王娟 王新 田琴 馬曉梅 周小鳳 李保成 董承光

（新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花研究所，石河子 832000）

新疆是我國最重要的優(yōu)質(zhì)商品棉生產(chǎn)基地［1］，2022 年棉花種植面積為2 496.9 千hm2，總產(chǎn)量為539.1 萬t，分別占全國的83.2%和90.2%（國家統(tǒng)計局，2022）。新疆棉花機械化程度高，尤其新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)棉花機采率達(dá)94.2%。株型是影響棉花機械化和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，棉花株型因子主要包括株高、始果節(jié)高、始果節(jié)位、果枝數(shù)、果枝類型等性狀［2］。合理的株型有利于提高種植密度、提升光合效率及降低機械采摘過程中的產(chǎn)量損失等。

近年來，棉花株型育種已成為新疆棉花育種中主要育種目標(biāo)性狀。棉花株型性狀均屬于復(fù)雜的數(shù)量性狀，受基因型和環(huán)境的共同控制［3-5］，利用傳統(tǒng)的育種方法改良株型的難度較大，利用分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析方法，可以發(fā)掘數(shù)量性狀基因位點，是解析植物數(shù)量性狀基因的重要方法［6］。采用構(gòu)建分離群體結(jié)合分子標(biāo)記方法，研究學(xué)者定位了多個株型性狀的QTL［7-17］，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和統(tǒng)計分析技術(shù)的不斷發(fā)展，通過自然群體結(jié)合關(guān)聯(lián)分析方法，多個株型相關(guān)性狀優(yōu)異等位變異進(jìn)一步被發(fā)掘定位［18-23］，為棉花株型性狀的分子育種研究奠定了基礎(chǔ)。

隨著新疆棉花機械化采收的不斷普及，對適宜機采棉花株型性狀提出更高的要求，迫切需要科研人員加大對棉花株型分子育種的研究，以加速品種選育速度，提高選育效率。盡管前人在株型性狀基因挖掘方面做了大量工作，但目前仍缺少主效QTL應(yīng)用于棉花株型育種中。

本研究以我國不同棉區(qū)的403 份陸地棉品種資源為主要研究對象，在新疆機采棉栽培模式下，通過對4 個主要株型性狀因子的多年多點性狀調(diào)查鑒定，并結(jié)合SSR 標(biāo)記的全基因組掃描關(guān)聯(lián)分析研究，進(jìn)一步發(fā)掘以上性狀的關(guān)聯(lián)位點及優(yōu)異等位基因，為新疆棉花株型性狀分子育種提供材料和標(biāo)記來源。

1 材料與方法

1.1 材料

選取403 份陸地棉種質(zhì)資源為試驗材料，來自新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花研究所多年來收集保存的國內(nèi)外種質(zhì)資源，其中來自于我國西北內(nèi)陸棉區(qū)的有199 份，占總材料份數(shù)的49.4%；來自于黃河流域棉區(qū)的有87 份，占總材料份數(shù)的21.6%；來自于長江流域棉區(qū)的有63 份，占總材料份數(shù)的15.6%；來自于北部特早熟棉區(qū)的有29 份，占總材料份數(shù)的7.2%；來自于國外的有25 份，占總材料份數(shù)的6.2%（具體材料名稱及來源詳見附表1）。

表1 不同環(huán)境下4 個主要農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計分析Table 1 Descriptive statistics for main agronomic traits in different environments

1.2 方法

1.2.1 性狀調(diào)查及數(shù)據(jù)處理 試驗于2013 年、2014年、2015 年連續(xù)3 年分別在新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花研究所北疆育種試驗站（石河子）與南疆育種試驗站（庫爾勒）2 個不同環(huán)境種植上述403 份材料，各試驗點田間試驗設(shè)計采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，3 次重復(fù)，雙行區(qū)，平均行距42.5 cm，平均株距10 cm，采取人工點播種植，膜下滴灌栽培，從出苗到吐絮全程化控6 次，平均每畝用縮節(jié)胺20 g，7 月10 日采用人工打頂方式打頂，其他田間管理措施以當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)方法進(jìn)行。分別在棉花成鈴后期在各重復(fù)中每小區(qū)選中間連續(xù)10 株調(diào)查株高（plant height, PH）、果枝始節(jié)高（height of first fruit branch node, HNFFB）、果枝始節(jié)位（the first fruit branch node, NFFB）、果枝數(shù)（fruit branch number, FBN）4 個主要株型性狀，各環(huán)境分別定義為：SHZ13、KRL13、SHZ14、KRL14、SHZ15和KRL15。采用R語言的Ime4軟件包，計算獲得各環(huán)境各性狀表型的最佳線性無偏預(yù)測值（best linear unbiased prediction, BLUP），用于后續(xù)關(guān)聯(lián)分析。

1.2.2 基因型鑒定及關(guān)聯(lián)分析 參考Zhao 等［24］發(fā)表的棉花四倍體分子遺傳圖譜，在每條染色體上平均每隔10 cM 左右選取一個SSR 分子標(biāo)記，并進(jìn)一步結(jié)合前人已發(fā)表的在陸地棉中多態(tài)性較好的SSR 標(biāo)記結(jié)果［25-27］，選取均勻分布在26 條染色體的560 對引物對群體進(jìn)行PCR 擴增分析。SSR 標(biāo)記引物序列來自CMD（cotton marker database）數(shù)據(jù)庫（http://www.cottonmarker.org），標(biāo)記名稱中的大寫字母，如BNL、JESPR、HAU、NAU 等表示引物的來源，引物名稱后的小寫字母“a”“b”“c”“d”等代表標(biāo)記的多態(tài)性位點，且位點順序依次按分子量由大到小排列。群體結(jié)構(gòu)分析、連鎖不平衡分析及關(guān)聯(lián)分析詳見文獻(xiàn)［28］。

1.2.3 優(yōu)異等位變異挖掘 優(yōu)異等位變異參考錢能［29］的方法計算，ai =（Σxij/ni）-（ΣNk/nk）。其中，ai 代表第i 個等位變異的表型效應(yīng)值，xij 為攜帶第i 個等位變異的第j 材料性狀表型測定值，ni 為具有第i 等位變異 的材料數(shù)，Nk 為所有材料的表型測定值, nk 為材料數(shù)。若ai 為正, 則認(rèn)為該等位變異為增效等位變異，反之為減效等位變異。最終獲得與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點等位變異、表型效應(yīng)及典型品種。

2 結(jié)果

2.1 表型性狀分析

403 份陸地棉種質(zhì)材料的4 個主要農(nóng)藝性狀3年兩點6 個環(huán)境的表型值及BLUP 值統(tǒng)計結(jié)果如表1 所示。結(jié)果顯示，4 個性狀6 環(huán)境平均變異系數(shù)分別為，株高13.70%、果枝始節(jié)高21.51%、果枝始節(jié)位14.18%、果枝數(shù)11.51%；聯(lián)合方差分析結(jié)果表明，4 個性狀的基因型、基因型與環(huán)境互作變異方差均達(dá)極顯著水平；4 個性狀的廣義遺傳率變化范圍介于46.24%-74.15%，其中最高的為果枝始節(jié)高，最低的為果枝數(shù)。4 個性狀的BLUP 結(jié)果顯示，均符合正態(tài)分布規(guī)律（圖1）。

圖1 4 個主要農(nóng)藝性狀的BLUP 值頻率分布圖Fig.1 Frequency distributions of the BLUP of four main agronomic traits

2.2 基因型分析

對403 份種質(zhì)材料先按照不同棉區(qū)的生態(tài)來源信息選取遺傳差異較大的48 份材料，結(jié)合選取的560 對SSR 引物進(jìn)行小群體的標(biāo)記鑒定。最終獲得多態(tài)性明顯、易于確認(rèn)的SSR 標(biāo)記201 對。201 對標(biāo)記分別分布在棉花基因組的26 條染色體上（A亞組分布91 對，D 亞組分布110 對），其中標(biāo)記最多的是D05 染色體（18 對），最少的是A02 染色體（3 對）。進(jìn)一步對201 對SSR 標(biāo)記進(jìn)行了大群體分子標(biāo)記鑒定。結(jié)果（表2）表明，201 對SSR 標(biāo)記位點在403 份材料中共檢測到394 個等位變異，每個標(biāo)記的平均等位變異為1.96 個，變幅為1-4；每個標(biāo)記的平均基因型為4 個，變幅為2-14；平均等位基因頻率為0.563，變幅為0.501-0.923；平均遺傳多樣性指數(shù)為0.556，變幅為0.142-0.699；平均多態(tài)信息含量為0.483，變幅為0.132-0.677。

表2 201 對多態(tài)性SSR 標(biāo)記在403 份材料中的引物多態(tài)性信息Table 2 Polymorphism information of 201 SSR loci in 403 experiment materials

2.3 關(guān)聯(lián)分析

利用TASSEL 5.0 軟件的混合線性模型MLM 程序，將上述394 個位點的等位變異分別與各個性狀的6 個環(huán)境的表型值及BLUP 值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。為最大程度地避免虛假關(guān)聯(lián)的出現(xiàn)，研究結(jié)果只考慮能同時在BLUP 結(jié)果（P ＜ 0.01）和2 個以上環(huán)境中檢測到的顯著（P ＜ 0.05）關(guān)聯(lián)的位點。結(jié)果表明，4 個主要農(nóng)藝性狀共檢測到38 個位點（表3），與株高（PH）關(guān)聯(lián)的位點共16 個，不同環(huán)境中表型變異解釋率0.99%-5.00%，除BLUP 外，能同時在2個環(huán)境中檢測到的位點有7 個、3 個環(huán)境中檢測到的有2 個、4 個環(huán)境中檢測到的有1 個、5 個環(huán)境中檢測到的有5 個，BNL3089a 能同時在6 個環(huán)境中全部檢測到；與果枝始節(jié)高（HNFFB）關(guān)聯(lián)的位點共6 個，不同環(huán)境中表型變異解釋率0.98%-3.65%，除BLUP 外，能同時在2 個環(huán)境中檢測到的位點有2 個、3 個環(huán)境中檢測到的有3 個、4 個環(huán)境中檢測到的有1 個；與果枝始節(jié)位（NFFB）關(guān)聯(lián)的位點共11 個，不同環(huán)境中表型變異解釋率0.97%-3.93%，除BLUP 外，能同時在2 個環(huán)境中檢測到的位點有5個、3 個環(huán)境中檢測到的有3 個、4 個環(huán)境中檢測到的有2 個、5 個環(huán)境中檢測到的有1 個；與果枝數(shù)（FBN）關(guān)聯(lián)的位點共5 個，不同環(huán)境中表型變異解釋率1.00%-2.63%，除BLUP 外，能同時在2 個環(huán)境中檢測到的位點有2 個、3 個環(huán)境中檢測到的有2個、4 個環(huán)境中檢測到的有1 個。

表3 與主要農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點及其在多環(huán)境下表型變異的解釋率Table 3 Marker loci associated with major agronomic traits and their explained portions of phenotypic variation in multiple environments

2.4 優(yōu)異等位變異及典型材料挖掘

在上述關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，對上述標(biāo)記位點進(jìn)行等位變異表型效應(yīng)的計算、統(tǒng)計和分析，并進(jìn)一步結(jié)合育種實際，確定優(yōu)異等位變異，共發(fā)掘含有目標(biāo)性狀的優(yōu)良載體材料31 份（表4）。有6份材料同時攜帶多個優(yōu)異等位變異，其中，同時攜帶2 個性狀的優(yōu)異等位變異載體材料有4 份，分別為09?19?7 含有株高和果枝始節(jié)高的優(yōu)異等位變異（增效效應(yīng)），BLUP 值分別為81.7 和25.8 cm；中棉所64 含有株高和果枝始節(jié)高的優(yōu)異等位變異（減效效應(yīng)），BLUP 值分別為44.2 和12.1 cm；DP2824?092 含有株高和果枝始節(jié)高的優(yōu)異等位變異（減效效應(yīng)），BLUP 值分別為45.2 和13 cm；惠和28 含有果枝始節(jié)高和果枝始節(jié)位的優(yōu)異等位變異（增效效應(yīng)），BLUP 值分別為26.3 cm 和6.3。而德夏棉1號和中221 兩個材料則同時攜帶株高、果枝始節(jié)高和果枝始節(jié)位等3 個性狀的優(yōu)異等位變異（減效效應(yīng)），BLUP 值分別為39.5 cm、10.5 cm、4.2 和45.6 cm、11.3 cm、4.2。

表4 與農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點等位變異對應(yīng)的表型效應(yīng)Table 4 Phenotypic effect corresponding to locus allelic variations significantly associated with agronomic traits

3 討論

3.1 開展陸地棉株型育種的重要性

棉花具有多年生、無限生長的特性，具有復(fù)雜的分枝模式，側(cè)枝較長、松散的株型不利于棉花單產(chǎn)提高和機械化采摘［30］。棉花株型性狀的遺傳解析是棉花理想株型育種的理論基礎(chǔ)。對于新疆機采棉而言，要求株型緊湊，株高80-90 cm，果枝始節(jié)位高［21,31］，才能達(dá)到農(nóng)機農(nóng)藝融合，提高機械采摘質(zhì)量，減少原棉雜質(zhì)污染，從而提高機采棉經(jīng)濟效益。本研究利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，對403 份陸地棉種質(zhì)材料進(jìn)行4 個主要株型性狀因子的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)掘株型相關(guān)遺傳位點及優(yōu)異等位變異，為加強新疆棉花株型分子育種基礎(chǔ)研究，以及加快新疆機采棉育種速度提供理論基礎(chǔ)。

3.2 影響關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的主要因素

近年來，由于分子標(biāo)記技術(shù)及統(tǒng)計分析技術(shù)的不斷發(fā)展，使關(guān)聯(lián)分析在植物研究中得到廣泛應(yīng)用，成為近年來研究的熱點，本研究利用201 對SSR 標(biāo)記位點在403 份材料中共檢測到394 個等位變異，其中38 個等位變異與棉花主要株型性狀相關(guān)聯(lián)，為陸地棉株型分子育種提供了較好的理論基礎(chǔ)。對關(guān)聯(lián)分析而言，精準(zhǔn)的表型性狀值及廣泛分布不同基因組的多態(tài)性標(biāo)記可為關(guān)聯(lián)分析研究提供更為準(zhǔn)確的結(jié)果。本研究在表型鑒定上，采用多年多點多重復(fù)的表型鑒定，且在統(tǒng)計分析中進(jìn)一步采用最佳無偏線性預(yù)測的BLUP 方法，提高了表型結(jié)果的準(zhǔn)確性；在標(biāo)記選擇上選取均勻分布在不同染色體上的標(biāo)記，進(jìn)一步提高了檢測效率。但要進(jìn)行更為有效的全基因組關(guān)聯(lián)掃描，按照陸地棉染色體圖譜5 000 cM 的遺傳距離計算，結(jié)合連鎖不平衡衰減程度，需要1 000 個左右的多態(tài)性位點［32］。本研究201 個多態(tài)性標(biāo)記共產(chǎn)生394 個多態(tài)位點，僅能達(dá)到粗略的基因組掃描，如要對控制重要育種目標(biāo)性狀基因進(jìn)行精細(xì)定位，仍需增加更多標(biāo)記。

3.3 多個關(guān)聯(lián)位點的一因多效性分析

基因連鎖和多效性是生物體遺傳學(xué)研究中常見的現(xiàn)象。本研究檢測到的38 個位點中，其中有5個標(biāo)記位點同時與多個性狀相關(guān)聯(lián)，NAU2336b 同時與果枝始節(jié)高和果枝始節(jié)位相關(guān)聯(lián)，NAU2931a同時與果枝始節(jié)位和果枝數(shù)相關(guān)聯(lián)，NAU2631a、NAU3308a 同時與株高和果枝始節(jié)高相關(guān)聯(lián)，NAU911b 同時與株高和果枝始節(jié)位相關(guān)聯(lián)。說明這些標(biāo)記具有一因多效性，有同步改良多個育種目標(biāo)性狀的潛力，以實現(xiàn)多個育種目標(biāo)性狀的聚合育種研究。自然和人工表型選擇可以解釋棉花馴化過程中的基因連鎖和一因多效性現(xiàn)象。另外，本研究檢測到38 個關(guān)聯(lián)位點中發(fā)現(xiàn)，有4 個位點與前人通過連鎖分析定位得到的株型及相關(guān)性狀的QTL 結(jié)果一致（表5），說明這些標(biāo)記具有較好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。上述標(biāo)記可為進(jìn)一步理解棉花株型性狀的遺傳機理提供理論依據(jù)，并可為后期棉花株型性狀的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供實踐指導(dǎo)。

表5 本研究檢測到的主要育種目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)位點與前人研究的比較Table 5 Comparison of QTL associated with main breeding target traits detected in this study to the previous studies

3.4 優(yōu)異等位變異及相應(yīng)載體材料的應(yīng)用

挖掘與育種目標(biāo)性狀相關(guān)的優(yōu)異種質(zhì)是棉花育種研究的重要內(nèi)容之一。本研究在關(guān)聯(lián)分析基礎(chǔ)上，挖掘得到含有目標(biāo)性狀的優(yōu)良載體材料31 份。結(jié)合育種實際，4 個性狀可根據(jù)不同的育種目標(biāo)確定其相應(yīng)的優(yōu)異等位變異，例如，對株高而言，如進(jìn)行矮稈育種，可選擇表型效應(yīng)為負(fù)值的，如NAU911b是減效（?7.27 cm）表型效應(yīng)最大的等位變異，典型材料有德夏棉1 號、中221 和中棉所50；對果枝始節(jié)高而言，如進(jìn)行適宜機采的株型育種，可選擇表型效應(yīng)為正值的，如NAU2336b 是增效（+0.33 cm）表型效應(yīng)最大的等位變異，典型材料有09?19?7、恵和28、恵遠(yuǎn)14?19。上述材料可作為優(yōu)異親本用于棉花株型育種的性狀改良。另外，在株高性狀的研究中，本研究發(fā)掘到11 個表現(xiàn)為株高性狀增效效應(yīng)的優(yōu)異等位變異，典型材料主要有09?19?7、金墾69?2、Y11、110?47、C2、10?1，發(fā)現(xiàn)這6 份材料均來源于西北內(nèi)陸棉區(qū)，分析其原因可能為來源于其他棉區(qū)的材料由于對縮節(jié)胺較為敏感，對棉花生長有一定的抑制作用，表現(xiàn)為株高低于80 cm，不適宜機械采收。因此建議長江流域、黃河流域等棉區(qū)品種在新疆棉區(qū)種植應(yīng)降低縮節(jié)胺的使用量。

4 結(jié)論

在陸地棉品種（系）群體中共鑒定到38 個與4個株型性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點，其中，有5 個標(biāo)記位點同時與多個性狀相關(guān)聯(lián)；發(fā)掘出31 份含有優(yōu)異等位基因的典型材料，其中6 份材料同時攜帶多個優(yōu)異等位基因。

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