熊政翰,尹力,胡慶華

(中國藥科大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 211198)

表觀遺傳(epigenetics)指DNA堿基序列不變而基因表達出現(xiàn)差異,其主要原因是DNA、RNA、組蛋白等遺傳物質(zhì)發(fā)生不同修飾,例如DNA甲基化、組蛋白甲基化和組蛋白乙?；?。其中組蛋白賴氨酸乙酰化是調(diào)節(jié)遺傳信息表達的重要修飾,可促進轉(zhuǎn)錄因子與基因的結(jié)合,從而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[1]。

溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain,BD)是一類高度保守的蛋白結(jié)構(gòu)域,長度約為110個氨基酸殘基,可以特異性識別組蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子上發(fā)生乙?；馁嚢彼釟埢?。目前在人類細胞中已鑒定出46種含有溴結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),按結(jié)構(gòu)的近似程度可分為8個家族[2]。其中第Ⅱ家族,溴結(jié)構(gòu)域與超末端結(jié)構(gòu)域(bromodomain and extra-terminal domain,BET)蛋白受到了最多的關(guān)注。BET蛋白家族包括4種蛋白亞型:溴結(jié)構(gòu)域蛋2(BRD2)、BRD3、BRD4和BRDT,目前人們對BRD4進行了較為深入的挖掘,發(fā)現(xiàn)BRD4在基因轉(zhuǎn)錄、細胞周期等生命活動中扮演著重要的調(diào)控角色。

1 BRD4的生物學(xué)功能

BRD4在結(jié)構(gòu)上包含2個串聯(lián)的溴結(jié)構(gòu)域(BD1以及 BD2)、超末端結(jié)構(gòu)域(ET)和羧基末端結(jié)構(gòu)域(CTD)[3],按照羧基末端氨基酸殘基的長度可分為3種亞型:長亞型BRD4-L和短亞型BRD4-S(a)、BRD4-S(b)[4]。BRD4在功能上能特異性識別組蛋白或者轉(zhuǎn)錄因子上的乙酰化賴氨酸殘基,通過影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)或與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生作用,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。CTD和BD2結(jié)構(gòu)域可結(jié)合并招募正向轉(zhuǎn)錄延伸因子(P-TEFb)。當(dāng)P-TEFb被BRD4招募至靶基因啟動子或增強子位點后,RNA聚合酶Ⅱ發(fā)生磷酸化,從而促進下游基因的轉(zhuǎn)錄[5-6];ET結(jié)構(gòu)域可結(jié)合組蛋白精氨酸去甲基酶6、染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白4、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶[7-8],通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)的狀態(tài)從而改變基因的轉(zhuǎn)錄活性;BD1和BD2結(jié)構(gòu)域可結(jié)合NF-κB RelA亞基310位乙酰化賴氨酸,進一步增強 NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活作用,共同促進下游炎癥基因表達[9]。

BRD4在人體組織中分布廣泛。在神經(jīng)組織中,少突膠質(zhì)細胞以及神經(jīng)元內(nèi)BRD4蛋白與神經(jīng)炎癥存在關(guān)聯(lián)[10];在肝臟中BRD4表達水平異常升高,參與肝臟炎癥和纖維化的進程[11];在心臟中BRD4高表達,在炎癥引發(fā)的心臟損傷中發(fā)揮重要調(diào)控作用[12]。此外,在不同腫瘤組織中,BRD4表達存在異常,研究證明BRD4與肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、白血病等癌癥密切相關(guān),被認(rèn)為是癌癥治療潛在的靶點[13-18]。由此可見,廣泛分布的BRD4與機體各項生命活動息息相關(guān),抑制BRD4有望成為治療各種疾病的重要策略。

2 BRD4抑制劑的研發(fā)現(xiàn)狀

BET蛋白最初于癌癥領(lǐng)域被發(fā)現(xiàn),因此各種具有抗癌活性的BET小分子抑制劑率先涌現(xiàn)出來。Filippakopoulos等[19]于2010年報道的BET抑制劑JQ1,能競爭性抑制BRD4與染色質(zhì)的結(jié)合,對睪丸核蛋白中線癌具有潛在治療作用。隨后出現(xiàn)了更多的BET抑制劑,其中一部分如AZD5153、CPI-0610、MK-8628已進入臨床試驗階段,但適應(yīng)證主要集中于抗癌抗腫瘤領(lǐng)域。隨著對BRD4抑制劑的研究深入,研究者逐漸將目光從腫瘤領(lǐng)域匯聚到非腫瘤領(lǐng)域,探究BRD4抑制劑在抗炎和免疫領(lǐng)域是否能發(fā)揮新的作用。Resverlogix公司開發(fā)的RVX-208是一類口服BET抑制劑,通過調(diào)節(jié)載脂蛋白A-Ⅰ、高密度脂蛋白代謝影響體內(nèi)膽固醇運輸,主要用于急性冠狀動脈綜合證、動脈粥樣硬化的治療,目前已完成臨床Ⅲ期試驗[20]。而多數(shù)BRD4抑制劑在炎癥疾病領(lǐng)域尚處于臨床前研究階段。JQ1作為最常用的工具藥,在炎癥疾病中初步展現(xiàn)出較好的潛在效果,這提示著BRD4抑制劑在炎癥疾病治療中具有獨特的、廣闊的應(yīng)用前景。

3 BRD4抑制劑在炎癥疾病中的作用

3.1 BRD4及其抑制劑與腎纖維化腎纖維化(renal fibrosis)指腎實質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)不可逆的瘢痕沉積,是各種慢性進行性腎臟炎癥疾病的共同發(fā)展方向[21]。腎臟內(nèi)的瘢痕沉積致使器官結(jié)構(gòu)受損、血液供應(yīng)不足,最終導(dǎo)致腎功能喪失,造成腎衰竭以及尿毒癥。而BRD4在人類纖維化腎組織中高表達,通過響應(yīng)由于氧化應(yīng)激、代謝紊亂、炎癥因子和體內(nèi)毒素等多因素造成的表觀遺傳修飾促進腎纖維化[22]。研究表明,抑制BRD4可以有效緩解腎纖維化。Wang等[23]發(fā)現(xiàn),JQ1降低小鼠腎臟中α平滑肌肌動蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白的表達,抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而緩解血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠腎纖維化。此外JQ1還能降低腎組織中Smad3和ERK1/2磷酸化水平,抑制下游Nox4轉(zhuǎn)錄進而降低Nox4介導(dǎo)的ROS生成和腎纖維化[24]。

除了經(jīng)典的JQ1,一些結(jié)構(gòu)優(yōu)化的BRD4小分子抑制劑也表現(xiàn)出較好的藥效。Xiong等[25]發(fā)現(xiàn),I-BET151下調(diào)腎臟BRD4、c-Myc和P53的表達,降低表皮生長因子受體和血小板生長因子受體磷酸化水平,通過Smad-3、STAT3和NF-κB信號通路抑制腎成纖維細胞活化、減少巨噬細胞浸潤,減少G2/M期腎上皮細胞比例,最終改善單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的小鼠腎纖維化。Tao等[26]報道了一種新型BRD4抑制性先導(dǎo)化合物ZLD2218,通過減少BRD4表達、抑制Smad-3信號通路減少細胞外基質(zhì)蛋白的沉積,有效改善小鼠腎臟纖維化。

3.2 BRD4及其抑制劑與哮喘哮喘(asthma)是一種慢性氣道炎癥,臨床癥狀主要有胸悶、咳嗽和呼吸困難。其病因較為復(fù)雜,目前主流觀點認(rèn)為免疫系統(tǒng)紊亂和氣道高反應(yīng)性與哮喘發(fā)病關(guān)系緊密。氣道高反應(yīng)性指呼吸道對非抗原性刺激敏感性增加,支氣管平滑肌出現(xiàn)過度的收縮反應(yīng),從而引起氣道狙窄與氣道阻力增加。研究表明BRD4參與了PM2.5誘發(fā)的小鼠氣道高反應(yīng)性反應(yīng)[27]。Tian等[28]報道,兩種新型BRD4抑制劑ZL0420和ZL0454能緩解TLR3激動劑誘發(fā)的氣道高反應(yīng)性、抑制肺纖維化和慢性氣道重塑。其機制是通過介導(dǎo)TGF-β信號減少氣道上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,抑制肌成纖維細胞群的擴增與分化,降低分泌到胞外基質(zhì)的膠原蛋白COL1A、纖連蛋白FN1的水平。

BRD4參與的免疫功能紊亂是哮喘的另一個重要病因,氣道組織中的BRD4可以響應(yīng)TLR信號,激活NF-κB/RelA等通路,通過激活先天炎癥反應(yīng)、募集中性粒細胞、促進間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和肌成纖維細胞擴張從而引發(fā)哮喘[29-30]。Kerscher等[31]發(fā)現(xiàn)I-BET151可以降低T-細胞可誘導(dǎo)共刺激分子(ICOS)、細胞間黏附分子1(ICAM1)以及CD40 配體(CD40L/CD154)的水平,有效抑制人2型固有淋巴細胞ILC2細胞激活和2型免疫反應(yīng),從而有效降低肺部炎癥和氣道阻力。Perry等[32]發(fā)現(xiàn)JQ1和I-BET762可以抑制氣道平滑肌細胞增殖,降低IL-6和CXCL8水平改善哮喘。Kaneshita等[33]報道了一種以喹啉酮結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的BET 抑制劑CG223,通過轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)途徑,以劑量依賴的方式降低促纖維化基因Thbs1、Itgb3的轉(zhuǎn)錄激活,從而有效減少了肺部炎性細胞浸潤。

3.3 BRD4及其抑制劑與腸道炎癥炎癥性腸病(IBD)是腸道的慢性復(fù)發(fā)性炎癥,在臨床上主要分為兩種亞型,即潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。其病因較為復(fù)雜,腸道免疫系統(tǒng)紊亂是重要發(fā)病原因之一。腸道黏膜中免疫細胞過度活化會產(chǎn)生高水平的炎性細胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-17),可進一步加劇腸道炎癥和組織損傷[34-35]。而BRD4參與調(diào)節(jié)1、2以及17型炎癥細胞反應(yīng),且在人類IBD患者中檢測到BRD4 激活標(biāo)記物 H3K122Ac豐度顯著上調(diào),提示BRD4在IBD中發(fā)揮重要的作用[36-37]。Cheung等[38]報道一種BRD4-BD1結(jié)構(gòu)域選擇性抑制劑MS402能夠特異性抑制結(jié)腸組織Th17細胞的分化,通過減少BRD4募集p-TEFb,阻礙RNA聚合酶Ⅱ?qū)h17細胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,下調(diào)IL-17、IL-21、IL-22、Rorc、T-bet水平,阻斷Th17細胞過度發(fā)育從而預(yù)防和改善小鼠T細胞轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。

3.4 BRD4及其抑制劑與皮膚炎癥銀屑病(psoriasis)是一種慢性皮膚炎癥,其病理學(xué)表現(xiàn)為表皮基底層角化過度、真皮層毛細血管增生、炎性細胞浸潤,臨床表現(xiàn)為斑塊、鱗屑等[39]。輔助性T細胞17(Th17)是一類重要的CD4+T淋巴細胞亞群,大量報道顯示Th17在IBD病程中扮演關(guān)鍵角色。有研究者對銀屑病患者血清細胞因子進行檢測,其中 Th17細胞相關(guān)細胞因子(IL-17、IL-22)水平均顯著高于健康受試者,而調(diào)控 IL-17對銀屑病有很好的保護作用[40]。由此可見,抑制Th17細胞的增殖及分化,是治療銀屑病的重要方向。2015年Nadeem等[41]研究了JQ1在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型中的作用,發(fā)現(xiàn)JQ1有效抑制了Th17細胞分化所必須的轉(zhuǎn)錄因子視黃酸受體相關(guān)的孤兒受體C(RORC)的表達,通過調(diào)節(jié)RORC/IL-17A/IL-22途徑有效減輕IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病皮膚炎癥?；谏鲜鲅芯?Sato等[42]從一種ERK5-BRD4雙重抑制劑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)出發(fā),設(shè)計出一種新型高抑制活性的BRD4抑制劑,在IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型中展現(xiàn)出較好的療效。

3.5 BRD4及其抑制劑與其他炎癥性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)屬于自身免疫性關(guān)節(jié)炎癥,其發(fā)病與關(guān)節(jié)滑膜組織中成纖維樣滑膜細胞(FLS)相關(guān)。Xiao等[43]發(fā)現(xiàn)JQ1可以抑制FLS增殖,下調(diào)炎性細胞因子產(chǎn)生和基質(zhì)金屬蛋白酶表達,通過抑制IκB激酶介導(dǎo)的NF-κB信號通路改善RA。Krishna等[44]進一步表明,RA患者來源FLS細胞內(nèi)BRD2、BRD4水平顯著上升,JQ1能顯著抑制RA-FLS細胞炎性基因的轉(zhuǎn)錄激活,且發(fā)現(xiàn)BRD2和BRD4在基因轉(zhuǎn)錄過程中占據(jù)染色質(zhì)不同區(qū)域并執(zhí)行互不重疊的功能,這提示著JQ1通過靶向多條信號通路緩解RA。還有報道顯示,BET抑制劑I-BET151降低RA-FLS細胞IL-6、IL-8表達,調(diào)節(jié)FLS細胞的增殖與炎癥反應(yīng)[45-46]。痛風(fēng)(gout)是一種炎癥性關(guān)節(jié)炎,主要病理現(xiàn)象是關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)生單鈉尿酸鹽晶體沉積。一種針對BRD4 BD1結(jié)構(gòu)域的選擇性抑制劑LT052能有效減緩?fù)达L(fēng)大鼠模型滑膜組織中BRD4上調(diào)、NF-κB p65磷酸化水平增加,抑制NLRP3炎癥小體激活和IL-1β釋放,通過介導(dǎo)BRD4/NF-κB/NLRP3通路抑制巨噬細胞焦亡[47]。骨關(guān)節(jié)炎(OA)是關(guān)節(jié)發(fā)生的一種退行性病變,越來越多的證據(jù)表明OA病程中包括炎癥部分。Jiang等[48]檢測到BRD4在OA小鼠關(guān)節(jié)軟骨中表達上調(diào),ChIP分析表明高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是BRD4的一個直接作用靶點,JQ1通過降低BRD4介導(dǎo)的HMGB1轉(zhuǎn)錄激活,抑制NF-κB信號通路,進而緩解OA小鼠軟骨細胞炎癥與損傷。

除了關(guān)節(jié)軟骨,BRD4在牙骨的炎癥反應(yīng)中同樣發(fā)揮作用。牙周炎(periodontitis)是一種由細菌引發(fā)的炎癥性口腔疾病,隨著疾病的發(fā)展牙周支持組織受損,進而造成牙齒松動與脫落。Meng等[49]發(fā)現(xiàn)JQ1對實驗性牙周炎小鼠模型具有緩解作用。其機制是JQ1降低牙周炎病變組織中Toll樣受體和炎癥因子的表達,并能下調(diào)由RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞標(biāo)志物水平。BRD4抑制劑還能通過作用于非骨質(zhì)細胞對牙周炎起到保護作用,Maksylewicz等[50]研究了與牙周炎發(fā)病相關(guān)的牙齦上皮細胞和成纖維細胞,發(fā)現(xiàn)BRD4抑制劑I-BET151和JQ1均顯著降低上述兩種細胞由于牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的趨化因子、促炎細胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶水平,進一步擴充BET抑制劑治療口腔炎癥的作用機理。

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一種慢性肝病,其特征是肝臟組織中脂肪異常積聚,同時伴隨有炎癥和肝細胞損傷[51]。Middleton等[52]發(fā)現(xiàn)I-BET151通過調(diào)節(jié)干擾素信號改善小鼠NASH病癥;Fu等[53]開發(fā)出一種BRD4小分子抑制化合物Compound 38,通過JAK-STAT以及MAPK信號通路抑制肝巨噬細胞激活,同時還影響TGF-β/SMAD通路和Wnt/β-Catenin通路減輕肝臟炎癥和纖維化。急性肝損傷(ALI)是由藥物、外來病菌、體內(nèi)代謝等多因素引發(fā)的肝功能障礙和炎癥反應(yīng),Chen等[54]報道了一種具有四環(huán)結(jié)構(gòu)骨架的BRD4抑制化合物Compound 28,在肝損傷模型中降低了TNF-α、IL- 1β和IL-6的水平,已初步展現(xiàn)出較好的抗炎活性和對肝損傷的保護作用。

動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性血管炎癥,病理特征為動脈壁中脂質(zhì)沉積物和膽固醇積累形成斑塊,造成血管狹窄甚至閉塞。AS的病程中血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮了重要作用:在高膽固醇、高血壓、吸煙等誘因下,血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)損傷從而導(dǎo)致功能異常,產(chǎn)生一氧化氮減少、表達黏附分子、趨化因子增多,吸引白細胞在血管內(nèi)壁附著,進一步加劇炎癥和脂質(zhì)積累。Brown等[55]發(fā)現(xiàn)JQI抑制了BRD4介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞內(nèi)NF-κB的核易位,降低黏附分子E-選擇素、血管細胞黏附分子以及趨化因子CCL2的轉(zhuǎn)錄,有效減少血管內(nèi)斑塊生成。另一種BRD4抑制劑RVX-208對小鼠血管炎癥和動脈粥樣硬化具有較好保護作用,目前已進入臨床試驗階段[56-57]。

膿毒血癥是一種由細菌感染引起的嚴(yán)重疾病,特征是體內(nèi)存在大量細菌毒素累積,進而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)。細胞因子風(fēng)暴是膿毒血癥的發(fā)病機制之一[58], Belkina等[59]發(fā)現(xiàn)JQ1降低膿毒血癥小鼠體內(nèi)IL-6和TNF-α的水平從而緩解炎癥反應(yīng);RVX-297是一種口服BET抑制劑,能選擇性抑制BD2結(jié)構(gòu)域。Jahagirdar等[60]發(fā)現(xiàn)RVX-297顯著降低膿毒血癥小鼠體內(nèi)炎性因子IL-6、IL-17、IFN-γ以及促炎蛋白MCP-1、MCP-5的水平。此外膿毒血癥還導(dǎo)致機體出現(xiàn)其他嚴(yán)重并發(fā)癥,如膿毒癥相關(guān)腦病。Zhong等[61]發(fā)現(xiàn)JQ1能通過NF-κB通路抑制膿毒性腦病小鼠海馬神經(jīng)元細胞的焦亡,從而有利于保護血腦屏障、減輕神經(jīng)炎癥。

4 總結(jié)與展望

BRD4及其抑制劑在炎癥性疾病中的研究進展表明,BRD4是一種重要的表觀遺傳調(diào)控因子,可以通過影響多種炎癥相關(guān)基因的表達,參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。BRD4抑制劑可以有效地抑制BRD4介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄,從而抑制炎癥反應(yīng),改善組織損傷和功能障礙。然而,BRD4抑制劑也存在一些局限和挑戰(zhàn),如BRD4抑制劑的非特異性、不良反應(yīng)、耐藥性等。因此,需要開發(fā)更具特異性、安全性和穩(wěn)定性的BRD4抑制劑,以提高其治療效果和減少其副作用。此外,還需要探索BRD4抑制劑與其他藥物的聯(lián)合治療效果,以增強其抗炎作用或克服其耐藥性。最后,還可以利用新型技術(shù)(如PROTACs)降解BRD4蛋白,從而實現(xiàn)更強的和更持久的BRD4抑制效果?？傊?BRD4及其抑制劑在炎癥性疾病中具有廣闊的應(yīng)用前景,值得進一步的研究和開發(fā)。