王文靜

（中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430074）

引言

高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，采用高壓輸液系統(tǒng)，以不同極性的單一或混合溶劑作為流動相，利用高效色譜柱對待測物質(zhì)先分離再進(jìn)行檢測的一類儀器分析方法。該方法具有高效﹑高靈敏度﹑快速﹑易于自動化的特點，在醫(yī)藥衛(wèi)生﹑食品質(zhì)量與安全﹑石油化工﹑生理生化和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用。特別是在藥學(xué)研究領(lǐng)域，高效液相色譜法是必不可少的一類儀器分析方法［1］。因此，“儀器分析”課程要求藥學(xué)院學(xué)生能熟練掌握高效液相色譜法的基本理論知識并同時配備相應(yīng)實驗課程，幫助學(xué)生合理運用該方法對待測物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析。

高效液相色譜法作為“儀器分析”課程中色譜分析法的一個重要組成部分，其涉及的理論知識面很廣，包括色譜法的基本概念﹑流動相的種類及洗脫能力﹑色譜流出曲線﹑色譜分離原理﹑色譜分離方程以及液相檢測器等。在實際教學(xué)過程中，由于《高效液相色譜法》章節(jié)中涉及大量計算方程式和相關(guān)參數(shù)，且部分參數(shù)表示方式很接近，如分配系數(shù)K=溶質(zhì)在固定相中的濃度/溶質(zhì)在流動相中的濃度，分配比k=溶質(zhì)在固定相中的質(zhì)量/溶質(zhì)在流動相中的質(zhì)量。這導(dǎo)致學(xué)生在學(xué)習(xí)過程中容易對公式混淆﹑記憶困難。另外，高效液相色譜法作為最常用的儀器分析方法之一，其重難點是如何設(shè)計適當(dāng)?shù)纳V條件對待測物質(zhì)進(jìn)行分離。需要根據(jù)待測物質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)，選擇不同分離原理色譜柱﹑流動相體系及比例﹑流速﹑檢測器等，在最短時間內(nèi)達(dá)到完全分離。雖然在對應(yīng)的實驗課程中設(shè)計了“利用高效液相色譜法檢測不同廠家雙黃連口服液中黃芩苷含量”的實驗，但該實驗只是一個驗證性實驗，主要進(jìn)行定量分析。實驗中流動相體系及比例﹑流速﹑色譜柱及檢測器均已經(jīng)確定，學(xué)生在實際操作過程中無法體會流動相洗脫能力的差異﹑流動相對分離度的影響﹑柱效與流速之間的關(guān)系﹑不同色譜柱分離原理以及不同檢測器的適用范圍，從而導(dǎo)致教學(xué)效果不理想。

案例教學(xué)法是以案例為基礎(chǔ)的一類開放式﹑互動式的教學(xué)方法，起源于20世紀(jì)20年代，由美國哈佛商學(xué)院所倡導(dǎo)，于1990年之后在國內(nèi)教育界開始探索［2］。該方法通過教師提供特定案例材料，學(xué)生閱讀材料﹑查閱文獻(xiàn)﹑積極探索﹑擬定解決方案，在課堂上進(jìn)行分組或集中討論，對不同解決方案進(jìn)行對比分析，總結(jié)經(jīng)驗，最終達(dá)到強化記憶﹑熟練掌握知識點的效果。案例教學(xué)法鼓勵學(xué)生獨立思考，培養(yǎng)學(xué)生的自主思維，引導(dǎo)學(xué)生在解決問題的過程中掌握理論知識，通過共同探討，調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)主動性，從而提高教學(xué)質(zhì)量。

一、案例選擇

案例是以教學(xué)為目的，具有典型性﹑客觀生動性以及多樣性的特點。好的案例必須緊扣對應(yīng)的理論知識，并且來源于實踐，而不是主觀臆測和虛構(gòu)的。同時，案例應(yīng)該存在多種解決方案，可為學(xué)生提供充分的探索空間?！秲x器分析》教材中高效液相色譜法部分的實例，往往是為了證明某些理論而給出的實驗結(jié)果，忽視了方案設(shè)計及條件摸索的過程，使學(xué)生難以將結(jié)果與原理相結(jié)合。在國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊中，每年都會有大量基于高效液相色譜法建立的分析方法，用于特殊物質(zhì)的定性或定量檢測。這些研究論文通常是根據(jù)待測物結(jié)構(gòu)推測其物理或化學(xué)性質(zhì)，設(shè)計檢測方案并逐步優(yōu)化，最終形成針對特殊物質(zhì)的分析方法?？梢詫⒋祟愌芯空撐淖鳛榻虒W(xué)案例，以高效液相色譜法的核心問題“分離—檢測”為導(dǎo)向，在課堂上進(jìn)行分析討論，培養(yǎng)學(xué)生文獻(xiàn)查閱﹑實驗方案設(shè)計﹑數(shù)據(jù)分析以及成果展示等各方面的能力。

二、教學(xué)案例——根據(jù)待測物質(zhì)的性質(zhì)選擇不同的分離方法

高效液相色譜法的關(guān)鍵步驟是分離樣品，根據(jù)分離機制的不同，可以分為吸附色譜法（adsorption chromatography）﹑分配色譜法（partition chromatography）﹑離 子色譜法（ion chromatography）﹑分 子排阻色譜法（size exclusion chromatography）﹑鍵合色譜法（bonded-phase chromatography）﹑親和色譜法（affinity chromatography）［3］。

1.液-液分配色譜法的特點是固定相和流動相均為液體，通過化學(xué)反應(yīng)將有機分子鍵合在擔(dān)體表面，形成一層單分子薄膜，利用組分在固定液與流動相中溶解度的差異，實現(xiàn)分離。根據(jù)固定液與流動相的極性差別，將液-液分配色譜法分為正相和反相色譜法。正相色譜法以硅膠為擔(dān)體，通過化學(xué)反應(yīng)以氰基或氨基取代硅膠中的羥基形成固定相，選擇正己烷等非極性溶劑作為流動相，固定相極性大于流動相極性，極性小的組分先流出色譜柱。適用于分離中等極性的組分，如芳香醇﹑芳香胺﹑甾族﹑脂和有機氯農(nóng)藥等。反相色譜法是將十八烷基﹑苯基或辛烷基等鍵合在硅膠上作為固定相，以水和溶于水的有機溶劑（乙腈﹑甲醇﹑乙醇等）作為流動相。極性小的組分在固定液中的溶解度大，后流出色譜柱。適用于分離非極性或中等級性的組分，如天然小分子化合物﹑同系統(tǒng)﹑烷烴﹑激素等。

環(huán)孢素A（Cyclosporine A,CsA）是真菌產(chǎn)生的具有11個氨基酸的環(huán)肽類化合物（如圖1），溶于甲醇﹑乙醇﹑二氯甲烷﹑丙酮，微溶于水。臨床上用于治療器官和組織移植后的排異反應(yīng)［4-5］。根據(jù)其脂溶性特點，選擇液-液分配色譜法進(jìn)行分析，采用反相C18（十八烷基鍵合硅膠）作為固定相，甲醇-水和乙腈-水體系作為流動相。結(jié)果表明CsA保留時間對有機相比例變化比較敏感，隨著有機相比例降低，其保留時間明顯增加，且甲醇-水體系變化比乙腈-水體系更明顯。乙腈比例為75%～85%，甲醇比例為84%～88%，CsA的保留因子（k）控制在3～7范圍內(nèi)。

圖1 Cyclosporine A、次黃嘌呤、黃嘌呤和番茄紅素化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.液-固吸附色譜法以固體吸附劑為固定相，利用組分分子與吸附劑間吸附力的差異進(jìn)行分離。常用的固體吸附劑有硅膠﹑氧化鋁﹑活性炭﹑高分子多孔微球（有機膠）﹑分子篩及聚酰胺等。吸附色譜法中的流動相主要為非極性的烴類（如己烷﹑庚烷），可以加入某些有機溶劑（如甲醇﹑二氯甲烷﹑加酸）調(diào)節(jié)流動相極性的pH值，固定相極性大于流動相，為反相色譜。流動相極性越大，洗脫能力越強；組分極性越大，保留時間越長。吸附色譜法對異構(gòu)體和具有不同官能團(tuán)的化合物選擇性較好，常用于分離相對分子量中等的油溶性物質(zhì)。

番茄紅素是植物性食物中存在的一種類胡蘿卜素，廣泛存在于番茄﹑西瓜﹑葡萄柚等水果中，為目前自然界中發(fā)現(xiàn)的最強抗氧化劑，同時還可以降低前列腺癌等多種腫瘤和心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險。其不僅作為食品加工的天然色素，且越來越多地應(yīng)用于保健食品﹑藥品和化妝品中。番茄紅素為直鏈形碳?xì)浠衔?，具?1個共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵（圖1），結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，具有多種順反異構(gòu)體。對其順反異構(gòu)體的分離和分析多采用常規(guī)的C8或C18色譜柱，但效果不理想，很難達(dá)到完全分離。李偉等［6］在前人研究的基礎(chǔ)上，選擇液-固吸附色譜法對番茄紅素異構(gòu)體進(jìn)行分離。該方法選擇Nucleosil 300-5（Macherey-Nagel）色譜柱，以正己烷為流動相，對不同樣品中的番茄紅素異構(gòu)體實現(xiàn)較好分離。

3.離子交換色譜法是以硅膠為基體的化學(xué)鍵合離子交換劑或交聯(lián)聚苯乙烯為基體的離子交換樹脂為固定相，流動相為具有一定離子強度并對pH有一定緩沖能力的水溶液，利用被分離組分離子交換能力的差別或選擇性系數(shù)的差別而實現(xiàn)分離。組分離子對固定相的親和力越大，交換力越強，越容易交換到固定相上，保留時間也越長；反之，親和力小的離子，保留時間短。離子交換色譜法主要用于分離離子和可離解的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)﹑多糖﹑寡核苷酸﹑噬菌體﹑病毒等。

肌氨肽苷注射液是臨床上用于治療心血管疾病的常用藥物?！吨袊幍洹芬?guī)定其中主成分次黃嘌呤的含量應(yīng)為標(biāo)示量的85%～115%?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)以C18為固定相，以磷酸二鉀緩沖溶液（0.001 mol·L-1，pH 6.9）-甲醇（100∶0.2）為流動相，對次黃嘌呤含量進(jìn)行測定。由于標(biāo)準(zhǔn)中有機相比例過低，導(dǎo)致待測物出峰時間太短，次黃嘌呤與其干擾物黃嘌呤的分離度很難達(dá)標(biāo)，因此須要開發(fā)新方法對次黃嘌呤的含量進(jìn)行測定［7］。由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同（圖1），在pH值為2.5的水溶液中，次黃嘌呤會發(fā)生解離，約38%以正離子存在，而黃嘌呤則不會解離，仍為中性分子。因此，白璧煒等［8］根據(jù)兩者的不同性質(zhì)，選擇離子交換色譜法對次黃嘌呤含量進(jìn)行測定。采用磺酸基陽離子交換鍵合硅膠為固定相，以水（0.001 mol·L-1稀硫酸調(diào)節(jié)pH為2.2﹑2.5﹑2.8和3.5）為流動相。結(jié)果顯示，pH值為2.5時，色譜峰寬最窄﹑理論塔板數(shù)最高且出峰時間較快。因此，該方法的最適條件為pH=2.5±2.0。與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)相比較，新方法穩(wěn)定性好﹑干擾少﹑分離度高，且無須配制對照品進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性試驗，節(jié)省時間和成本。

4.分子排阻色譜法又稱為凝膠色譜法，是目前最常用的分離技術(shù)之一。分離原理主要是以具有一定孔徑分布的多孔凝膠填料作為固定相，依靠待測樣品的分子尺寸與凝膠孔徑間的關(guān)系進(jìn)行分離。大分子組分難以進(jìn)入凝膠孔徑內(nèi)，只能隨流動相在填料間隙移動，最先洗脫出來；中等大小的組分可以通過較大的孔徑進(jìn)入凝膠填料內(nèi)部，在柱中滯留，較慢洗脫出來；小分子組分可以進(jìn)入凝膠填料的大部分孔徑，滯留作用更強，最后洗脫出來。該方法具有保留時間短﹑譜峰窄﹑柱壽命長﹑生物相容性好等特點，廣泛用于大分子的分級和大分子物質(zhì)（如核酸﹑蛋白質(zhì)﹑油脂和多糖）的分離。

淀粉是由葡萄糖分子通過糖苷鍵聚合而成的大分子物質(zhì)，經(jīng)過機械﹑化學(xué)或生化工藝的加工，廣泛應(yīng)用于食品﹑醫(yī)藥﹑紡織及造紙等領(lǐng)域［9］。葡聚糖是淀粉的酶解產(chǎn)物之一，窄相對分子質(zhì)量分布范圍的葡聚糖在臨床上有很高需求。已有報道稱相對分子質(zhì)量增大及分布不均勻會引起右旋糖酐注射液的過敏反應(yīng)［10］?！吨袊幍洹纷?000年版起規(guī)定以相對分子質(zhì)量與相對分子質(zhì)量分布測定法對右旋糖酐注射液質(zhì)量進(jìn)行控制。因此，需要一種能夠準(zhǔn)確﹑快速測定淀粉降解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量的方法來衡量產(chǎn)品質(zhì)量。劉艷群等［11］于2005年發(fā)表了一篇關(guān)于運用凝膠滲透色譜法（GPC）測量淀粉酶解產(chǎn)物分子量的研究論文。淀粉經(jīng)過淀粉酶酶解，許多長鏈﹑大分子的多糖被水解成了小分子，不同分子量組分進(jìn)入凝膠孔的機會有所差異，最終達(dá)到以長鏈分子在前﹑短鏈分子在后的順序從柱中淋洗出來的目的，之后這些組分以譜帶形式進(jìn)入示差折射檢測器進(jìn)行檢測，通過與標(biāo)準(zhǔn)品所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比計算出樣品分子量。該方法重復(fù)性好，可以用于淀粉酶解反應(yīng)的監(jiān)控和指導(dǎo)淀粉制品的加工。

5.親和色譜是一種利用固定相的結(jié)合特性來分離物質(zhì)的色譜方法。該方法將能與待分離物質(zhì)發(fā)生可逆吸附的生物大分子（抗原/抗體﹑酶﹑受體蛋白﹑細(xì)胞膜等）通過一定技術(shù)手段與固定相載體相偶聯(lián)，以此作為固定相填充色譜柱。當(dāng)含有待分離物質(zhì)的混合物隨著流動相流經(jīng)色譜柱時，樣品中存在的親和配基與偶聯(lián)的生物大分子發(fā)生特異性結(jié)合，產(chǎn)生滯留。而其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)不被吸附，從色譜柱中快速流出，從而實現(xiàn)對目標(biāo)成分的選擇性分離。

黃芪甲苷（Astragaloside IV）具有增強免疫力﹑降血糖﹑強心降壓﹑抗腫瘤和抗衰老等多種藥理活性，是中藥黃芪的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，用于評價黃芪及其制劑質(zhì)量［12］?！吨袊幍洹罚?000年版）規(guī)定采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLCELSD），以C18為填充劑，乙腈-水（32∶68）作為流動相，對黃芪甲苷含量進(jìn)行測定。但該方法對儀器設(shè)備要求較高，且樣品預(yù)處理工序煩瑣，不適于大批量樣品的快速檢測。于生蘭［13］基于抗原抗體反應(yīng)的特異性，建立了一種快速﹑準(zhǔn)確﹑靈敏的黃芪甲苷免疫分析檢測方法。首先通過合成的黃芪甲苷人工抗原誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體，利用黃芪甲苷與載體結(jié)合制備成的免疫親和色譜柱，靶向分離純化得到單克隆抗體，建立黃芪甲苷間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法，用于黃芪甲苷的含量測定［14］。同時，在本研究的基礎(chǔ)上，還可以選擇抗AST單克隆抗體作為配基，制備免疫親和色譜柱，用于黃芪甲苷的特異性分離和純化，為黃芪及其制品的研究提供基礎(chǔ)。

為進(jìn)一步強化學(xué)習(xí)效果，提升學(xué)生對高效液相色譜法不同分離機制的理解，可以根據(jù)選擇的案例，制訂如下教學(xué)方案：（1）學(xué)生分組。按照授課人數(shù)，將學(xué)生平均分為6～8組。（2）課題設(shè)計。根據(jù)待測物質(zhì)的不同性質(zhì)以及實驗要求，設(shè)計四個研究課題，幫助學(xué)生掌握不同的分離原理及檢測方式。人參中不同人參皂苷的分離純化，牛初乳加鈣咀嚼片中免疫球蛋白IgG的含量測定，磷酸硝酸溶液中鈣﹑鎂﹑鐵﹑鋁離子的分離，頭孢克肟顆粒中聚合物的含量測定。（3）分析方法設(shè)計。學(xué)生以小組為單位，選擇一個課題研究。利用課余時間查閱文獻(xiàn)，通過分析待測物性質(zhì)及實驗要求，設(shè)計一個或多個合理的分析檢測方法。（4）匯報討論。每個小組推選一名學(xué)生，以PPT的形式對本組設(shè)計的實驗方案進(jìn)行展示，其他學(xué)生提問并評價其合理性。

通過案例教學(xué)，可以鍛煉學(xué)生查閱文獻(xiàn)﹑設(shè)計實驗及團(tuán)隊合作等各方面的能力，為今后的工作及科研提供助力。同時，在自主學(xué)習(xí)﹑解決問題的過程中，進(jìn)一步加深學(xué)生對課堂知識的理解，并能舉一反三﹑靈活運用。

三、教學(xué)方法探索

只有“儀器分析”課堂教學(xué)足夠生動活潑，才能夠激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，從而提升學(xué)生的學(xué)習(xí)自主性，這不僅需要從課堂內(nèi)容下功夫，還要從授課方式上雙管齊下，助力培養(yǎng)能夠真正推動社會發(fā)展的新型人才。下面就“儀器分析”課堂教學(xué)方法進(jìn)行探討，以推進(jìn)高校課堂“雙一流”建設(shè)。

首先，學(xué)生在課堂中能充分表達(dá)意見和想法，在思考中碰撞出思維的火花，能夠讓學(xué)生在課堂教學(xué)中充分發(fā)揮主觀能動性。在課前布置學(xué)習(xí)任務(wù)，促進(jìn)學(xué)生自主學(xué)習(xí)，在課堂教學(xué)中充分尊重學(xué)生的主體地位，爭取把課堂還給學(xué)生。如在《緒論》章節(jié)教學(xué)中，教師可以組織學(xué)生進(jìn)行“儀器分析與我們?nèi)粘Ｉ畹穆?lián)系”小組討論，列舉日常生活和工作中接觸到的分析儀器及其作用；探討儀器分析的發(fā)展現(xiàn)狀及存在的問題與挑戰(zhàn)。

其次，近年來新的儀器分析方法及檢測技術(shù)均得以迭代升級，雖然基本的分析方法原理依然適用，但是教材中仍存在大量關(guān)于老舊儀器構(gòu)造的內(nèi)容，課堂授課內(nèi)容結(jié)合不同專業(yè)的需求，將相關(guān)科研成果融入課堂，注重跟蹤相關(guān)新技術(shù)﹑新方法，緊跟時代步伐將其反映在教學(xué)中。以高水平科學(xué)研究支撐高質(zhì)量人才培養(yǎng)，定制具有專業(yè)特色的課堂。

同時，“儀器分析”是一門理論與實踐并重的課程。因此，在理論授課之外，實踐教學(xué)也占有重要的地位。從專業(yè)特色出發(fā)設(shè)計應(yīng)用實例，課堂知識緊密聯(lián)系生產(chǎn)實際，最終形成“思考—理論—實踐—解決實際問題”的綜合授課模式。

結(jié)語

目前，本科生的理論課程學(xué)時短﹑知識面廣，而實驗教學(xué)多為驗證性實驗，學(xué)生不能對實驗原理進(jìn)行深入了解，無法將理論知識與實際操作相結(jié)合。案例教學(xué)是一種教師提出案例材料，學(xué)生查閱文獻(xiàn)﹑互相討論的模式，讓學(xué)生既能掌握基礎(chǔ)專業(yè)知識，也能提高解決實際問題的能力。有效提高學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)，為日后的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。