邊星,夏林波,鄧仕任,孫璐,楊浩

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院,遼寧 大連 116600)

水紅花子為蓼科(Polygonaceae)蓼屬植物紅蓼(PolygounumorientaleL.)的干燥成熟果實,別名水葒子、葒草實,性寒、味咸,具有散血消淤、消積止痛之功能,自1977年以來收載于歷版《中國藥典》中,為臨床常用中藥[1]。目前,已從水紅花子中鑒定出40余種化學成分[2-4],主要集中在黃酮類(如花旗松素、槲皮素、葒草素等)、酰胺類(對香豆酰酪胺、對阿魏酰酪胺等)、鞣質(zhì)類(二甲基鞣花酸、沒食子酸等)、脂肪酸類(亞油酸、壬酸等),但對水紅花子化學成分的系統(tǒng)研究尚顯不足,有必要對水紅花子開展全面的成分分析研究。超高效液相串聯(lián)四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜(UPLC-Q-Orbitrap-MS)技術具有高靈敏度、高通用性及高分辨率的特點,已經(jīng)成為中藥復雜成分分析研究中強有力的工具,已廣泛用于中藥成分定性分析[5]。本研究旨在采用UPLC-Q-Orbitrap-MS技術對水紅花子提取物的化學成分進行全面深入的分析,為闡明水紅花子的藥效物質(zhì)基礎提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器QExactive plus四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Dionex公司);數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Xcalibur 4.1工作站(美國Thermo Fisher Scientific公司);ME 204E十萬分之一天平(梅特勒-托利多公司);KQ-3000E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Direct-Q5型超純水機(美國Millipore公司)。

1.2 試藥水紅花子購買自亳州典世堂藥業(yè)銷售有限公司,由遼寧中醫(yī)藥大學王添敏教授鑒定為蓼科植物紅蓼(PolygonumonrientaleL.)的干燥成熟果實,標本存放于遼寧中醫(yī)藥大學藥學院。阿魏酸、槲皮素、蘆丁、小檗堿等對照品購自四川維克奇生物科技有限公司,純度均大于98.5%。甲醇和乙腈為色譜純;甲酸為質(zhì)譜純(美國Tedia公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 供試品溶液的制備水紅花子藥材干燥后粉碎,精密稱取粉末(過三號篩)1.00 g,加甲醇10 mL,浸泡1 h,再超聲提取(功率 250 W,頻率40 kHz)1 h,放冷,提取液4 000 r·min-1離心10 min,取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

2.2 對照品溶液的制備取阿魏酸、槲皮素、蘆丁、小檗堿對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL各含 5 μg的混合溶液,即得。

2.3 色譜條件色譜柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動相:A相為含0.1%的甲酸水,B相為含0.1%的甲酸乙腈。梯度洗脫條件:0～1 min,1% B;1～20 min,1% B→99% B;20～21 min,99% B。柱溫:40 ℃,流速:0.2 mL·min-1,進樣量:3 μL。

2.4 質(zhì)譜條件HESI離子源;離子源溫度:200 ℃;正、負離子掃描模式;電離源電壓4 KV;毛細管溫度320 ℃;透鏡電壓110 V;鞘氣和輔助氣為高純氮氣(純度>99.99%),鞘氣流速40 arb,輔助氣流速10 arb;MS1為全掃描模式,掃描范圍:50～1 250 m/z,分辨率:60 000;MS2采用數(shù)據(jù)依賴性掃描(DDA),選擇MS1中最強10個離子進行掃描;裂解方式:CID;裂解能量:35 eV。

3 結果

在“2.3”和“2.4”項下的檢測條件下,得到水紅花子甲醇提取物正、負離子模式下的基峰圖(見圖1)。通過Xcalibur 4.1軟件查看質(zhì)譜數(shù)據(jù),結合相關文獻、質(zhì)譜庫數(shù)據(jù)和標準品的對比分析,共從水紅花子中鑒定出54個化學成分,詳細信息見表1。結果表明,水紅花子成分復雜,種類較多,鑒定出的成分包括21個黃酮(黃酮醇)及其糖苷、6個酚酸、5個氨基酸、4個生物堿、4個脂肪酸及其酯、3個二氫黃酮、3個核苷、3個鞣質(zhì)和5個其他類成分。

表1 水紅花子的UPLC-Q-Orbitrap-MS鑒定結果

A.為正離子模式;B.為負離子模式

其中,小檗堿、四氫帕馬丁、甜橙黃酮、5-O-去甲川陳皮素、3-O-對香豆?；鼘幩帷⒑邴湶輧?nèi)酯、酪氨酸、L-焦谷氨酸、異亮氨酸、犬尿酸、腺苷、鳥苷、壬二酸、壬二酸單甘油酯、2-亞麻?；?rac-甘油等15種化合物為首次從水紅花子中鑒定得到。

3.1 黃酮苷類同分異構體的鑒定水紅花子中富含黃酮碳苷和黃酮氧苷等兩類黃酮單糖苷,其中有多組同分異構體。借助于Orbitrap高分辨的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù),可以根據(jù)離子裂解特征對上述同分異構體進行區(qū)分。負離子模式下,黃酮碳苷主要通過糖基的環(huán)裂解產(chǎn)生一系列穩(wěn)定的特征二級離子碎片,如[M-H-120 Da]-和[M-H-90 Da]-等,而黃酮氧苷則易通過糖基的整體丟失形成相應的苷元基峰碎片,如[M-H-146 Da]-等[8-10]。以化合物14、16、26為例介紹其鑒定過程。一級質(zhì)譜中,3個化合物[M+H]+均為449.105,[M-H]-均為447.092,推斷分子式均為C21H20O11,為同分異構體。負離子模式下,化合物14的二級質(zhì)譜[如圖2(A)]所示,其中豐度最強的碎片離子為m/z 357.061 7([M-H-90 Da]-),碎片特點符合碳苷己糖六元環(huán)0,3鍵開環(huán)裂解,為丟失C3H6O3后所產(chǎn)生的穩(wěn)定的[0,3X0-H]-離子,此外還可見碎片離子m/z 327.051 2([M-H-120 Da]-),429.083 0([M-H-18 Da]-),285.040 7([M-H-162 Da]-),分別對應為[0,2X0-H]-、[M-H-H2O]-和[M-H-Glc]-離子。上述二級質(zhì)譜信息與黃酮己糖碳苷的裂解規(guī)律相符,結合文獻報道推斷化合物14為“異葒草素”?；衔?6的二級質(zhì)譜[如圖2(B)所示]與化合物14的完全不同:該化合物主要產(chǎn)生m/z 301.035 1([M-Glc]-)和300.0285([M-H-Glc]-·)兩種碎片離子,符合黃酮己糖氧苷的Y裂解(即脫去糖基而保留羥基)方式[11-12],結合文獻報道推斷化合物26為“槲皮苷”?；衔?4和26的質(zhì)譜裂解途徑如圖2所示。值得一提的是,化合物16的二級質(zhì)譜與化合物14的十分類似,二者間的區(qū)別僅為化合物16中m/z 429.083 0([M-H-H2O]-)碎片的相對豐度較低(約為化合物14的1/5),由此推斷化合物16中的己糖存在于C-8位[10,13],化合物16鑒定為“葒草素”。

A.為異葒草素;B.為槲皮苷

3.2 多甲氧基黃酮的鑒定從水紅花子提取物中共鑒定出9種多甲氧基黃酮,該類化合物為水紅花子的特征藥效成分。多甲氧基黃酮易在正離子模式下檢測,在二級質(zhì)譜中常丟失一個到多個CH3·,產(chǎn)生一系列[M+H-15n]+的強峰,同時還伴隨著C=O和H2O的中性丟失?，F(xiàn)以化合物49為例介紹鑒定過程。一級質(zhì)譜中,該化合物的[M+H]+為463.156 8,推斷分子式為C23H26O10。二級質(zhì)譜中,可以觀察到碎片離子m/z 448.136 6([M+H-15]+)、433.113 3([M+H-15-15]+)、430.127 4([M+H-15-18]+)、402.131 8([M+H-15-18-28]+)、415.103 5([M+H-15-15-18]+),為母離子經(jīng)一系列脫甲基、脫水、脫羰基之后產(chǎn)生的碎片峰,符合多甲氧基黃酮的質(zhì)譜裂解規(guī)律[14]。經(jīng)與文獻數(shù)據(jù)比對確定化合物49為“exoticin”,一種八甲氧基黃酮,其二級質(zhì)譜圖及可能的裂解過程見圖3。

圖3 Exoticin的二級質(zhì)譜和質(zhì)譜裂解途徑

3.3 小檗堿的鑒定本文從水紅花子中首次鑒定出小檗堿、四氫帕馬丁、甜橙黃酮、5-O-去甲川陳皮素等15種化學成分,均是通過與MassBank、mzCloud等質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫或?qū)φ掌废啾葘Χ刚J的,下面以化合物35為例進行介紹。一級質(zhì)譜中,該化合物的[M]+為366.121 6,推斷分子式為C20H18NO4+。二級質(zhì)譜中,可以觀察到碎片離子m/z 321.099 5([M-15]+ ·)、306.076 5([M-15-15]+),為母離子分別丟失一個和兩個甲基所產(chǎn)生的碎片離子,同時還可以觀察到m/z 320.092 3([M-15-1]+·)、292.097 1([M-15-1-28]+),為[M-CH3]+·經(jīng)一系列脫氫、脫羰基所形成[15]。經(jīng)與MZCloud數(shù)據(jù)庫和對照品比對確定化合物35為小檗堿,其二級質(zhì)譜圖及可能的裂解過程見圖4。

A.為樣品;B.為對照品

4 討論

本文利用UPLC-Q-Orbitrap-MS技術對水紅花子提取物中的化學成分進行鑒定,共鑒定出包括黃酮類、酚酸類、生物堿類等54種化學成分,其中小檗堿、四氫帕馬丁、甜橙黃酮、5-O-去甲川陳皮素、3-O-對香豆?；鼘幩帷⒑邴湶輧?nèi)酯、酪氨酸、L-焦谷氨酸、異亮氨酸、犬尿酸、腺苷、鳥苷、壬二酸、壬二酸單甘油酯、2-亞麻?；?rac-甘油等15種成分為首次從水紅花子中鑒定得到,也是首次從藥用植物紅蓼中鑒定得到。本文以異葒草素、葒草素、槲皮苷的鑒定過程為例,闡述了同分異構體的質(zhì)譜解析過程;以小檗堿為例描述了新發(fā)現(xiàn)化合物的鑒定方法;還首次報道了水紅花子中的特征性成分-exoticin(1種八甲氧基黃酮)的質(zhì)譜裂解規(guī)律。上述結果表明,Orbitrap技術具有超高質(zhì)譜分辨率和超高質(zhì)量精度的優(yōu)勢,可以快速可靠地識別和鑒定多種化合物,適用于中藥等復雜體系中的化學成分分析研究。本研究可為水紅花子的藥效物質(zhì)基礎研究提供依據(jù)。