楊偉成 孫巖 楊倩 王壯琳 馬菊花 薛金愛 李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷 030801）

陸地棉是我國重要的經(jīng)濟(jì)纖維作物，也是世界上繼大豆、油棕、油菜和向日葵之后的第五大油料作物，作為棉花重要副產(chǎn)物的棉籽，油含量可達(dá)25%-39%，是我國重要的植物油來源。棉籽油不僅為人體提供必需的脂肪酸營養(yǎng)，還可用于食品加工等。在工業(yè)上，棉籽油可用于生產(chǎn)肥皂、潤滑油等溶劑，也是制備生物柴油的重要來源［1-2］。因此，研究棉籽脂肪酸代謝及其調(diào)控機(jī)制，對于提高種子含油量以及陸地棉生長發(fā)育調(diào)控等具有重要意義。

植物脂質(zhì)不僅是人類食物和營養(yǎng)的主要來源，還是一種重要的工業(yè)原材料［3］。脂肪酸是植物脂質(zhì)的重要組成部分，它們既是重要的儲能物質(zhì)，還是維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整和功能穩(wěn)定的關(guān)鍵成分，參與植物對逆境脅迫應(yīng)答等生物學(xué)過程［4］。

高等植物中脂肪酸的從頭合成途徑主要在質(zhì)體中進(jìn)行，這一過程是由脂肪酸合酶復(fù)合體催化的多次循環(huán)過程。其中新合成的部分脂肪酸會通過原核途徑整合到質(zhì)體內(nèi)膜上，而大部分脂肪酸則會經(jīng)過真核途徑被運(yùn)輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行進(jìn)一步的加工與修飾。盡管科學(xué)家們很早之前就已證實(shí)了游離脂肪酸可以跨過質(zhì)體膜并向外運(yùn)輸，但卻沒有確切證實(shí)生物體內(nèi)是否存在有效的負(fù)責(zé)脂肪酸跨過質(zhì)體膜向外運(yùn)輸?shù)牡鞍住?/p>

2015 年，Li 等［5］首 次 從 擬 南 芥 中 克 隆 了Tmemb_14 蛋白亞家族成員（AtFAX1），亞細(xì)胞定位顯示，該基因定位于質(zhì)體內(nèi)膜。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥fax1 突變株內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中脂質(zhì)含量顯著降低，而質(zhì)體內(nèi)的脂質(zhì)含量卻有明顯增加，過表達(dá)AtFAX1 則表現(xiàn)出相反的結(jié)果，同時(shí)，過表達(dá)AtFAX1 可使酵母脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)突變株的表型恢復(fù)至野生株的水平，證實(shí)了AtFAX1 具有介導(dǎo)質(zhì)體內(nèi)脂肪酸向外輸出的功能。金龍飛等［6］發(fā)現(xiàn)，在油棕中過表達(dá)EgFAX1，油棕花和果實(shí)的油脂含量也呈現(xiàn)上升趨勢。Li 等［7］在衣藻中過表達(dá)CrFAX1 和CrFAX2 可以顯著提高藻細(xì)胞的油脂含量，并主要轉(zhuǎn)運(yùn)C16:0、C18:0 和C18:3，從而為TAG 和MGDG 的合成提供底物。同樣，在紅藻中過表達(dá)CmFAX1 也得到類似結(jié)果［8］。表明脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（fatty acid export, FAX）可通過脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑來影響植物油脂的積累量。此外，研究還證明，不飽和脂肪酸及其衍生物參與調(diào)控植物對多種非生物脅迫的響應(yīng)［9］。如多不飽和脂肪酸在質(zhì)體膜中的含量影響膜脂的流動性，并影響植物對環(huán)境溫度的適應(yīng)性［10-11］。過表達(dá)水稻脂肪酸去飽和酶基因2（FAD2），能顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗寒性［12］。植物在熱脅迫條件下，亞麻酸（C18:3）過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的丙二酸能夠?qū)夂献饔孟嚓P(guān)蛋白進(jìn)行修飾［13］，而FAX 通過行使脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的功能在一定程度上能改變植物脂肪酸組分［14］，因此，F(xiàn)AX 與植物脅迫反應(yīng)密切相關(guān)。

本研究基于陸地棉全基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，對陸地棉FAX 家族基因進(jìn)行挖掘和功能分析，為分析陸地棉油脂積累的分子機(jī)制和油脂代謝工程提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

本氏煙草（Nicotiana benthamiana）、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 菌 株、 根 癌 農(nóng) 桿 菌（Agrobacterium tumefactions）GV3101 菌種、植物表達(dá)載體pCAMBIA1300 和pCAMBIA1303，以及供試材料陸地棉品種翼豐1271 均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 陸地棉GhFAX 蛋白家族基因的鑒定及生理生化性質(zhì)分析 根據(jù)已報(bào)道的擬南芥AtFAX1 蛋白序列，利用BLAST 搜索棉花基因組數(shù)據(jù)庫CottonFGD（https://cottonfgd.org/），去除冗余后篩選得到GhFAXs基因，分別下載其編碼蛋白序列、基因組序列及CDS 序 列， 利 用Pfam（http://pfam.xfam.org/） 及SMART（http://smart.embl?heidelberg.de/）數(shù) 據(jù) 庫 進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域鑒定，剔除不含Tmemb_14 結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。利用ExPASy?ProtParam 網(wǎng)站（https://web.expasy.org/protparam/）在線分析棉花FAX 基因理化性質(zhì)；TBtools 進(jìn)行GhFAX 基因染色體定位；WoLF PSORT 在線工具（https://wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

利用MEGA7 軟件對棉花FAX 基因家族蛋白序列進(jìn)行比對，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，通過在線軟件iTOL（https://itol.embl.de/）進(jìn)行繪圖。使用在線工具GSDS（http://gsds.gao?lab.org/index.php）對陸地棉FAX 基因家族進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，MEME（http://meme?suite.org/）預(yù) 測 棉 花FAX蛋白保守基序。通過Plant CARE（https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/5261）在線網(wǎng)站對PRX 基因上游2 000 bp 序列進(jìn)行順式作用元件分析，采用TBtools 軟件進(jìn)行整合繪圖。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析 在BRAD 數(shù)據(jù)庫中下載轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對陸地棉FAX 基因在根、莖、葉、果實(shí)、花，以及前中后3 個(gè)時(shí)期胚珠中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，用TBtools 軟件繪制表達(dá)熱圖。

1.2.3 GhFAXs 表達(dá)分析 提取棉花根、莖、葉，以及前中后3 個(gè)時(shí)期胚珠的RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GhFAX 基因的CDS 序列，設(shè)計(jì)qPCR引物，以棉花histone 為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量分析。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 GhFAX1 的亞細(xì)胞定位 構(gòu)建35S∷GhFAX?1∷GFP 亞細(xì)胞定位載體，將正確的重組載體農(nóng)桿菌接種于含卡那霉素和利福平的LB 液體培養(yǎng)基中，以35S∷GFP 空載農(nóng)桿菌為對照，28℃ 100 r/min 過夜培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6。4℃ 5 000 r/min 離心8-10 min，收集菌體沉淀。用現(xiàn)配的侵染液重懸菌體沉淀，將菌液濃度調(diào)至OD600約為0.2，室溫避光孵育2-4 h 后侵染煙草葉片。選取長勢一致且生長健壯、顏色鮮綠的煙草幼苗（6 周齡）為試驗(yàn)材料，用現(xiàn)配的侵染液注射侵染，浸染2 d 的煙草撕取其表皮細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 GhFAX1 表達(dá)載體的構(gòu)建 試驗(yàn)所用的植物表達(dá)載體pCAMBIA1303 由CaMV35S 啟動子驅(qū)動，含有卡那霉素抗性。選擇Xba I 和Kpn I 為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)同源臂引物，使用同源臂引物擴(kuò)增GhFAX1，同時(shí)對pCAMBIA1303 用Xba I 和Kpn I 進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，用DNA 連接酶連接，得到重組表達(dá)載體pCAMBIA1303?GhFAX1。然后，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)PCR 和雙酶切試驗(yàn)鑒定陽性克隆。酵母表達(dá)載體為pYES2.0，含URA3 位點(diǎn)和氨芐青霉素抗性。選擇Xba I 和BamH I 為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)同源臂引物，使用同源臂引物擴(kuò)增GhFAX1，連入pYES2.0 中形成重組酵母表達(dá)載體pYES2.0?GhFAX1，轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α 并驗(yàn)證成功。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因酵母鑒定與底物偏好性試驗(yàn) 釀酒酵母菌株INVSc1 在YPD 培養(yǎng)基中于28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600為0.5 左右時(shí)，離心收集細(xì)胞，用無菌水洗滌。將上述構(gòu)建成功的酵母表達(dá)載體pYES2.0?GhFAX1 轉(zhuǎn)入酵母中，經(jīng)過缺尿嘧啶（SC?URA）培養(yǎng)基篩選和PCR 鑒定出陽性轉(zhuǎn)基因酵母。選取陽性轉(zhuǎn)基因酵母菌液，接種到已經(jīng)外源添加C16:0、C18:0、C18:1、C18:2 的SC?URA 液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)96 h，在0、4、8、12、24、36、48、72 和96 h 時(shí)，使用分光光度計(jì)在OD600下檢測轉(zhuǎn)基因酵母生長情況，收集菌體沉淀物置于?80℃保存，使用真空冷凍干燥機(jī)對其進(jìn)行冷凍干燥，研磨成粉末，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 轉(zhuǎn)基因煙草的獲取 構(gòu)建pCAMBIA1303?GhFAX1 植物表達(dá)載體，將目的基因片段與雙酶切且純化后的pCAMBIA1303 載體相連接。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，把含有外源基因GhFAX1 的農(nóng)桿菌擴(kuò)繁，以潮霉素作為篩選標(biāo)記，將植物表達(dá)pCAMBIA1303?GhFAX1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入煙草中，以獲得轉(zhuǎn)基因植株。

2 結(jié)果

2.1 GhFAX基因家族鑒定及理化性質(zhì)分析

以擬南芥數(shù)據(jù)庫中的FAX 家族蛋白序列為基礎(chǔ)，通過序列比對，在陸地棉全基因組一共發(fā)現(xiàn)12 條FAX 同源序列；基因主要分布在A、D 兩個(gè)亞組中，根據(jù)基因在染色體的分布位置，將處于scaffold_93 的基因命名為GhFAX1，分布于A 亞組FAX 基因從A01 染色體開始，分別命名為GhFAX2-GhFAX6；分布D 亞組的從D01 染色體開始，分別命名為GhFAX7-GhFAX12。

GhFAX 家族基因編碼蛋白序列長度差距較大，蛋白序列最長的為GhFAX3，由325 個(gè)氨基酸構(gòu)成；最短蛋白序列為GhFAX2，只含有92 個(gè)氨基酸。對GhFAX 家族蛋白的等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，除GhFAX10的等電點(diǎn)小于7 外，其余GhFAX 蛋白等電點(diǎn)均高于7。根據(jù)不穩(wěn)定系數(shù)結(jié)果表明，GhFAX1、GhFAX10、GhFAX8、GhFAX3 的不穩(wěn)定系數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白；其余8 個(gè)GhFAX 蛋白均表現(xiàn)為穩(wěn)定蛋白。GhFAX10、GhFAX8、GhFAX3 的親水指數(shù)為負(fù)數(shù)，表明這3 個(gè)蛋白為親水性蛋白；其余9 個(gè)GhFAX蛋白均表現(xiàn)為疏水性蛋白（表1）。使用TargetP 軟件對GhFAX 家族蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，GhFAX 家族蛋白都定位于質(zhì)體中。對GhFAX 家族蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)，GhFAX 家族蛋白不含信號肽。

表1 棉花FAX 家族蛋白性質(zhì)分析Table 1 Analysis of the properties of the FAX family proteins in G.hirsutum

2.2 陸地棉FAX家族蛋白序列對比與進(jìn)化樹分析

通過對陸地棉FAX 家族蛋白與擬南芥FAX 家族蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果（圖1）表明，F(xiàn)AX 家族蛋白的氨基酸序列相似度較低，只有少數(shù)位置的氨基酸具有保守性。其中保守性強(qiáng)的氨基酸為G、S、V、L、I、Y、K、F，這些保守的氨基酸可能對于FAX 家族蛋白的功能較為重要。

圖1 陸地棉FAX 家族蛋白氨基酸序列比對Fig.1 Multiple sequence alignment of FAX family protein in G.hirsutum

為確定棉花種內(nèi)FAX 蛋白的進(jìn)化關(guān)系，對陸地棉（Gossypium hirsutum）、海島棉（G.barbadense）、亞洲棉（G.arboreum）、雷蒙德氏棉（G.raimondii）的FAX 的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖2）， 共 分 為3 個(gè) 類 群， 陸 地 棉 中 的GhFAX4、GhFAX9 與海島棉中的GbFAX4 和GbFAX11、亞洲棉GaFAX2、雷蒙德氏棉GrFAX3 為第一組；陸地 棉 中 的4 個(gè)FAX 家 族 蛋 白GhFAX2、GhFAX5、GhFAX7、GhFAX11，與 海 島 棉 中 的7 個(gè)FAX 家族 蛋 白GbFAX1、GbFAX5、GbFAX6、GbFAX8、GbFAX12、GbFAX13、GbFAX15， 亞 洲 棉 中 的3個(gè)FAX 家族蛋白GaFAX1、GaFAX5、GaFAX6，以及雷蒙德氏棉中的3 個(gè)FAX 家族蛋白GrFAX1、GrFAX2、GrFAX6，共計(jì)17 個(gè)FAX 蛋白為第二組；陸地棉中的6 個(gè)FAX 家族蛋白GhFAX1、GhFAX3、GhFAX6、GhFAX8、GhFAX10、GhFAX12， 海 島棉 中 的6 個(gè)FAX 家 族 蛋 白GbFAX2、GbFAX3、GbFAX7、GbFAX9、GbFAX10、GbFAX14， 亞洲 棉 中 的3 個(gè)FAX 家 族 蛋 白GaFAX3、GaFAX4、GaFAX7，以及雷蒙德氏棉中的3 個(gè)FAX 家族蛋白GrFAX4、GrFAX5、GrFAX7， 共 計(jì)18 個(gè)FAX 蛋白為第三組。第三組中FAX 蛋白最多，含有18 個(gè)FAX 蛋白，占4 種棉花FAX 家族蛋白的43.9%；對第三組蛋白序列具體分析發(fā)現(xiàn)，這組蛋白序列基本以3 種FAX 蛋白為1 小組，共有6 小組，每小組蛋白基本處于1 個(gè)陸地棉FAX 家族蛋白+1 個(gè)海島棉FAX 家族蛋白+1 個(gè)亞洲棉FAX 家族蛋白或者1 個(gè)雷蒙德氏棉FAX 家族蛋白。

2.3 GhFAXs基因的染色體定位與共線性分析

GhFAXs 基因較為均勻地分布在10 條染色體上（圖3），其中，GhFAX9 和GhFAX10 分布在D03 染色體。為了挖掘GhFAX 基因家族的進(jìn)化擴(kuò)張與棉花全基因組復(fù)制事件的關(guān)系，利用TBtools 中的One Step MCScanX分析了GhFAX基因家族內(nèi)的復(fù)制基因，共有10 個(gè)GhFAXs 基因參與了基因復(fù)制，占GhFAXs基因總數(shù)量的83.33%。如圖3 所示，GhFAXs 基因只存在片段復(fù)制，共有13 對片段復(fù)制基因分布在10 條染色體上。表明片段復(fù)制是陸地棉FAX 進(jìn)化擴(kuò)張的驅(qū)動力。

圖3 陸地棉GhFAXs 基因在染色體上的分布Fig.3 Distribution of GhFAXs genes on the chromosomes of G.hirsutum

2.4 GhFAXs基因結(jié)構(gòu)及基因保守基序分析

在陸地棉FAX 基因家族蛋白序列的進(jìn)化樹基礎(chǔ)上進(jìn)行保守基序分析，結(jié)果（圖4?A）顯示，GhFAXs 基因可分為4 個(gè)類群，GhFAX4、GhFAX9 為類群一；GhFAX3、GhFAX6、GhFAX8、GhFAX12 為類 群 二；GhFAX1、GhFAX10 為 類 群 三；GhFAX2、GhFAX5、GhFAX7、GhFAX11 為類群四。親緣關(guān)系越近的成員其基序結(jié)構(gòu)越相似，整個(gè)GhFAX 共有3種Motif，且除個(gè)別蛋白外，都相對不保守（圖4?B）。其 中GhFAX2 只 含 有Motif 2；GhFAX4、GhFAX9只 含 有Motif 1；GhFAX5、GhFAX7、GhFAX11 含有Motif1、Motif2；GhFAX1、GhFAX3、GhFAX6、GhFAX8、GhFAX10、GhFAX12 包含3 種Motif。

圖4 陸地棉FAX 家族基因結(jié)構(gòu)（A）與氨基酸構(gòu)成分析（B）Fig.4 Analysis of FAX family gene structure（A）and amino acid composition（B）in G.hirsutum

對陸地棉FAX 基因家族蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果（圖4?A）表明，GhFAX 家族均含有Tmemb_14功能結(jié)構(gòu)域；除此之外，GhFAX12 還含有TPH superfamily，GhFAX3 含有PTZ00121 superfamily。

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明（圖4?A），類群四中GhFAX 家族基因均含有3 個(gè)外顯子；類群一中，GhFAX 家族基因均含有4 個(gè)外顯子；在類群二中，僅GhFAX6 含 有5 個(gè) 外 顯 子，GhFAX3、GhFAX8、GhFAX12 含有6 個(gè)外顯子；類群三中，GhFAX 家族基因均含有6 個(gè)外顯子。結(jié)合蛋白序列進(jìn)化樹和基因結(jié)構(gòu)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陸地棉基因結(jié)構(gòu)差異與蛋白序列之間的進(jìn)化關(guān)系基本保持一致。

2.5 GhFAXs基因啟動子順式作用元件分析

通過對GhFAX 家族啟動子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測，進(jìn)一步解析GhFAXs 基因的生物學(xué)功能（圖5）。根據(jù)功能不同，這些順式作用元件主要分為3 類，第一類主要包括生長發(fā)育相關(guān)作用元件，包括分生組織表達(dá)元件、胚乳表達(dá)元件、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)元件；第二類為激素應(yīng)答元件，例如水楊酸響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件等；第三類為環(huán)境或脅迫應(yīng)答元件，包括光響應(yīng)元件、參與干旱誘導(dǎo)、參與低溫反應(yīng)、晝夜調(diào)控、防御與應(yīng)激、厭氧誘導(dǎo)元件。在這3 類順式作用元件中，參與環(huán)境或脅迫應(yīng)答元件最多，共有142 個(gè)元件，其中參與光響應(yīng)元件最多，共有36 個(gè)。在GhFAX 家族中，GhFAX12 含有最多的順式作用元件，共有48個(gè)，其中茉莉酸甲酯響應(yīng)元件最多，共有16 個(gè)，除此外GhFAX12 啟動子中含有最多響應(yīng)脅迫的順式作用元件，推測GhFAX12 可能會參與陸地棉脅迫響應(yīng)。

圖5 陸地棉GhFAXs 基因的啟動子順式作用元件分析Fig.5 Cis-acting elements analysis of GhFAXs genes in G.hirsutum

2.6 GhFAX家族蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

為了分析GhFAX 家族蛋白空間結(jié)構(gòu)的差異，利用SWISS?MODEL 對GhFAX 家族蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果（圖6）表明，盡管GhFAX 家族蛋白氨基酸數(shù)量和組成差異很大，但三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，GhFAX 家族蛋白三維結(jié)構(gòu)較為相似，除GhFAX2 含有3 個(gè)α 螺旋、GhFAX10 含有2 個(gè)α 螺旋外，其余10 個(gè)GhFAX 家族蛋白均含有4 個(gè)α 螺旋。利用TMHMM 在線軟件對GhFAX 家族蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果（圖6）表明，盡管GhFAX家族蛋白在序列長度和蛋白基序上保守性較低，但均包含跨膜結(jié)構(gòu)域，1 個(gè)GhFAX 含有2 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，5 個(gè)GhFAX 含有3 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，6 個(gè)GhFAX 含有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。GhFAX 家族蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的位置與α螺旋的分布一致，說明在GhFAX 家族蛋白中蛋白的膜定位與α 螺旋相關(guān)。由于GhFAX 家族蛋白均含有跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)合其可能具有的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性，推測GhFAX 家族蛋白可能位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體或者質(zhì)膜參與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖6 陸地棉FAX 家族蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域與三維結(jié)果預(yù)測Fig.6 Transmembrane domain and 3D result prediction of the FAX family proteins in G.hirsutum

2.7 GhFAXs家族基因的基因組織轉(zhuǎn)錄組分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明（圖7），在冷脅迫下，GhFAX家族中GhFAX9 從開始1-6 h 時(shí)持續(xù)高表達(dá)，并在6 h 達(dá)到峰值，與對照相比具有極顯著差異，推測該基因在陸地棉響應(yīng)冷脅迫過程中具有正向調(diào)控作用，GhFAX5 和GhFAX11 在受到冷脅迫1 h 后，表達(dá)量持續(xù)下降，推測該基因在陸地棉響應(yīng)冷脅迫過程中具有負(fù)向調(diào)控作用。

圖7 陸地棉FAX 基因在不同脅迫中的表達(dá)模式Fig.7 Expression patterns of FAX genes in G.hirsutum under different stresses

在高溫脅迫下，GhFAX 家族中GhFAX1、Gh?FAX10 在剛開始脅迫時(shí)表達(dá)量迅速下降，但在后期逐漸恢復(fù)；GhFAX3 在高溫脅迫3 h 后隨著脅迫時(shí)間的增加，表達(dá)量也在持續(xù)上升，推測該基因在陸地棉響應(yīng)高溫脅迫過程中具有正向調(diào)控作用。

在鹽脅迫下，GhFAX1、GhFAX9、GhFAX10 的表達(dá)量下降，其中GhFAX1 與GhFAX10 在脅迫后3 h 表達(dá)量到達(dá)最低，GhFAX9 在受到鹽脅迫后，表達(dá)量持續(xù)下降，推測該基因在陸地棉響應(yīng)鹽脅迫過程中具有負(fù)向調(diào)控作用。

在PEG 脅迫下，GhFAX10 在脅迫12 h 時(shí)有著顯著高表達(dá)；GhFAX6 在受到脅迫后表達(dá)量基本不變；GhFAX12 在受到PEG 脅迫后表達(dá)量一直處于下降狀態(tài)，推測該基因在陸地棉響應(yīng)PEG 脅迫過程中具有負(fù)向調(diào)控作用。

綜上所述，冷脅迫下，GhFAXs 基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)的家族成員有10 個(gè)，表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)的家族成員有2 個(gè)；高溫脅迫下，GhFAXs 基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)的家族成員有10 個(gè)，表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)的家族成員有2 個(gè)；鹽脅迫下，GhFAXs 基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)的家族成員有9 個(gè)，表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)的家族成員有3 個(gè)；PEG 脅迫下，GhFAXs 基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)的家族成員有11 個(gè)，表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)的家族成員有1 個(gè)。

2.8 GhFAXs基因表達(dá)模式分析

為鑒定GhFAXs 基因在陸地棉中的時(shí)空表達(dá)特性，提取陸地棉的根、莖、葉、花及不同發(fā)育時(shí)期的種子（開花后5、15 和35 d）的RNA，進(jìn)行RT?PCR 和RT?qPCR 檢測。結(jié)果（圖8）顯示，F(xiàn)AX 家族基因在棉花根、莖、葉、花和胚珠等組織中均有表達(dá)，因此，陸地棉FAX 家族基因均為組成型表達(dá)基因，具有廣譜表達(dá)特性。通過對陸地棉不同組織中FAX 基因表達(dá)情況進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，GhFAX4、GhFAX10 在陸地棉花中表達(dá)量高于其他組織，GhFAX7、GhFAX9 在陸地棉莖中表達(dá)量高于其他組織，GhFAX1、GhFAX9、GhFAX12 在陸地棉FAX 家族基因表達(dá)中明顯高于其他基因，推測這些基因可能在陸地棉發(fā)育和油脂轉(zhuǎn)運(yùn)積累過程中發(fā)揮主要作用。

圖8 陸地棉FAX 家族基因表達(dá)模式分析Fig.8 Analysis of gene expression patterns of FAX family

2.9 GhFAX1蛋白亞細(xì)胞定位分析

選擇在各個(gè)組織表達(dá)量較高的GhFAX1 構(gòu)建載 體，將 構(gòu) 建 好 的35S∷GhFAX1∷GFP 載 體 和pCAMBIA1300 空載體（對照）通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法注射侵染本氏煙草葉片，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，在共聚焦顯微鏡下觀察GFP 熒光信號（圖9），空載體的熒光信號分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上，而35S∷GhFAX1∷GFP 的熒光信號只分布在質(zhì)體上，表明GhFAX1 定位于質(zhì)體。

圖9 GhFAX1 蛋白的亞細(xì)胞定位分析Fig.9 Subcellular localization analysis of GhFAX1 protein

2.10 過表達(dá)GhFAX1酵母的總脂肪酸含量與底物偏好性分析

為研究GhFAX 的具體功能，將GhFAX1 連接到酵母表達(dá)載體pYES2.0 上，獲得pYES2.0?GhFAX1，將轉(zhuǎn)化成功的GhFAX1 過表達(dá)酵母進(jìn)行總脂肪酸含量測定（圖10），與野生型酵母相比，轉(zhuǎn)空載pYES2.0 酵母的總脂肪酸含量并無明顯變化，說明pYES2.0 載體并不影響酵母本身的生長與油脂合成。與轉(zhuǎn)空載酵母相比，GhFAX1 過表達(dá)酵母中總脂肪酸比對照提高了3.53%。說明GhFAX1 參與了酵母的脂肪酸代謝并能夠提高釀酒酵母的總脂肪酸含量。為了進(jìn)一步研究GhFAX1 對4 種常見底物（C16:0、C18:0、C18:1、C18:2）的偏好，將這4 種脂肪酸外源性加入酵母培養(yǎng)基中，觀察酵母在96 h 的生長情況（圖11），GhFAX1 轉(zhuǎn)基因酵母在底物為C16:0 與C18:0 時(shí)生長曲線明顯高于野生型酵母INVSc1，表明GhFAX1 對含有C16:0、C18:0 底物具有選擇性。

圖10 轉(zhuǎn)基因酵母總脂肪酸含量Fig.10 Total fatty acid content of transgenic yeast

圖11 轉(zhuǎn)基因酵母在外源添加脂肪酸下生長指標(biāo)Fig.11 Transgenic yeast growth indicators under exogenous added fatty acids added fatty acids

2.11 過表達(dá)GhFAX1煙草光合與總脂肪酸含量分析

葉綠素是質(zhì)體的重要組成部分，為探究Gh?FAX1 對質(zhì)體的影響，分別在5 株GhFAX1 過表達(dá)植株中選取生長情況良好且長勢一致的2 株轉(zhuǎn)基因煙草，使用SPAD502 葉綠素儀測定GhFAX1 過表達(dá)和野生型煙草葉片葉綠素含量（圖12?A），GhFAX1 的表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量提高13.24%和11.8%。為進(jìn)一步探究GhFAX1 對煙草葉綠素具體功能的影響，以野生型煙草作為對照，檢測GhFAX1過表達(dá)煙草葉綠素?zé)晒鈪?shù)（圖12?B），GhFAX1 過表達(dá)煙草較野生型煙草的F0有明顯降低，證明Gh?FAX1 的表達(dá)提高了煙草葉綠素的穩(wěn)定性；過表達(dá)煙草較野生型煙草在Fm、Y（II）、ETR 上有明顯提高，說明GhFAX1 的表達(dá)提高了煙草葉片PSII 的電子傳遞，提高了煙草葉片PSII 光能轉(zhuǎn)換率，提升了PSII的反應(yīng)活性。為了驗(yàn)證GhFAX1 在脂肪酸生物合成和油脂積累過程中的功能，對2 株過表達(dá)煙草取樣，測定總脂含量（圖12?E），以野生的煙草葉片為對照，GhFAX1 過表達(dá)煙草葉片總脂肪酸含量提高了5.2%與4.93%。結(jié)果表明，GhFAX1 可以促進(jìn)脂肪酸的積累。測定了過表達(dá)煙草葉片的可溶性糖、淀粉以及蛋白的含量（圖12?C-D、圖12?F），與野生型煙草葉片相比，過表達(dá)煙草葉片蛋白的含量有顯著下降趨勢。綜上所述，GhFAX1 過表達(dá)使煙草葉片總脂的提高，同時(shí)GhFAX1 可以使蛋白合成途徑上的碳源更多地流向油脂合成途徑。

圖12 轉(zhuǎn)基因煙草葉片葉綠素含量（A）、相關(guān)熒光參數(shù)（B）和轉(zhuǎn)基因煙草蛋白含量（C）、淀粉（D）、葉片總脂肪酸（E）、可溶性糖（F）及轉(zhuǎn)基因煙草種子千粒重（G）與總脂肪酸含量（H）Fig.12 Chlorophyll content（A）, relevant fluorescence parameters（B）, total fatty acid（C）, soluble sugar（D）, starch（E）,protein content（F）, 1 000-grain weight（G）and total fatty acid content（H）in transgenic tobacco leaves

標(biāo)準(zhǔn)栽培條件下，2 株GhFAX1 過表達(dá)煙草分別隨機(jī)選取種子，稱量其千粒重，重復(fù)稱量3 次，結(jié)果（圖12?G）發(fā)現(xiàn)，GhFAX1 過表達(dá)煙草的種子千粒重較野生型煙草顯著增加。轉(zhuǎn)基因種子的千粒重較野生型種子質(zhì)量分別增加了近19.1%與16%。收集轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草植株的種子進(jìn)行油脂提取（圖12?H），與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草種子含油量分別提高了6.18%與6.52%，說明GhFAX1在煙草中能夠顯著提升種子含油量。

3 討論

3.1 GhFAX基因家族在棉花屬中的演化與擴(kuò)張機(jī)制

根據(jù)數(shù)據(jù)庫顯示，棉花屬中的FAX 基因在品種進(jìn)化中有明顯的數(shù)量規(guī)律，表明棉花屬中FAX 基因家族在歷史中經(jīng)歷過一定的擴(kuò)張。根據(jù)已有的研究表明，基因組多倍化事件與片段復(fù)制有助于植物中基因家族的擴(kuò)展。陸地棉中FAX 基因家族成員可能來自基因組多倍化與片段復(fù)制。復(fù)制事件分別發(fā)生在115-146 百萬年和13-20 百萬年前的亞洲棉和雷蒙德氏棉，隨后是通過一萬年前2 個(gè)現(xiàn)存祖親的雜交和多倍體化形成的陸地棉和海島棉。因此，四倍體陸地棉中的FAX 基因數(shù)量可能取決于亞洲棉和雷蒙德氏棉的數(shù)量［15-17］。通過進(jìn)化樹分析，在整個(gè)棉屬中，陸地棉FAX 基因的進(jìn)化與亞洲棉、雷蒙德氏棉緊密相關(guān)，陸地棉FAX 基因家族的染色體分布也表明，該家族中的基因相對均勻的分布在整個(gè)棉花染色體上。因此，片段重復(fù)事件有助于棉花中FAX家族的擴(kuò)增［18-20］。

3.2 FAX基因在植物脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)中的關(guān)鍵作用及其對陸地棉生長發(fā)育的研究

已有研究證明FAX 是參與植物脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的一種跨膜蛋白［21］。在擬南芥fax1 突變體中，擬南芥的生物量和花粉繁殖力顯著降低，脂質(zhì)合成減少，突變植物身材矮小。結(jié)果表明，F(xiàn)AX1 的缺失會影響擬南芥的生長發(fā)育［5］。在本研究中，GhFAX4 在花中表達(dá)較高，這可能與其參與陸地棉雄性發(fā)育等過程有一定的相關(guān)性。GhFAX9 在莖中表達(dá)較高，這可能與其參與陸地棉側(cè)芽生長等過程有一定的相關(guān)性。對于GhFAX1、GhFAX12 在陸地棉胚珠中表現(xiàn)為高表達(dá)，這與棉籽油脂積累合成和積累過程相吻合，推測可能在棉籽發(fā)育和油脂轉(zhuǎn)運(yùn)積累過程中發(fā)揮主要作用，后續(xù)有必要對上述家族基因成員功能進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 陸地棉FAX家族蛋白的理化性質(zhì)及功能

對陸地棉FAX 家族蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，陸地棉FAX 家族同時(shí)含有親水性和疏水性成員，這可能與FAX 蛋白結(jié)合疏水性脂肪酸從而實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)。GhFAX 家族蛋白均富含α-螺旋，這與其膜定位具有一定的相關(guān)性。這一結(jié)果與前人對擬南芥和水稻FAX 家族研究結(jié)果具有一致性［21］。繼續(xù)對GhFAX 進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，GhFAX 蛋白定位在葉綠體中，葉綠體作為植物脂肪酸合成的主要場所，因此，GhFAX 可能參與脂肪酸相關(guān)功能，這與植物油脂合成其他關(guān)鍵酶家族蛋白亞細(xì)胞定位差異結(jié)果相似。順式作用元件是決定植物基因啟動子能否正確調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵［22］。研究發(fā)現(xiàn)，陸地棉GhFAX 基因的啟動子作用元件主要與脅迫應(yīng)答相關(guān)，對GhFAX 在各種脅迫下的表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在受到脅迫后，陸地棉GhFAX 基因大部分進(jìn)行上調(diào)，因此GhFAX 可能參與陸地棉逆境脅迫響應(yīng)或生長發(fā)育調(diào)控過程。

3.4 外源基因GhFAX1在釀酒酵母中的表達(dá)及其對脂質(zhì)合成與底物選擇的影響

釀酒酵母（INVSc1）是一種典型的真核生物，具有分離的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和核膜。目前，已有細(xì)菌［23］、真菌［24］、動物［25］、植物［26］的外源基因利用酵母表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證其基因功能。王麗艷［27］將油莎CePAP2轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組酵母細(xì)胞的DAG 含量和總油脂含量均顯著提升；試驗(yàn)將GhFAX1 轉(zhuǎn)入酵母中，酵母總脂有明顯提高；根據(jù)擬南芥質(zhì)體中?；?ACP 合成速率和硫酯酶的特異性，油酸（C18:1）是質(zhì)體輸出的主要游離脂肪酸，其次是棕櫚酸（C16:0）和極少量的硬脂酸（C18:0）［5］。酵母測定中的GhFAX1 在外源添加脂肪酸C16:0（確定的特異性范圍：16:0＞18:0＞18:1≈18:2）中表現(xiàn)最好，因此，GhFAX1 最有可能參與質(zhì)體中游離棕櫚酸的輸出。

3.5 GhFAX1在煙草中的重組表達(dá)及其生物學(xué)效應(yīng)

以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是獲得轉(zhuǎn)基因植物廣泛應(yīng)用的一種方法［28］。通過亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GhFAX1 定位于質(zhì)體中，對過表達(dá)煙草葉片葉綠素含量以及相關(guān)熒光參數(shù)進(jìn)行檢測，煙草葉綠素含量顯著提升，并且葉綠素?zé)晒鈪?shù)都有顯著提高。繼續(xù)研究GhFAX1 對煙草油脂代謝的影響，檢測過表達(dá)煙草葉片與種子的總脂，相對于野生型煙草顯著提高，證明GhFAX1 能顯著提高煙草含油量。當(dāng)植物體內(nèi)總碳源一定時(shí)，氨基酸和糖與FA 在利用光合產(chǎn)物方面存在競爭關(guān)系［29-31］，所以對轉(zhuǎn)基因煙草的蛋白、淀粉、可溶性糖進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草的淀粉與可溶性糖無明顯變化，但蛋白含量有顯著的降低，表明GhFAX1 可以使蛋白合成途徑上的碳源更多地流向油脂合成途徑。

4 結(jié)論

從陸地棉全基因組中鑒定出12 個(gè)GhFAXs 基因。GhFAXs 基因通過片段復(fù)制進(jìn)行基因家族擴(kuò)張。GhFAXs 基因在陸地棉各個(gè)組織和不同脅迫中存在差異表達(dá)。GhFAX1 定位在質(zhì)體中，且參與酵母的脂肪酸代謝，并對C16:0 有選擇性，推測GhFAX1 參與質(zhì)體中游離棕櫚酸的輸出。GhFAX1 可以提高煙草光合速率與含油量，同時(shí)使蛋白合成途徑上的碳源更多地流向油脂合成途徑。