宿主細(xì)胞）中，從而允許宿主細(xì)胞表達(dá)外源蛋白質(zhì)［1］。畢赤酵母（Pichia pastoris）已成為工業(yè)應(yīng)用中蛋白質(zhì)生產(chǎn)的常見(jiàn)菌株，被成功應(yīng)用于1 000 多種外源蛋白的表達(dá)，許多外源蛋白基因在畢赤酵母中以g/L 水平表達(dá)，最高表達(dá)量已經(jīng)突破10 g/L［2］。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有三個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)：（1）作為單細(xì)胞生物易于遺傳操作，培養(yǎng)成本低；（2）在強(qiáng)大且嚴(yán)格調(diào)控的啟動(dòng)子下高效分泌外源蛋白；（3）具有進(jìn)行翻譯后修飾的能力，有益于生產(chǎn)可溶性和正確折疊的重組蛋白。雖然畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)多年研究已有較為深入的認(rèn)識(shí)，但也存在一定的局限性。首先，畢赤酵母并不能重組表達(dá)所有我們感興趣的蛋白。例如一些蛋白由于克隆變異、高糖基化、RNA 穩(wěn)定性等問(wèn)題導(dǎo)致的蛋白失活不表達(dá)的現(xiàn)象［3］。其次，有一部分外源蛋白盡管能在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)，但是表達(dá)水平仍有待提升的空間。因此，進(jìn)一步探索提升畢赤酵母中外源蛋白表達(dá)量的原理和方法，將對(duì)降低赤酵母表達(dá)系統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，具有重要的意義。

本文從基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、折疊分泌水平、抗逆水平、發(fā)酵工藝六個(gè)方面歸納總結(jié)畢赤酵母提高外源蛋白表達(dá)的優(yōu)化策略（圖1），旨在全面地展示如何提高外源蛋白在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平。為畢赤酵母作為工業(yè)規(guī)模的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)提供有益參考。

圖1 畢赤酵母中外源蛋白表達(dá)的優(yōu)化策略Fig.1 Strategies for increasing heterologous protein expression in Pichia pastoris

1 基因水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量

畢赤酵母是工業(yè)中外源蛋白表達(dá)的成熟宿主系統(tǒng)，在基因水平上通過(guò)密碼子優(yōu)化和提高基因拷貝數(shù)是提高外源蛋白表達(dá)水平的常用方法。密碼子優(yōu)化常見(jiàn)的策略是使用首選密碼子替換稀有密碼子，以匹配密碼子使用偏差。目的基因的高拷貝整合可以通過(guò)多拷貝表達(dá)載體或抗性篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子實(shí)現(xiàn)。

1.1 蛋白基因的密碼子優(yōu)化

不同的生物密碼子使用偏好性不同，因此需要將外源基因的密碼子優(yōu)化為適合宿主的密碼子。密碼子偏好對(duì)基因表達(dá)的影響被認(rèn)為是由于其介導(dǎo)翻譯，密碼子會(huì)通過(guò)翻譯伸長(zhǎng)率和準(zhǔn)確性對(duì)翻譯效率產(chǎn)生影響［4］，并且密碼子的tRNA 數(shù)量與該密碼子的使用頻率存在正相關(guān)關(guān)系。最新發(fā)現(xiàn)表明，密碼子使用在決定基因水平上也有重要作用。使用不同密碼子能微調(diào)mRNA 水平和穩(wěn)定性［5］，而mRNA 降解在調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本水平中起關(guān)鍵作用，是調(diào)控基因表達(dá)的主要控制點(diǎn)。

在畢赤酵母中重組表達(dá)果膠酶時(shí)，序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后，果膠酶活性提高了20%［6］。Li 等［7］通過(guò)密碼子替換，改變了20%乙酰膽堿酯酶基因總序列，使堿基GC 含量提高到46.85%，密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）從0.70 提高到0.81。經(jīng)密碼子優(yōu)化的乙酰膽堿酯酶酶活達(dá)到139.7 U/mL，是野生型菌株的62.2 倍。Wang 等［8］通過(guò)密碼子優(yōu)化顯著提高了來(lái)自地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶在畢赤酵母中的表達(dá)水平，經(jīng)密碼子優(yōu)化的α-淀粉酶在5 L 和50 L 生物反應(yīng)器中甲醇誘導(dǎo)50 h 后最高酶活為8 100 U/mL 和11 000 U/mL，分別是原來(lái)的2.31 倍和2.62 倍。

1.2 蛋白基因拷貝數(shù)的增加

基因拷貝數(shù)變化與轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性較高，通過(guò)增加目的蛋白的基因拷貝數(shù)，可以提高生產(chǎn)率。迄今為止，畢赤酵母中高拷貝目的基因的構(gòu)建主要通過(guò)體外法和體內(nèi)法。前者是通過(guò)體外串聯(lián)表達(dá)盒構(gòu)建含有多拷貝的單個(gè)載體，獲得含有多拷貝的重組質(zhì)粒［9］。通過(guò)這種方法，Zheng 等［10］成功構(gòu)建了含有甘露聚糖酶基因的1、2、4、6 個(gè)拷貝的載體并且在畢赤酵母中成功表達(dá)了具有功能活性的甘露聚糖酶。特別地，該研究表明4 拷貝的甘露聚糖酶表達(dá)水平大于6 拷貝的。同樣地，Erden?Karao?lan等［11］使用不同DNA 拷貝數(shù)（1，2，3，4，5 和5 +）改善L?天冬酰胺酶在畢赤酵母中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)3 拷貝菌株產(chǎn)量最高?？赡苁怯捎诳截悢?shù)的增加可能導(dǎo)致與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的氧化應(yīng)激以及碳和能量供應(yīng)不足從而影響轉(zhuǎn)錄翻譯水平。此類方法操作性強(qiáng)，但是由于載體大小的限制很難獲得含有超過(guò)10 拷貝表達(dá)盒的載體［12］。

體內(nèi)構(gòu)建法是選擇載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)，利用抗藥性篩選（如G418、zeocin）富集載體拷貝數(shù)增加的菌株。轉(zhuǎn)化后立即應(yīng)用高濃度的藥物通常導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)頻率較低，所選序列的拷貝數(shù)較低，而轉(zhuǎn)化后的多步選擇往往誘導(dǎo)高耐藥細(xì)胞的恢復(fù)，這些序列的拷貝數(shù)較多。所以通常采用轉(zhuǎn)化后載 體 擴(kuò) 增（posttransformational vector amplification，PTVA）的方法，利用抗生素濃度的增加逐步篩選高拷貝的抗生素耐藥基因即目的基因［13］。該過(guò)程會(huì)導(dǎo)致抗性基因兩側(cè)同源臂片段而非整個(gè)載體的擴(kuò)增，表明同源重組機(jī)制導(dǎo)致其產(chǎn)生多拷貝菌株［14］。如今，PTVA 法由于易操作以及成功率高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于畢赤酵母，同時(shí)存在成本高的問(wèn)題。后來(lái)有人對(duì)該法進(jìn)行改進(jìn)，提出了液體PTVA 法通過(guò)前期使用液體培養(yǎng)基的方式規(guī)避了費(fèi)時(shí)費(fèi)成本的問(wèn)題［15］。

然而無(wú)論是體內(nèi)、體外構(gòu)建法，單純追求高拷貝會(huì)影響轉(zhuǎn)錄翻譯水平。實(shí)際上，不同蛋白有不同的最佳拷貝數(shù)，拷貝數(shù)并不是越高越好，增加拷貝數(shù)后產(chǎn)量不變或者減少可能是蛋白質(zhì)折疊和分泌的限制。多拷貝菌株開(kāi)發(fā)是影響畢赤酵母系統(tǒng)外源蛋白產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，所以必須根據(jù)每種蛋白質(zhì)的性質(zhì)篩選合適的多拷貝菌株進(jìn)行優(yōu)化。

基因水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)量的應(yīng)用及效果詳見(jiàn)表1。

表1 外源蛋白在畢赤酵母中通過(guò)基因水平的優(yōu)化提高表達(dá)策略Table 1 Gene level-optimizing strategies for enhancing heterologous proteins expression in P.pastoris

2 轉(zhuǎn)錄水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量

啟動(dòng)子和終止子是特殊的DNA 序列，屬于非編碼區(qū)，負(fù)責(zé)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。選擇合適的啟動(dòng)子和終止子可以提高畢赤酵母外源蛋白的表達(dá)。畢赤酵母轉(zhuǎn)錄時(shí)除了需要啟動(dòng)子、終止子等轉(zhuǎn)錄元件還需要轉(zhuǎn)錄因子協(xié)助，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可克服外源蛋白的表達(dá)瓶頸（圖2），因此識(shí)別和開(kāi)發(fā)新的轉(zhuǎn)錄因子非常重要。

圖2 轉(zhuǎn)錄水平上提高畢赤酵母中外源蛋白表達(dá)的示意圖Fig.2 A workflow diagram of enhancing heterologous proteins expression in P.pastoris at transcription levels

2.1 啟動(dòng)子的合理選擇

轉(zhuǎn)錄是外源蛋白生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟，啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄過(guò)程的開(kāi)關(guān)影響轉(zhuǎn)錄的起始及持續(xù)，最終控制目的基因表達(dá)的場(chǎng)所和地點(diǎn)［20］。因此，強(qiáng)大可控的啟動(dòng)子是高效異源蛋白的關(guān)鍵工具。畢赤酵母啟動(dòng)子主要分為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子，其中，最常用具有代表性的啟動(dòng)子為甲醇誘導(dǎo)醇氧化酶1（promoter alcohol oxidase 1, PAOX1）啟動(dòng)子和組成型甘油醛三磷酸脫氫酶（glyceraldehyde?3?phosp?hate dehydrogenase, PGAP）啟動(dòng)子。

（1）PAOX1是一種在畢赤酵母中常用于生產(chǎn)重組蛋白的強(qiáng)效誘導(dǎo)啟動(dòng)子，外源基因在PAOX1的作用下表達(dá)量可高達(dá) 22 g/L（胞內(nèi)蛋白）和14.8 g/L（胞外蛋白）［19］，并且在生產(chǎn)過(guò)氧化氫酶［21］及腈水解酶［22］等重組蛋白時(shí)比另一大啟動(dòng)子PGAP更有效。由于畢赤酵母產(chǎn)生乙醇氧化酶（AOX），但AOX 對(duì)氧的親和力很差，可以通過(guò)AOX1 和AOX2 兩個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行補(bǔ)償，甲醇誘導(dǎo)的AOX1 啟動(dòng)子已被廣泛用于構(gòu)建載體。該載體有以下特征：①AOX1 啟動(dòng)子片段；②AOX1 終止區(qū)；③3'AOX1 區(qū)；④HIS4 標(biāo)記基因；⑤ColE1 序列和用于亞克隆到大腸桿菌中的抗生素抗性基因；⑥通過(guò)同源重組將載體整合到宿主基因組［23］。上節(jié)中提到高拷貝菌株不一定高表達(dá)，其限制因素主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，原因是拷貝數(shù)增加伴有甲醇代謝和過(guò)氧化物酶生物合成的轉(zhuǎn)錄衰減，導(dǎo)致異源蛋白分泌水平下降［24］。甲醇代謝受Mit1 和Trm1p 轉(zhuǎn)錄因子影響，因此Mit1［25］或Trm1p［26］的上調(diào)可以提高PAOX1效率，通過(guò)過(guò)表達(dá)Mit1 可以提高外源蛋白表達(dá)。除此之外，poly（dA:dT）啟動(dòng)子元件的改變會(huì)影響PAOX1核小體形成及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，調(diào)整PAOX1的poly（dA:dT）元件可以調(diào)控啟動(dòng)子強(qiáng)度從而提升表達(dá)水平［27］。許多蛋白都能通過(guò)PAOX1成功表達(dá)，但是該啟動(dòng)子的缺陷在于需要甲醇誘導(dǎo)，而甲醇是一種有毒且易燃的化合物作為碳源存在危險(xiǎn)。

（2）PGAP是一種表達(dá)水平與PAOX1相當(dāng)?shù)慕M成型啟動(dòng)子，因?yàn)橄嗽诖笠?guī)模發(fā)酵中使用甲醇相關(guān)的安全問(wèn)題，基于PGAP的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)更適合大規(guī)模生產(chǎn)［28］，許多基因已在該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下在畢赤酵母中以g/L 水平表達(dá)［29］。幾丁質(zhì)酶通過(guò)PGAP調(diào)控在1.5 L 發(fā)酵罐中蛋白量可達(dá)300 mg/L［30］。為了重組蛋白的高效表達(dá)，PGAP常與目的基因多拷貝策略結(jié)合使用，最近研究顯示葡聚糖酶首次通過(guò)PGAP高水平表達(dá)并在補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段體積生產(chǎn)率達(dá)到1 706 U/（L·h）［31］。PGAP已經(jīng)通過(guò)上游調(diào)控序列的隨機(jī)突變進(jìn)行了工程化，Ata? 等［32］通過(guò)靶向刪除或復(fù)制推測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）構(gòu)建了PGAP文庫(kù)，并且使用PGAP突變體制備了滴度高于野生型PGAP啟動(dòng)子2.4 倍的人類生長(zhǎng)激素重組蛋白。

（3）其他啟動(dòng)子。由于啟動(dòng)子在表達(dá)系統(tǒng)和生物過(guò)程效率中起著至關(guān)重要的作用，除了常用的PAOX1和PGAP，畢赤酵母啟動(dòng)子也在被不斷開(kāi)發(fā)和更新。甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子還有AOX2、DAS、FLD1，組成型啟動(dòng)子還有ENO1、YPT1 等［33］。其中，雖然AOX2 啟動(dòng)子表達(dá)外源基因水平是PAOX1的10%左右，但AOX2 在促進(jìn)細(xì)胞成長(zhǎng)中有所應(yīng)用，可以用于生產(chǎn)高分子量透明質(zhì)酸［34］。而DHAS 和FLD1啟動(dòng)子表達(dá)水平較強(qiáng)［35］，類似于PAOX1。組成型啟動(dòng)子ENO1 表達(dá)水平是同類型PGAP的20%-70%［36］。YPTI 屬于弱表達(dá)啟動(dòng)子，比用于表達(dá)目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)型AOX1 啟動(dòng)子弱約1 000 倍［37］，通過(guò)YPT1 啟動(dòng)子可以避免轉(zhuǎn)錄機(jī)制過(guò)載的問(wèn)題，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平降低。除了上述討論的啟動(dòng)子，近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的畢赤酵母啟動(dòng)子也很有前景，如ADH3 啟動(dòng)子［38］、GCW14 啟動(dòng)子［39］、PDH 啟動(dòng)子［40］。不同類型的啟動(dòng)子對(duì)于外源蛋白的影響各有不同，為了使其在畢赤酵母中更好地發(fā)揮功能，應(yīng)根據(jù)外源蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和特性選擇適合的啟動(dòng)子或進(jìn)行啟動(dòng)子工程改造達(dá)到研究目的。

2.2 終止子的合理選擇

影響目的基因的轉(zhuǎn)錄水平的另一個(gè)因素是終止子，終止子在外源基因表達(dá)中的影響還沒(méi)有得到太多的關(guān)注。終止子作為外源基因表達(dá)單元中的重要組成部分，它定義了3'?非翻譯區(qū)（3'? untranslated region，3'?UTR），用于轉(zhuǎn)錄前RNA 分子的適當(dāng)末端處理、切割和多腺苷酸化，以產(chǎn)生成熟的mRNA。已有證據(jù)表明，終止子通過(guò)影響mRNA 3'端加工、mRNA 穩(wěn)定性和翻譯效率等環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)水平［41］。Ramakrishnan 等［42］研究了終止子對(duì)Calb 基因表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，終止子與低表達(dá)啟動(dòng)子PGAP偶聯(lián)時(shí)，其影響被放大，展示出更高的酶活，以及顯示出終止子相關(guān)的mRNA 穩(wěn)定性增強(qiáng)。Ito 等［43］利用72 個(gè)終止子序列創(chuàng)建了“終止子庫(kù)”，通過(guò)交換來(lái)自釀酒酵母或畢赤酵母的終止子可以在較寬范圍（17 倍）內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)

轉(zhuǎn)錄因子是一種通過(guò)確定DNA 是否轉(zhuǎn)錄成RNA 來(lái)控制基因活性的分子，具有調(diào)節(jié)外源蛋白生產(chǎn)的巨大潛力，可用于增強(qiáng)蛋白表達(dá)。

Aft1 是一種亞鐵運(yùn)輸?shù)募せ顒?，在畢赤酵母中Aft1 并不直接參與鐵的調(diào)節(jié)，而是參與碳響應(yīng)調(diào)節(jié)。通過(guò)過(guò)表達(dá)Aft1，在補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器培養(yǎng)中能使羧基酯酶的分泌增加2.5 倍［44］。Aft1 的共表達(dá)顯著提高了水蛭透明質(zhì)酸酶的表達(dá)，在3 L 發(fā)酵罐中，水蛭透明質(zhì)酸酶酶活達(dá)到2.12×106U/mL，產(chǎn)酶能力達(dá)到1.96×104U/（mL·h）［45］。

Fhl1p 是一種新的畢赤酵母轉(zhuǎn)錄因子，在畢赤酵母中調(diào)控rRNA 加工、高爾基體囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程，并有助于外源蛋白表達(dá)［46］。Fhl1p 的過(guò)表達(dá)對(duì)果膠酶和植酸酶的分泌具有顯著的益處，活性分別提高了20%和35%，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)mRFP 水平升高［46］。

鋅簇蛋白SUT2 的表達(dá)可以被甲醇誘導(dǎo)但被甘油抑制，說(shuō)明SUT2 可能參與甲醇代謝。SUT2 的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了AOX1 的表達(dá)，Yang 等［47］通過(guò)在不同位點(diǎn)截?cái)嗉俣ǖ腟UT2 啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)，ATG 起始的547-973 bp 區(qū)域被證明是誘導(dǎo)啟動(dòng)子PSUT2 的核心元件，該啟動(dòng)子對(duì)甲醇信號(hào)有強(qiáng)烈響應(yīng)并驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白的表達(dá)提高了18%。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子的去表達(dá)

畢赤酵母中轉(zhuǎn)錄因子的使用較廣泛和靈活。一些情況下，可以通過(guò)敲除轉(zhuǎn)錄因子來(lái)改善酵母細(xì)胞對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力以及提高外源蛋白的表達(dá)。

ATT1 是關(guān)于半乳糖代謝的轉(zhuǎn)錄因子，與糖代謝相關(guān)。糖代謝會(huì)改變糖基化途徑對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生影響。沉默ATT1 基因使得人表皮生長(zhǎng)因子受體?2單抗產(chǎn)量提高了1.5 倍，達(dá)到1.98 g/L。不僅如此，ATT1 的去表達(dá)提高了宿主的耐熱性，使其在35℃下能在15 L 發(fā)酵罐中生長(zhǎng)150 h［48］。

Mig1 和Mig2 是抑制分解代謝的轉(zhuǎn)錄因子，能夠抑制甲醇利用途徑基因和PEX 基因［49］。畢赤酵母由于其強(qiáng)大的啟動(dòng)子PAOX1驅(qū)動(dòng)的蛋白質(zhì)表達(dá)能力而被廣泛用于外源蛋白表達(dá)。但是關(guān)于該啟動(dòng)子甲醇誘導(dǎo)和分解代謝抑制的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)未完全闡明。Shi 等［50］發(fā)現(xiàn)畢赤酵母中PAOX1分解代謝的Mig 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)，敲除Mig 的酵母菌株在甘油作為碳源的條件下AOX 基因水平上調(diào)了30 倍，這表明Mig1 和Mig2 對(duì)PAOX1具有去抑制作用。

Nrg1 是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，作為DNA 結(jié)合抑制因子能消除葡萄糖對(duì)STA1 基因的抑制。與Mig 類似，可用于畢赤酵母中降低葡萄糖和甘油碳源環(huán)境對(duì)PAOX1的抑制［51］。而Mig1、Mig2 和Nrg1 三重基因敲除的突變體酵母菌株不僅能誘導(dǎo)AOX1 基因，還可以逆轉(zhuǎn)過(guò)氧化物酶體增殖、生物發(fā)生和分裂缺陷［52］。

轉(zhuǎn)錄水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)量的應(yīng)用及效果詳見(jiàn)表2。

表2 外源蛋白在畢赤酵母中通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平的優(yōu)化提高表達(dá)策略Table 2 Transcription level-optimizing strategies for enhancing heterologous proteins expression in P.pastoris

3 翻譯水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量

翻譯是基因表達(dá)過(guò)程中的重要步驟之一，但是目前利用畢赤酵母提高外源蛋白表達(dá)策略中翻譯水平相關(guān)的報(bào)道較少。然而從mRNA 到蛋白的翻譯過(guò)程還有大量變數(shù)，因此需要翻譯調(diào)控快速應(yīng)答。而翻譯調(diào)控受翻譯相關(guān)因子影響，通過(guò)上調(diào)相關(guān)因子的表達(dá)可以從翻譯水平改善蛋白表達(dá)量。

3.1 翻譯起始因子的過(guò)表達(dá)

酵母表達(dá)系統(tǒng)外源蛋白產(chǎn)率與酵母細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)，而酵母生長(zhǎng)過(guò)程中不能持續(xù)保持高生長(zhǎng)速率，使得蛋白產(chǎn)率的優(yōu)化受到限制。翻譯元件的過(guò)表達(dá)為提高翻譯水平提供了思路，Rebnegger 等［54］分析了畢赤酵母的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并發(fā)現(xiàn)隨著生長(zhǎng)速度的降低，蛋白翻譯相關(guān)基因明顯下調(diào)。該團(tuán)隊(duì)觀察到，翻譯起始時(shí)Pab1 和eIF4F 分別與mRNA 3'poly（A）和5'cap 結(jié)合形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)。通過(guò)過(guò)表達(dá)與閉環(huán)結(jié)構(gòu)相關(guān)的翻譯起始因子eIF2、eIF3、Rli1、eIF4F 和Pab1 作為靶基因，證明翻譯起始被確定為主要的限速步驟。過(guò)表達(dá)翻譯起始因子可積極影響翻譯活性和轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性，且不依賴于使用的菌株、啟動(dòng)子以及模式蛋白，使不同重組蛋白產(chǎn)量提高3 倍［55］。該研究表明翻譯起始的閉環(huán)結(jié)構(gòu)相關(guān)的因子限制了酵母中蛋白質(zhì)的合成。過(guò)表達(dá)此類翻譯元件可以增強(qiáng)整體翻譯活性，提高重組蛋白的產(chǎn)量。

3.2 核糖體生物合成因子的過(guò)表達(dá)

核糖體是mRNA 翻譯的核心，是基因表達(dá)的關(guān)鍵過(guò)程。核糖體亞基組裝過(guò)程涉及數(shù)百種非核糖體因子，稱為核糖體生物合成因子（ribosome biogenesis factor, RBF），其功能是作為伴侶、修飾、加工、組裝和重塑因子［56］。林影團(tuán)隊(duì)篩選出有利于外源蛋白表達(dá)的核糖體生物合成因子Bcy1，其過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)畢赤酵母細(xì)胞生長(zhǎng)并提高報(bào)告蛋白熒光蛋白的產(chǎn)量［57］。對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Bcy1的過(guò)表達(dá)通過(guò)下調(diào)核糖體合成途徑，提升了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和植酸酶的分泌積累并提高了植酸酶的產(chǎn)量［58］。

3.3 其他翻譯相關(guān)元件的過(guò)表達(dá)

內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site, IRES）具有募集核糖體的能力，無(wú)需依賴5'帽結(jié)構(gòu)就可起始翻譯啟動(dòng)蛋白質(zhì)合成。林堯等發(fā)現(xiàn)，不同的 IRES 序列驅(qū)動(dòng)的翻譯效率會(huì)引起β-半乳糖苷酶活性的差異，并利用β-半乳糖苷酶α 肽為報(bào)告基因篩選出畢赤酵母中功能性的IRES［59］。

翻譯水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)量的應(yīng)用及效果詳見(jiàn)表3。

表3 外源蛋白在畢赤酵母中通過(guò)優(yōu)化翻譯水平提高表達(dá)策略Table 3 Translation level-optimizing strategies for enhancing heterologous proteins expression in P.pastoris

4 折疊分泌水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量

為了表達(dá)感興趣的蛋白，外源蛋白的正確折疊和分泌十分必要，該過(guò)程主要涉及信號(hào)肽的選擇和分子伴侶的共表達(dá)。信號(hào)肽是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的位于蛋白N 端的短肽鏈，攜帶蛋白分泌信息，優(yōu)化信號(hào)肽能將重組蛋白產(chǎn)量提高到具有商業(yè)意義的水平［60］。在分泌途徑中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在時(shí)空上維持著分子伴侶相互作用。分子伴侶形成的伴侶網(wǎng)絡(luò)會(huì)影響蛋白質(zhì)折疊、構(gòu)象和穩(wěn)定性。

4.1 信號(hào)肽的選擇和優(yōu)化

重組蛋白在酵母中的分泌表達(dá)需要信號(hào)肽引導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)，這是新合成的蛋白質(zhì)分泌表達(dá)的第一步［61］。常見(jiàn)的酵母信號(hào)肽有α-factor 信號(hào)肽、Killer 毒素信號(hào)肽、酸性磷酸酶信號(hào)肽（PHO1）、蔗糖酶信號(hào)肽（SUC）和菊粉酶信號(hào)肽（INU）等，其中α-factor 信號(hào)肽是畢赤酵母中最常用的信號(hào)肽，該分泌信號(hào)起作用的是19 個(gè)氨基酸α 因子的前體N 端部分，可以幫助外源蛋白翻譯后易位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［62］，自身再被高爾基體中的Kex2 加工蛋白酶切割。α-factor 信號(hào)肽較其他信號(hào)肽更有效但也有進(jìn)一步優(yōu)化的空間，其翻譯后易位機(jī)制容易導(dǎo)致一些蛋白在翻譯后提前折疊，轉(zhuǎn)移效率下降從而減少分泌。信號(hào)肽的效率決定了外源蛋白分泌表達(dá)，對(duì)α-factor 信號(hào)肽進(jìn)行優(yōu)化改造可以提高蛋白表達(dá)量。最近，張娜等［63］發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用畢赤酵母高頻密碼子對(duì)α-factor 信號(hào)肽進(jìn)行優(yōu)化可以將葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的酶活力提高至野生型菌株的2.01 倍。Donelan 等［64］通過(guò)融合α-factor 信號(hào)肽與其他有益序列，利用嵌合前導(dǎo)序列OST1 與pro-αpp8 融合形成新型信號(hào)肽促進(jìn)蛋白分泌，進(jìn)一步提高了草酸氧化酶的產(chǎn)量和活性。而Püllmann 等［65］則是通過(guò)高通量篩選的辦法開(kāi)發(fā)了一種聯(lián)合信號(hào)肽和啟動(dòng)子的洗牌系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)11 個(gè)內(nèi)源性和同源啟動(dòng)子與17種信號(hào)肽進(jìn)行組合篩選，這種系統(tǒng)類似于定向進(jìn)化可以用于在酵母中篩選真菌非特異性過(guò)氧化酶、脂肪酶CalB 和漆酶Mrl2 等。

教學(xué)實(shí)踐中證明：在體育適性課堂中實(shí)施“一二·三六”教學(xué)模式，首先滿足了學(xué)生的情感和興趣，調(diào)動(dòng)了學(xué)生的能動(dòng)性；其次培養(yǎng)了學(xué)生學(xué)習(xí)的問(wèn)題意識(shí)，讓學(xué)生的學(xué)習(xí)有了重點(diǎn)，學(xué)會(huì)了學(xué)習(xí)動(dòng)作技能的方法手段，為學(xué)生的終身體育能力打下了良好的基礎(chǔ)；再次更是滲透了小班化理念，給學(xué)生提供了更大的學(xué)習(xí)空間，解決了利用場(chǎng)地器材、發(fā)揮教師專長(zhǎng)等問(wèn)題。體育適性課堂“一二·三六”教學(xué)模式目前還處于一個(gè)前期實(shí)踐階段，如何更有效、規(guī)范地開(kāi)展，有待于我們?cè)趯?shí)踐中不斷深入探討和完善。

4.2 分子伴侶的共表達(dá)

外源基因的高轉(zhuǎn)錄水平可能使畢赤酵母的蛋白折疊能力飽和，導(dǎo)致未折疊蛋白通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白 降 解（ER?associated protein degradation，ERAD）。而分子伴侶蛋白可以通過(guò)幫助正確折疊（圖3）新合成的蛋白質(zhì)來(lái)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)［61］。分子伴侶是一種輔助蛋白折疊，幫助其獲得功能活性或者穩(wěn)定構(gòu)象，但不成為最后功能結(jié)構(gòu)中的組分。常見(jiàn)的分子伴侶有二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase, PDI）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊氧化還原輔助因子（endoplasmic reticulum oxidation 1, ERO1）、熱休克蛋白（Saccharomyces cerevisiae heat shock protein SSA4,Ssa4）、免疫球蛋白結(jié)合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein, BiP）等。

圖3 分泌折疊水平上提高畢赤酵母中外源蛋白表達(dá)的示意圖Fig.3 A schematic diagram of improving secretion and folding level of heterologous proteins in P.pastoris

PDI 在新折疊蛋白質(zhì)中二硫鍵的形成和重排中起關(guān)鍵作用，通過(guò)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中二硫鍵的形成，PDI提高了畢赤酵母中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工的能力。PDI 是一種常見(jiàn)的分子伴侶，在食品、藥物和工業(yè)酶中被廣泛研究。當(dāng)巴西甜蛋白在畢赤酵母中與PDI 共表達(dá)后，其胞外蛋白量達(dá)到1 g/L［66］，比先前報(bào)道的提高了2.5 倍。在另一則報(bào)道中，共表達(dá)PDI 提高了畢赤酵母表達(dá)人溶菌酶的酶活，雖然其胞外蛋白量沒(méi)有明顯上升但酶活提高了30.7%［67］。同樣地，在畢赤酵母中共表達(dá)PDI 與杜邦嗜熱菌脂肪酶（Thermomyces dupontii lipase，TDL）中酶活與蛋白濃度均提高了約1.4 倍［68］，共表達(dá)PDI 在另一種杜邦嗜熱菌脂肪酶（Talaromyces thermophilus, LIP1）中酶活也有提升［69］。共表達(dá)PDI 還能提高抗菌酶的活性，殼聚糖酶AqCoA 是一種抗菌抗炎類酶，它與PDI 共表達(dá)將酶活提高了31%［70］。為了提高分子伴侶PDI的效率，董聰?shù)龋?1］構(gòu)建了3 拷貝的PDI 與FAD 依賴的葡萄糖脫氫酶共表達(dá)的畢赤酵母重組菌株發(fā)現(xiàn)，其酶活比原來(lái)提高了83%。

ERO1 是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，ERO1 對(duì)于畢赤酵母中二硫鍵的形成至關(guān)重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的ERO1 轉(zhuǎn)錄上調(diào)有助于改善蛋白質(zhì)折疊，以提高細(xì)胞應(yīng)對(duì)應(yīng)激的能力［72］。研究發(fā)現(xiàn)，ERO1 也能增強(qiáng)畢赤酵母中AqCoA 的表達(dá)，特別地，當(dāng)ERO1 與PDI 協(xié)同共表達(dá)使蛋白表達(dá)水平提高了42%［70］。分子伴侶共表達(dá)常常與多拷貝策略一起出現(xiàn)，例如，在畢赤酵母中表達(dá)腈水解酶時(shí)，分子伴侶ERO1 的共表達(dá)進(jìn)一步提高了多拷貝菌株中腈水解酶的活性及腈水解酶基因的轉(zhuǎn)錄水平［22］。

Ssa4 是一種對(duì)外源蛋白具有積極影響的分泌輔助因子，屬于hsp70（heat shock protein，熱休克蛋白）基因家族。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷壓力時(shí)會(huì)改變其基因表達(dá)模式，專注于制造恢復(fù)所需的蛋白質(zhì)，于是大多數(shù)mRNA 被保存在細(xì)胞核內(nèi)，而編碼細(xì)胞恢復(fù)蛋白的轉(zhuǎn)錄本如Ssa4 被表達(dá)。Ssa4 蛋白通過(guò)重新折疊變性蛋白來(lái)幫助細(xì)胞從壓力中恢復(fù)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)初生蛋白到內(nèi)膜，參與蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)位及組裝［73］。Jiao 等［74］發(fā)現(xiàn)，Ssa4 的共表達(dá)使米根霉脂肪酶的分泌水平增強(qiáng)45%，并且與其他協(xié)助因子Bmh2、Sso2 共表達(dá)活性會(huì)高于僅共表達(dá)Ssa4。Zahrl 等［75］對(duì)Hsp70 相關(guān)的分子伴侶蛋白做了細(xì)致研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Hsp70因子循環(huán)會(huì)影響重組蛋白從細(xì)胞質(zhì)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的易位。當(dāng)過(guò)度表達(dá)由Ssa1、Ydj1 和Snl1 組成的細(xì)胞質(zhì)Hsp70 循環(huán)以及由Kar2、Erj5 和Sil1 組成的 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Hsp70 循環(huán)時(shí)發(fā)現(xiàn)了最佳的協(xié)同效應(yīng)，使得抗體片段Fabs 和scFvs 分泌量提高5 倍，滴度均達(dá)到1.3 g/L。

BiP 也屬于Hsp70 熱休克蛋白家族，是最重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白。它在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有兩個(gè)作用：作為錯(cuò)誤折疊蛋白的感應(yīng)蛋白以及參與ERAD 途徑減少蛋白錯(cuò)誤折疊相關(guān)應(yīng)激。據(jù)報(bào)道，共表達(dá)BiP 可以增強(qiáng)畢赤酵母中一些重組蛋白的分泌表達(dá)，但是效果參差不齊。在一項(xiàng)研究中，當(dāng)BiP 與ERO1 共表達(dá)使紅色念珠菌脂肪酶Lip1 酶產(chǎn)量提高46.5%［76］。同樣地，過(guò)表達(dá)Bip 也可增強(qiáng)羧酸酯酶的表達(dá)，與原酶相比共表達(dá)BiP 蛋白的菌株活性提高了44%［77］。但應(yīng)該注意的是，BiP 分子伴侶的作用具有蛋白質(zhì)特異性。Yang 等［78］發(fā)現(xiàn)BiP 的共表達(dá)被證明對(duì)哺乳動(dòng)物肽聚糖識(shí)別蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)的分泌有害。

HAC1 是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)響應(yīng)蛋白，重組蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后需要經(jīng)歷翻譯后修飾并只有正確折疊才能離開(kāi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，最后進(jìn)行胞外分泌。未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累會(huì)觸發(fā)未折疊蛋白響應(yīng)（unfolded protein response, UPR）的激活［79］。而UPR 調(diào)節(jié)因子HAC1 的組成型表達(dá)可以減輕上游蛋白質(zhì)合成并提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的下游蛋白質(zhì)折疊效率，從而進(jìn)一步改善了蛋白質(zhì)生產(chǎn)。Bao 等［80］的研究證明，HAC1 的過(guò)表達(dá)能夠?qū)⒛揪厶敲冈诋叧嘟湍钢械漠a(chǎn)率從325 U/mL 提高到381 U/mL。Duan 等［81］通過(guò)3 種報(bào)告蛋白研究了HAC1 的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HAC1 的共表達(dá)使酵母增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的細(xì)胞外產(chǎn)量提高了99%。

折疊分泌水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)量的應(yīng)用及效果詳見(jiàn)表4。

表4 外源蛋白在畢赤酵母中通過(guò)優(yōu)化分泌折疊水平提高表達(dá)策略Table 4 Protein secretion and folding levels-optimizing strategies for enhancing heterologous proteins expression in P.pastoris

5 細(xì)胞抗逆水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量

在發(fā)酵過(guò)程中，畢赤酵母細(xì)胞會(huì)遇到來(lái)自溶解氧、溫度等多種環(huán)境壓力。這些環(huán)境壓力可能會(huì)限制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，也會(huì)影響外源蛋白的表達(dá)。通過(guò)改善細(xì)胞抗逆水平可以提高酵母的環(huán)境耐受性以及提高外源蛋白的表達(dá)（圖4）。

圖4 畢赤酵母中提高細(xì)胞抗逆水平的示意圖Fig.4 A Schematic diagram of improving cell resistance level in P.pastoris

5.1 溶氧量抗逆策略

溶解氧（dissolved oxygen, DO）是畢赤酵母發(fā)酵的關(guān)鍵參數(shù)，當(dāng)酵母細(xì)胞在發(fā)酵過(guò)程中處于低溶解氧狀態(tài)時(shí)，畢赤酵母的代謝途徑會(huì)改變從而抑制外源蛋白合成。然而，透明顫菌血紅蛋白（htreoscilla hemoglobin, VHb）可以通過(guò)促進(jìn)酵母細(xì)胞的氧攝取效率增強(qiáng)呼吸和能量代謝［86］。因此，VHb 的共表達(dá)可以有效提高重組菌株在不同溶解氧濃度下利用氧氣的能力，從而導(dǎo)致外源蛋白的產(chǎn)量更高。研究表明，通過(guò)胞內(nèi)表達(dá)VHb 可以改善畢赤酵母中外源蛋白的表達(dá)。唐輝桂等［87］發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下VHb 與植酸酶共表達(dá)，可將植酸酶的酶活提高3 倍，且對(duì)畢赤酵母細(xì)胞生長(zhǎng)代謝無(wú)明顯消極影響。汪小峰等［88］發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下10 L 發(fā)酵罐中解脂耶氏酵母脂肪酶YlLip2 表達(dá)量提高了83%，總蛋白達(dá)6.79 g/L。最近該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在高DO 水平下（50%），當(dāng)胞內(nèi)VHb 和YlLip2 共表達(dá)時(shí)，YlLip2 活性達(dá)到7 650 U/mL，總蛋白達(dá)5.1 g/L，比對(duì)照組高出約21%。而在較低DO 水平下（10%），YlLip2 與VHb 共表達(dá)時(shí)，其活性為6 950 U/mL，是對(duì)照組的1.88 倍［89］。并且發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)VHb 的菌株與陰性對(duì)照菌株生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯差異，說(shuō)明表達(dá)VHb 不影響畢赤酵母生長(zhǎng)。同樣地，限氧條件下VHb 與β-甘露聚糖酶共表達(dá)可將其表達(dá)量提高90%同時(shí)還提高了畢赤酵母對(duì)甲醇的耐受，縮短了發(fā)酵周期［90］。

5.2 熱抗逆策略

溫度是影響畢赤酵母發(fā)酵的重要因素，過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低，影響外源蛋白的產(chǎn)量和活力。小熱休克蛋白（sHSPs）在酵母熱應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用，可以作為分子伴侶在環(huán)境壓力下幫助維持蛋白結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自小熱休克蛋白的熱誘導(dǎo)基因CsHSP17.2 可以影響畢赤酵母耐熱性。Wang 等［91］使用熱激處理酵母菌株30-60 min 后，分析發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CsHSP17.2 的菌株的生長(zhǎng)速度高于對(duì)照，表明CsHSP17.2 的表達(dá)提高了畢赤酵母的耐熱性。Lin 等［92］通過(guò)誘變和適應(yīng)性進(jìn)化獲得了耐熱的畢赤酵母突變體G14，并證明了G14 中的氧化應(yīng)激反應(yīng)（oxidative stress response,OSR）誘導(dǎo)了較強(qiáng)的過(guò)氧化物酶體，過(guò)氧化物酶體可以保護(hù)酵母免受耐熱和氧化應(yīng)激，起到OSR 緩沖作用。

5.3 氧化應(yīng)激抗逆策略

甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母細(xì)胞由于代謝甲醇會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的代謝副產(chǎn)物，如H2O2引起活性氧的積累，并通過(guò)損害活性氧清除系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，從而降低蛋白質(zhì)表達(dá)能力［93］，因此需要建立抗氧化防御系統(tǒng)。Lin 等［94］通過(guò)過(guò)表達(dá)與抗氧化相關(guān)基因CAT、SOD1、GLR1、AHP1、TRR1、ZWF1、GND2和GSH2，將脂肪酶的產(chǎn)量提高了1.6 倍。硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）能通過(guò)半胱氨酸硫醇-二硫鍵交換促進(jìn)其他蛋白還原而起抗氧化劑作用。Li等［95］發(fā)現(xiàn)Trx 在畢赤酵母中顯著增強(qiáng)了其對(duì)滲透壓和氧化應(yīng)激的抵抗力，并且充當(dāng)二硫鍵還原酶和分子伴侶的角色。

細(xì)胞抗逆水平上提高外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)量的應(yīng)用及效果詳見(jiàn)表5。

6 發(fā)酵工藝上提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量

畢赤酵母非常適合發(fā)酵生長(zhǎng)，在發(fā)酵過(guò)程中可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度生長(zhǎng)。通過(guò)發(fā)酵可以提高蛋白產(chǎn)量，因此高密度發(fā)酵（high cell density fermentation, HCDF）成為畢赤酵母大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白的重要策略。將畢赤酵母HCDF 從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模擴(kuò)大到工業(yè)化示范具有重要意義，強(qiáng)力有效的HCDF 可以使外源蛋白表達(dá)達(dá)到商業(yè)生產(chǎn)水平。傳統(tǒng)的HCDF 分為三個(gè)階段：甘油分批階段、甘油補(bǔ)料分批階段和甲醇誘導(dǎo)階段［96］，其生物工藝操作參數(shù)，包括培養(yǎng)基組成、溫度、pH、溶解氧、壓力、接種量、誘導(dǎo)和進(jìn)料策略，都會(huì)極大地影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。

6.1 培養(yǎng)基的選擇和優(yōu)化

培養(yǎng)基為畢赤酵母的生長(zhǎng)提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中碳源對(duì)菌體的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)有影響。畢赤酵母大多以甲醇作為碳源，而甲醇存在易燃易爆的安全隱患，Liu 等［97］報(bào)道以甲酸鹽取代甲醇作為碳源和誘導(dǎo)劑，不僅安全、可持續(xù)還能使木聚糖酶產(chǎn)量增加（103.5±12.5）%。而Lee 等［98］則是通過(guò)開(kāi)發(fā)了一種自誘導(dǎo)BYGM 培養(yǎng)基，縮短了篩選和培養(yǎng)時(shí)間并得到了與使用傳統(tǒng)培養(yǎng)基表達(dá)水平相當(dāng)?shù)哪さ鞍?。Zhu 等［99］通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基將基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基鹽濃度減少一半并純化最終得到了產(chǎn)量高達(dá)17.47 g/L 的重組人血清蛋白，是迄今為止報(bào)道的最高的人血清蛋白產(chǎn)量。

6.2 溶解氧的控制

為了畢赤酵母作為好氧微生物，需要氧氣參與代謝過(guò)程，溶解氧水平對(duì)于細(xì)胞和產(chǎn)物的生成密切相關(guān)。溶解氧過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響其代謝，畢赤酵母能在溶解氧水平為10%-50%范圍內(nèi)生長(zhǎng)［100］。實(shí)驗(yàn)證明短暫缺氧和高甲醇會(huì)觸發(fā)高水平重組蛋白的合成［101］。研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母活性與活性氧積累有關(guān)，活性氧累積伴隨細(xì)胞活性下降。Hu 等［93］發(fā)現(xiàn)，通過(guò)選擇性平衡活性氧清除系統(tǒng)和減少對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，控制0.051/h 的比生長(zhǎng)速率能促進(jìn)脂肪酶MAS1 表達(dá)。通過(guò)定期甘油和溶解氧濃度控制增強(qiáng)畢赤酵母的人類溶菌酶產(chǎn)量，Jia 等［102］利用該策略將活性氧控制在低水平，獲得了更高的細(xì)胞密度。Liu等［103］則是專注于研究1 000 L 大體積發(fā)酵罐的優(yōu)化策略，他們通過(guò)增加氣壓、降低溶解氧、調(diào)整甲醇進(jìn)料速率替代純氧補(bǔ)充的發(fā)酵策略提高了發(fā)酵水平，已在1 000 L 發(fā)酵規(guī)模下獲得900 mg/L 的β 木糖苷酶。

6.3 分批補(bǔ)料策略的優(yōu)化

選擇合適的補(bǔ)料策略是至關(guān)重要的，近年來(lái)的補(bǔ)料流加策略主要有經(jīng)典誘導(dǎo)策略、共飼養(yǎng)誘導(dǎo)策略和限制性誘導(dǎo)策略［104］。需要根據(jù)外源蛋白的特性選擇合適的補(bǔ)料策略和工藝參數(shù)提升發(fā)酵水平，進(jìn)一步提高畢赤酵母中重組蛋白的表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化分批補(bǔ)料策略微調(diào)甲醇和山梨醇的含量，可以將人生長(zhǎng)激素［105］、馬鈴薯糖蛋白［106］、漆酶［107］等蛋白表達(dá)水平提升至1 g/L 左右。除了關(guān)注補(bǔ)料策略，pH 值對(duì)所需外源蛋白表達(dá)水平以及酵母菌株的影響是獨(dú)特的，缺乏pH 控制會(huì)導(dǎo)致pH 值改變，從而抑制微生物生長(zhǎng)和降低溶液中的蛋白濃度，溫度也是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。畢赤酵母能夠在廣泛的pH 范圍（3.0-7.0）及溫度（20-30℃）條件下生長(zhǎng)［100］。

6.4 高密度發(fā)酵水平的分析監(jiān)測(cè)

畢赤酵母在工業(yè)化生產(chǎn)中主要以分批補(bǔ)料的模式培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞環(huán)境不斷變化，因此需要監(jiān)測(cè)工藝參數(shù)和補(bǔ)料策略對(duì)酵母及目的蛋白的影響并進(jìn)行微調(diào)。為降低試錯(cuò)成本，入罐發(fā)酵前可以通過(guò)動(dòng)態(tài)通量平衡分析（dynamic flux balance analysis,DFBA）與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合來(lái)模擬外源蛋白在補(bǔ)料分批策略的誘導(dǎo)階段的生長(zhǎng)［105］。DFBA 是經(jīng)典通量平衡分析的擴(kuò)展，可以預(yù)測(cè)和優(yōu)化細(xì)胞外環(huán)境對(duì)微生物代謝的動(dòng)態(tài)影響。Boojari 等［105］利用DFBA確定了發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵操作參數(shù)，從而選擇了合適的補(bǔ)料策略并進(jìn)行了驗(yàn)證，最終利用該方法將重組人生長(zhǎng)激素產(chǎn)量提高了85%。發(fā)酵過(guò)程中，可以應(yīng)用過(guò)程分析技術(shù)（process analytical technology, PAT）進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，PAT 是一個(gè)對(duì)原料、物料及工藝參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的生產(chǎn)控制系統(tǒng)。PAT 系統(tǒng)可以利用多波長(zhǎng)熒光和PLS 定量分析耦合生成定性定量的生物數(shù)據(jù)從而檢測(cè)生物質(zhì)、甲醇和產(chǎn)物等關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)［108］，從而控制發(fā)酵過(guò)程，提高發(fā)酵的效率和生產(chǎn)的穩(wěn)定性。

發(fā)酵工藝上提高外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)量的應(yīng)用及效果詳見(jiàn)表6。

表6 外源蛋白在畢赤酵母中通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵水平提高表達(dá)策略Table 6 Fermentation level-optimizing strategies for enhancing heterologous proteins expression in P.pastoris

7 總結(jié)與展望

畢赤酵母是目前生產(chǎn)外源蛋白最常用和最受歡迎的宿主之一，它在蛋白表達(dá)產(chǎn)物的加工、外分泌、翻譯后修飾等方面有明顯的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已廣泛用于蛋白和酶制劑生產(chǎn)，然而其表達(dá)水平仍有待提升。本文概述了近年來(lái)研究人員在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、分泌折疊水平、抗逆水平、發(fā)酵工藝六個(gè)方面通過(guò)各類策略改善外源蛋白表達(dá)量并評(píng)價(jià)了其貢獻(xiàn)。盡管通過(guò)上述策略在改善畢赤酵母中外源蛋白表達(dá)方面取得了重大進(jìn)展，由于外源蛋白的復(fù)雜性和多樣性以及畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)運(yùn)行機(jī)制未被完全理解，一部分蛋白的表達(dá)水平仍然偏低或無(wú)法表達(dá)。因此，根據(jù)畢赤酵母的特性及已有研究，可以從分子水平和發(fā)酵水平著手，前者聚焦于解析畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中外源蛋白的合成、修飾和分泌的原理，通過(guò)菌株改造和表達(dá)載體研發(fā)等方面開(kāi)發(fā)新分子工具提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)。后者需要從實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，利用生物信息學(xué)并采用自動(dòng)化控制和生化檢測(cè)技術(shù)為畢赤酵母高效表達(dá)外源蛋白提供更加有效可行的策略。主要分為以下幾個(gè)方面：

（1）菌株改造是提高畢赤酵母表達(dá)效率的重要途徑。通過(guò)更深入地了解畢赤酵母基因組和細(xì)胞代謝可以幫助指導(dǎo)篩選出一些關(guān)鍵基因，通過(guò)數(shù)學(xué)建模模擬細(xì)胞代謝及代謝通量分析并利用基因工程技術(shù)進(jìn)行修飾改造，提高畢赤酵母的表達(dá)能力和生存能力。在細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)中管理改善蛋白分泌所需的信息，敲除抑制外源蛋白表達(dá)的基因、增強(qiáng)蛋白折疊和分泌。例如，使用畢赤酵母蛋白酶缺陷性菌株可以顯著降低蛋白質(zhì)降解率。

（2）畢赤酵母的糖基化修飾作用會(huì)影響蛋白的活性和穩(wěn)定性，這種影響對(duì)于不同的蛋白各有利弊。可以通過(guò)酵母糖工程，將特定蛋白改為最佳糖基化模式。例如消除酵母特有的糖基化，摻入與人類相似的糖基化途徑將原有酵母糖基化模式改造為人類糖基化模式，從而將酵母表達(dá)的糖蛋白人源化，最終應(yīng)用于藥物蛋白生產(chǎn)。

（3）表達(dá)載體研發(fā)是提高畢赤酵母表達(dá)效率的可行方法。表達(dá)載體可影響表達(dá)外源蛋白生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄-翻譯-分泌途徑的不同步驟，通過(guò)處理編碼重組蛋白mRNA 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，可以明顯提高產(chǎn)量。當(dāng)前商業(yè)化的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，使用的表達(dá)載體種類有限，限制了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的工具多樣性。因此，可以通過(guò)研發(fā)新型的質(zhì)粒表達(dá)載體，提高目的蛋白的表達(dá)效率和穩(wěn)定性。例如，除了上文提到的優(yōu)化啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子等方式，可以通過(guò)將轉(zhuǎn)錄和翻譯增強(qiáng)元件引入用于畢赤酵母表達(dá)載體中，提高外源基因的產(chǎn)量。

（4）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)畢赤酵母代謝情況及外源蛋白的含量是優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程的必要手段。在發(fā)酵過(guò)程中，畢赤酵母通常被描述為一個(gè)黑盒，其輸出與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物及副產(chǎn)物的消耗相關(guān)。因此，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)重組蛋白的生產(chǎn)仍然是一個(gè)需解決的挑戰(zhàn)。選擇合適的檢測(cè)方法，并結(jié)合實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)外源蛋白含量的準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)和控制。例如，采用近紅外光譜等在線監(jiān)測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)代謝通量分析描述畢赤酵母生長(zhǎng)過(guò)程。

總之，從分子水平著手，通過(guò)菌株改造和表達(dá)載體研發(fā)等方面來(lái)提高畢赤酵母中外源蛋白的表達(dá)效率，是畢赤酵母大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)蛋白的前提基礎(chǔ)。從發(fā)酵水平，選擇合適的檢測(cè)方法和監(jiān)測(cè)技術(shù)為提高畢赤酵母中外源蛋白的表達(dá)提供有效手段。盡管本綜述討論的提高外源蛋白表達(dá)策略可以以組合的方式應(yīng)用，對(duì)于目前工業(yè)應(yīng)用的要求，大多數(shù)蛋白的表達(dá)水平仍有待提高。隨著科技的不斷進(jìn)步和工業(yè)化生產(chǎn)的不斷推進(jìn)，相信畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)仍將有更多的突破和發(fā)展。