中藥山藥及其偽品主要化學(xué)成分比較分析

金一寶,佟月,陳佳佳,王麓,殷果

(1.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳市藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 518057;2.沈陽(yáng)藥科大學(xué),遼寧 沈陽(yáng) 110016;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510006)

山藥(Chinese yam)為薯蕷科植物薯蕷(DioscoreaoppositaThunb.)的干燥根莖[1]。山藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,將其列為上品,云“署豫,味甘,溫。主傷中,補(bǔ)虛嬴,除寒熱邪氣,補(bǔ)中,益氣力,長(zhǎng)肌肉?！盵2]在宋代以前山藥多采用野生品,產(chǎn)地較分散,山西、河南、山東、江蘇、湖北等地均有分布,其中評(píng)價(jià)出“產(chǎn)佳”或“產(chǎn)良”的產(chǎn)地,各種本草說(shuō)法不一[3]。直至明清的《救荒本草》中首次指出山藥“懷孟間產(chǎn)者入藥最佳”,且入藥以栽培品為主[4]。山藥有很高藥用價(jià)值,包括淀粉、黏液多糖、蛋白質(zhì)和氨基酸、微量元素、甾體皂苷、多酚等多種活性成分。其中山藥多糖具有調(diào)節(jié)脾胃功能、抗衰老、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]。

近年來(lái),山藥的市場(chǎng)需求不斷增長(zhǎng),市場(chǎng)上亦混入了山藥偽品,使藥用市場(chǎng)流通的山藥質(zhì)量魚(yú)龍混雜。薯蕷科中薯蕷屬大約包含600種,種類(lèi)豐富。歷版《中國(guó)藥典》均記載中藥山藥的基原植物為薯蕷。但實(shí)際上除薯蕷外,市場(chǎng)上存在多種不同基原的山藥,如:淮山藥(參薯,DioscoreaalataL.)、廣山藥(褐苞薯蕷,DioscoreapersimilisPrain et Burkill.)、野山藥(日本薯蕷,DioscoreajaponicaThunb.)等,上述3種作為山藥地方習(xí)用品,分別被浙江、廣西、湖南、廣東等地收錄在地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)中。此外,中藥山藥的常見(jiàn)偽品木薯(ManihotesculentaCrantz.)、番薯(IpomoeabatatasLam.)等也在市場(chǎng)上廣泛流通[7-8],導(dǎo)致了山藥市場(chǎng)混亂?！吨袊?guó)藥典》2020年版(一部)、《美國(guó)草藥集》、《英國(guó)藥典》2023 Ⅳ、《歐洲藥典》11.0、《日本藥局方》ⅩⅧ針對(duì)其鑒別分別采用顯微鑒別和薄層鑒別法[1,9-12]。

本研究采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定不同來(lái)源的山藥及其偽品的總多糖、總皂苷、總黃酮和總酚等化學(xué)成分的含量并進(jìn)行主成分分析,以此來(lái)鑒定和篩選優(yōu)良的山藥資源,為山藥種植資源開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品收集43批樣品,其中包括28批中藥山藥(DioscoreaoppositaThunb.)和15批偽品。其中偽品包括同屬的參薯(DioscoreaalataL.)、褐苞薯蕷(DioscoreapersimilisPrain et Burkill.)和日本薯蕷(DioscoreajaponicaThunb.),及不同屬的木薯(ManihotesculentaCrantz)和番薯[Ipomoeabatatas(L.) Lamarck.]。所有樣品均經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院原中藥標(biāo)本館館長(zhǎng)張繼主任藥師鑒定。樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。其中原藥材參考《中國(guó)藥典》2020年版(一部)[1],原藥材去皮切片后置于60 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干,粉碎,過(guò)五號(hào)篩,置于密封袋中,25 ℃條件下密封保存,備用。

表1 43批中藥山藥及偽品樣品信息表

1.2 儀器與試劑UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);TC-15套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠);SB26-12DT型超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);DL-5-B低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);TW20水浴鍋(優(yōu)萊博技術(shù)北京有限公司);Milli-Q Academic純水器(美國(guó)密理博公司);MS-204S分析天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))。

無(wú)水葡萄糖(批號(hào):110833-201908,中國(guó)食品藥品檢定研究院);薯蕷皂苷元(批號(hào):111539-200001,中國(guó)食品藥品檢定研究院);蘆丁(批號(hào):20121022,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);沒(méi)食子酸(批號(hào):K1216026,美國(guó)Sigma-Aldich公司) 。硫酸、鹽酸、高氯酸、乙醇、石油醚(沸程60～90 ℃)、正丁醇、冰醋酸(分析純,廣州化學(xué)試劑廠);硝酸鋁、亞硝酸鈉、福林酚、碳酸鈉、氫氧化鈉、苯酚、甲醇、香草醛(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 山藥多糖含量的測(cè)定

2.1.1 葡萄糖對(duì)照品溶液的制備取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,加水制成0.1 mg·mL-1的葡萄糖對(duì)照品溶液。精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置具塞試管中,加水補(bǔ)至2.0 mL,按測(cè)定方法操作用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.1.2 供試品溶液的制備取中藥山藥樣品粉末約0.1 g,精密稱(chēng)定,置圓底燒瓶中,加80%乙醇100 mL,加熱回流1 h,趁熱過(guò)濾,濾渣與濾器用熱80%乙醇溶液30 mL,分次洗滌,濾渣連同濾紙置燒瓶中,加水150 mL,加熱回流2 h,趁熱過(guò)濾,用少量熱水洗滌濾器,合并濾液與洗液,放冷,移至250 mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,備用。

2.1.3 測(cè)定方法精密量取一定量供試品溶液,因樣品存在較大差異,選擇0.5 mL或0.2 mL,使其測(cè)得吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi),置具塞試管中,加水補(bǔ)至2.0 mL,精密加入5%苯酚溶液1.0 mL,搖勻,迅速加入硫酸5.0 mL,搖勻,置40 ℃水浴中保溫30 min,取出,置冰水浴中5 min,以水為空白溶液同法操作為空白樣品,照紫外-可見(jiàn)分光光度法,在488 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,計(jì)算總多糖的含量[12]。

2.2 山藥總皂苷含量的測(cè)定

2.2.1 薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,置于50 mL量瓶中,甲醇溶解并稀釋定容,搖勻,配制成濃度0.2 mg·mL-1的薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液。精密量取薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL具塞試管中按測(cè)定方法操作用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.2.2 供試品溶液的制備精密稱(chēng)取樣品粉末2.0 g置于具塞錐形瓶,加入70%乙醇20 mL,超聲提取60 min,提取2次,上層清液合并后過(guò)濾蒸干,殘?jiān)? mL蒸餾水溶解,轉(zhuǎn)移至60 mL分液漏斗,加入石油醚萃取2次,每次10 mL,收集水層,合并水溶液加入水飽和正丁醇萃取3次,每次5 mL,收集正丁醇層于干燥蒸發(fā)皿中,揮干溶劑,殘?jiān)尤爰状既芙?轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶,搖勻,以甲醇定容。

2.2.3 測(cè)定方法精密量取供試品溶液1.0 mL,置10 mL具塞試管中,加塞,于90 ℃水浴揮干溶劑,精密加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,加塞,于60 ℃恒溫水浴中反應(yīng)顯色15 min后置冷水浴至室溫,精密加入冰醋酸5.0 mL,搖勻,靜置15 min。以甲醇為空白溶液同法操作為空白樣品,波長(zhǎng)465 nm下測(cè)定吸光度,計(jì)算總皂苷的含量。

2.3 山藥總黃酮含量的測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品10.0 mg,70%乙醇超聲溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶定容備用。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置于10 mL量瓶中按測(cè)定方法操作用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.3.2 供試品溶液的制備精密稱(chēng)取山藥粉末2.0 g,置于具塞錐形瓶中,加入70%乙醇溶液20 mL,超聲提取30 min,5 000 r·min-1離心取上清,蒸干,用70%乙醇復(fù)溶并定容至2.0 mL量瓶中。

2.3.3 測(cè)定方法精密量取一定量供試品溶液(0.5 mL或0.2 mL),分別置10 mL量瓶中,依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,最后加入4%氫氧化鈉試液2 mL,50%乙醇定容,靜置15 min。以70%乙醇為空白溶液同法操作為空白樣品,波長(zhǎng)502 nm下測(cè)定吸光度,計(jì)算總黃酮的含量[13]。

2.4 山藥總酚含量的測(cè)定

2.4.1 沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)定沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,置于100 mL量瓶中加50%乙醇定容。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL,分別置10 mL量瓶中按測(cè)定方法操作用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.4.2 供試品溶液的制備精密稱(chēng)取山藥粉末0.5 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入20 mL 50%乙醇,超聲30 min,放冷,離心,精密量取1 mL上清液置10 mL量瓶中。

2.4.3 測(cè)定方法精密吸取一定量待測(cè)樣品提取液、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別置10 mL量瓶中,依次加水3 mL,搖勻,再加入福林酚試液B 0.5 mL,搖勻,0.5～8 min內(nèi)加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL,加水至刻度,搖勻,在75 ℃水浴中放置10 min。以50%乙醇為空白溶液同法操作為空白樣品,波長(zhǎng)760 nm下測(cè)定吸光度,計(jì)算總多酚的含量[13]。

2.5 方法學(xué)考察以各不同濃度的對(duì)照品溶液按測(cè)定方法,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。分別取葡萄糖對(duì)照品溶液、薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液、蘆丁對(duì)照品溶液和沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液1 mL各6份,按各自測(cè)定方法進(jìn)行精密度驗(yàn)證,計(jì)算其RSD。取S1號(hào)樣品6份,分別按照各自“供試品溶液的制備”,在上述試驗(yàn)條件下進(jìn)樣分析,以樣品中各成分含量的RSD來(lái)評(píng)價(jià)其重復(fù)性。取已知含量的S1號(hào)樣品,各成分平行6份分別加入與樣品中各待測(cè)成分的量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品,按“供試溶液制備”進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算其回收率。以及取S1號(hào)樣品的供試品溶液,0、2、4、6、8、10、12和24 h進(jìn)樣測(cè)定,以各成分含量的RSD考察其穩(wěn)定性在室溫放置的穩(wěn)定性等,以確保方法的可靠。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Ezinfo軟件根據(jù)上述4種量值進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì),以主成分分析(PCA)對(duì)變量進(jìn)行降維并將其聚類(lèi),繪制主成分分類(lèi)圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證以各不同濃度的對(duì)照品溶液按測(cè)定方法,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得回歸方程見(jiàn)表2,在各成分所示范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。4類(lèi)成分精密度RSD在0.10%～0.71%之間,精密度良好。重復(fù)性結(jié)果見(jiàn)表2,4類(lèi)成分含量的RSD在1.0%～1.3%之間,重復(fù)性良好?；厥章式Y(jié)果見(jiàn)表2。4類(lèi)成分的回收率在96.8%～99.0% 之間,RSD在0.9%～1.3%之間,表明方法回收率良好。穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表2,4類(lèi)成分的RSD在0.7%～1.8%之間,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 4類(lèi)成分含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果(n=6)

3.2 樣品測(cè)定將28批中藥山藥(Dioscoreaopposita)和15批偽品(木薯Manihotesculenta、參薯Dioscoreaalata、褐苞薯蕷Dioscoreapersimilis、番薯Ipomoeabatatas、日本薯蕷Dioscoreajaponica),采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度,外標(biāo)法計(jì)算其總多糖、總皂苷、總黃酮和總多酚的含量,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 43批樣品中4種成分的測(cè)定結(jié)果(n=3,mg·g-1)

由表3可知,山藥中含有豐富的多糖類(lèi)成分,占比約為山藥重量的20%(見(jiàn)圖1A)。在所測(cè)定的4類(lèi)成分中,占比超90%(見(jiàn)圖1B)。山藥及其為品種均含有4類(lèi)活性成分,且總多糖含量最高。其中山藥中平均含量達(dá)226.9 mg·g-1,其次為總皂苷(5.476 mg·g-1)和總黃酮(4.870 mg·g-1),總多酚(0.269 7 mg·g-1)平均含量最低。參薯中的總多糖含量略低(190.4 mg·g-1),總皂苷(3.591 mg·g-1)、總黃酮(5.240 mg·g-1)和總多酚(0.293 7 mg·g-1);日本薯蕷中的總多糖含量最低(137.6 mg·g-1),總皂苷(5.748 mg·g-1)、總黃酮(4.378 mg·g-1)和總多酚(0.351 6 mg·g-1),參薯和日本薯蕷與山藥較為相似。而褐苞薯蕷的總多糖含量較高(412.6 mg·g-1)、總皂苷(5.748 mg·g-1)、總黃酮(15.11 mg·g-1)、總多酚(0.541 2 mg·g-1)均顯著高于山藥。其他科的偽品木薯總多糖含量最高(563.1 mg·g-1),總皂苷(5.358 mg·g-1)和總黃酮(4.986 mg·g-1)與山藥相近,總多酚(0.166 5 mg·g-1)顯著低于山藥。另一偽品番薯總多糖含量較高(400.7 mg·g-1)、總皂苷(6.651 mg·g-1)、總黃酮(7.509 mg·g-1)、總多酚(0.584 7 mg·g-1)均顯著高于山藥。

A.4類(lèi)成分含量;B.4類(lèi)成分占比;C.山藥及其偽品中總多糖含量;D.山藥及其偽品中總皂苷含量;E.山藥及其偽品中總黃酮含量;F.山藥及其偽品中總多酚含量

3.3 山藥及其偽品主成分分析采用主成分分析(PCA)的方法,基于4類(lèi)成分對(duì)山藥及其各類(lèi)偽品進(jìn)行比較。圖2A 顯示,山藥與其偽品參薯、日本薯蕷、褐苞薯蕷、木薯、番薯的分類(lèi)并不是非常明顯,主要是因?yàn)楫a(chǎn)地為江蘇的山藥樣品顯示出了異常(圖2A靠近“PC1”的那個(gè)樣品)。由于江蘇并非山藥的主產(chǎn)區(qū)且僅有一個(gè)樣品,不具備代表性,因此將其剔除,剔除后山藥及其偽品各組之間明顯分離(見(jiàn)圖2B)。將所有偽品作為一組,山藥作為另一組進(jìn)行偏最小二乘分析(PLS-DA)的比較,同樣可以發(fā)現(xiàn)山藥和偽品之間的顯著分離(見(jiàn)圖2C),表明這兩組的某些活性成分有顯著差異。通過(guò)S-Plot和變量重要性圖(見(jiàn)圖2D～E),可知總多酚的含量對(duì)分類(lèi)的貢獻(xiàn)最大。因此,總多酚的含量可以作為區(qū)分山藥及其偽品的一個(gè)重要指標(biāo)。

A.山藥及其偽品主成分分析;B.除江蘇產(chǎn)地外,主成分分析;C.偏最小二乘分析;D.S-plot;E.變量重要性圖

3.4 不同產(chǎn)地的山藥主成分分析圖2中,江蘇產(chǎn)區(qū)的山藥與其他地區(qū)的山藥存在顯著不同,提示需要考慮不同產(chǎn)地的山藥成分是否存在差異。首先對(duì)山藥的4種活性成分的含量進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)除江蘇產(chǎn)地山藥樣品總多糖含量極高,其余3種成分的含量差異不顯著(見(jiàn)圖3A～B)。以4類(lèi)成分的含量為變量對(duì)所有山藥進(jìn)行了主成分分析,結(jié)果顯示,江蘇產(chǎn)地的山藥明顯有別于主產(chǎn)區(qū)河南、河北、山東及非主產(chǎn)區(qū)山西、遼寧、陜西的山藥(見(jiàn)圖3C),也就是只有江蘇的山藥樣品不同于其他產(chǎn)地的山藥。當(dāng)剔除江蘇山藥后,再次進(jìn)行主成分分析,各產(chǎn)地的山藥不能形成分類(lèi)(見(jiàn)圖3D),說(shuō)明由于各產(chǎn)地山藥的這4類(lèi)活性成分中差異不大,推測(cè)其原因可能是由于山藥已實(shí)現(xiàn)種植栽培、經(jīng)品種優(yōu)選后,藥材品質(zhì)已趨于統(tǒng)一。

A.4類(lèi)成分含量;B.4類(lèi)成分占比;C.各產(chǎn)地主成分分析;D.除江蘇產(chǎn)地外,其他產(chǎn)地主成分分析

4 討論

研究結(jié)果顯示,基于4類(lèi)活性成分的含量可實(shí)現(xiàn)山藥及其偽品各組之間的區(qū)分,并進(jìn)一步得知總多酚的含量對(duì)分類(lèi)的貢獻(xiàn)最大。同時(shí)江蘇產(chǎn)地的山藥也因總多糖含量異常高而區(qū)別于其他產(chǎn)地的山藥。多酚類(lèi)成分在抗氧化、清除自由基、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制環(huán)氧化物酶、保護(hù)心腦血管、預(yù)防糖尿病等方面具有很強(qiáng)的作用已成為天然抗氧劑[14-15]。由于山藥中的總多糖成分的含量占比極高,其主要成分為淀粉等多糖類(lèi)成分,其中的抗性淀粉是其功能活性成分之一[16]。山藥中活性皂苷類(lèi)成分已被用作合成治療冠心病的甾體激素和皂苷類(lèi)藥物的重要工業(yè)原料[17-18],而黃酮類(lèi)化合物具有去除體內(nèi)的氧自由基,同樣作為天然的強(qiáng)抗氧化劑[19]。因此,提示總多酚、總多糖等活性成分含量是否可以作為山藥質(zhì)量研究的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)?！吨袊?guó)藥典》2020年版(一部)[1]收載的山藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了性狀、顯微鑒別、薄層鑒別(對(duì)照藥材)、檢查(水分、總灰分、二氧化硫殘留量)、浸出物等項(xiàng)目,無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。此外,《美國(guó)草藥集》、《英國(guó)藥典》2023Ⅳ、《歐洲藥典》11.0和《日本藥局方》ⅩⅧ[9-12]同樣未設(shè)立含量測(cè)定項(xiàng)。本試驗(yàn)建立了紫外分光光度法測(cè)定中藥山藥4類(lèi)活性成分的含量測(cè)定方法,通過(guò)對(duì)活性成分總多糖及總皂苷、總黃酮和總多酚的提取條件的優(yōu)化,考察了提取溫度、時(shí)間、溶劑等,優(yōu)化其顯色條件及檢測(cè)波長(zhǎng),建立的方法準(zhǔn)確、可靠。通過(guò)山藥中4類(lèi)活性成分含量的分析,為以反映臨床療效的活性成分為控制指標(biāo)的中藥山藥質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

本試驗(yàn)建立了紫外分光光度法測(cè)定中藥山藥4類(lèi)活性成分的含量測(cè)定方法,比較了中藥山藥及其偽品中總多糖、總皂苷、總黃酮和總多酚成分含量的差異并通過(guò)主成分分析(PCA)可實(shí)現(xiàn)山藥正偽品的分類(lèi)。同時(shí)對(duì)不同產(chǎn)地來(lái)源的山藥進(jìn)行比較,通過(guò)主成分分析發(fā)現(xiàn)各主產(chǎn)區(qū)之間成分含量相近,無(wú)顯著品質(zhì)差異。本研究為基于功效物質(zhì)基礎(chǔ)的山藥質(zhì)量控制以及山藥種植資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。