朱鑫宇，白浩然，趙娜萍，戚大川，衛(wèi)立辛，張 黎 （.海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究中心, 上海004；.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，上海000；.國家肝癌科學(xué)中心, 上海0805）

肝癌（HCC）是常見的惡性腫瘤之一，尤其在我國特別高發(fā)，全球HCC 患者超過半數(shù)在中國。2022 年我國HCC 發(fā)病率達36.77/10 萬人，位于惡性腫瘤第4 位；總體病死率達31.65/10 萬人，居惡性腫瘤第2 位[1]。HCC 已然成為我國一項社會公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危害國民健康，給國民經(jīng)濟和社會發(fā)展帶來沉重負擔(dān)[2-4]。目前手術(shù)及肝移植可以臨床治愈早期HCC，但多數(shù)患者診斷時已是晚期[5]。盡管免疫檢查點抑制劑和小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合治療法為晚期HCC 患者帶來了希望，但患者的中位生存期僅提高至19.2 個月[6]。中醫(yī)藥治療晚期HCC 有其獨特的優(yōu)勢，可以增強化療、靶向、免疫治療療效，減輕毒副作用，改善癥狀，延長患者總生存期。因此運用中醫(yī)藥探索晚期HCC 患者的治療方案，對阻止該疾病的進一步發(fā)展，延長患者生存期具有重要的意義。

八寶丹起源于明代，至今有近400 年的應(yīng)用歷史，是原國家食品藥品監(jiān)督管理總局允許使用天然麝香的特效藥之一。八寶丹成分包含天然牛黃、天然麝香、蛇膽、羚羊角、珍珠、三七等。既往研究已證實，八寶丹可用于急慢性肝炎、膽囊炎等肝膽系統(tǒng)疾病，具有清熱利濕、祛黃解毒的功效[7-8]，并且八寶丹對HCC、胰腺癌、膽囊癌等消化系統(tǒng)腫瘤性疾病疾也有治療效果[9-10]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，八寶丹可以通過抑制慢性炎癥介導(dǎo)的肝纖維化進而抑制HCC 的發(fā)生，但八寶丹對于晚期HCC 的治療作用機制尚未明確[11]。因此探尋八寶丹對晚期HCC 的作用機制可為中醫(yī)藥治療HCC 提供證據(jù)。

二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)的大鼠模型是一個成熟的原發(fā)性HCC 模型。DEN 模型中HCC 的發(fā)展過程與人類HCC 相似，是一種非常合適研究HCC的生物工具[12]。本研究利用DEN 大鼠觀察八寶丹對HCC 的影響，發(fā)現(xiàn)其能有效延緩HCC 進展，但是作用機制尚不明確。由于八寶丹成分復(fù)雜多樣，需要多組學(xué)分析技術(shù)探明八寶丹中有效藥物成分與疾病的互作關(guān)系，因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和UPLC-MS 方法，篩選八寶丹治療HCC 的有效化合物和潛在治療靶點，構(gòu)建“疾病－基因－藥物”的多層次網(wǎng)絡(luò)，揭示八寶丹調(diào)控疾病進展的潛在機制，為八寶丹的“老藥新用”和HCC 晚期患者的臨床用藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

八寶丹膠囊（批號Z10940006，廈門中藥廠有限公司）、甲醇（A452-4，F(xiàn)isher）、乙腈（A998-4，F(xiàn)isher）、甲 酸（A117-50，F(xiàn)isher）；DEN（245 437,Sigma-Aldrich）；高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC I-Class HF，Water）、色譜柱（ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, Water）、PDA 檢測器（ACQUITY Premier PDA eλ，Water）；高分辨液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀（Thermo-Obritrap-QE，Thermo）。

圖1 八寶丹對HCC 大鼠的影響

圖2 八寶丹通過多化學(xué)成分和多靶點對原發(fā)HCC 的影響

圖3 富集分析發(fā)現(xiàn)八寶丹臨床上可能是通過多途徑影響HCC

1.2 方法

1.2.1 HCC 大鼠模型的建立及分組給藥

將32 只SD 大鼠（6～8 周齡，180～200 g，雄性，SPF 級）隨機分為 4 組，每組8 只，分別為：對照組、八寶丹組、DEN 誘導(dǎo)組（DEN 組）、DEN+八寶丹組。DEN 組和DEN+八寶丹組連續(xù)飼喂12 周DEN 溶液（95 μg/ml）, 對照組和八寶丹組飼喂滅菌水。八寶丹組不進行DEN 誘導(dǎo)，從第12 周開始予以八寶丹給藥。DEN 誘導(dǎo)組，DEN 飲水喂養(yǎng)大鼠持續(xù)12 周，誘導(dǎo)HCC 的發(fā)生，然后使用生理鹽水灌胃，1 次/2 d ，持續(xù)4 周。DEN+八寶丹組，DEN誘導(dǎo)HCC 發(fā)生后，八寶丹按照0.5 g/kg 的劑量對實驗動物進行灌胃，1 次/2 d，持續(xù)4 周（圖1A）。實驗結(jié)束后處死部分大鼠獲取肝臟組織標(biāo)本，剩余部分停藥后繼續(xù)觀察生存期。

1.2.2 UPLC-MS 分析八寶丹中的化學(xué)成分

將八寶丹取出，用液氮研磨均勻后，稱取約98.3 mg 樣本于1.5 ml 離心管中；加入983 μl 甲醇-水溶液（V/V=3∶1，含混合內(nèi)標(biāo)，4 μg/ml），渦旋震蕩1 min，加入鋼珠；放入-40 ℃冰箱中預(yù)冷2 min后，在研磨機中研磨（60 Hz，2 min）；冰水浴超聲提取60 min，-40 ℃下靜置30 min；離心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取全部上清液過0.22 μm 的有機相濾膜；4 ℃下靜置過夜，離心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取上清液過0.22 μm 的有機相濾膜置于內(nèi)襯管的LC-MS 進樣小瓶中進行分析。本次實驗的分析儀器為ACQUITY UPLC I-Class HF 超高效液相串聯(lián)QE 高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。色譜條件：色譜柱（ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）；柱溫：45 ℃；流動相：水（含0.1%甲酸）和乙腈，梯度洗脫信息詳見表1；流速：0.35 ml/min；進樣體積：5 μl；PDA 掃描范圍210～400 nm。質(zhì)譜條件：離子源（HESI，樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正負離子掃描模式）；數(shù)據(jù)采集模式為DDA；掃描方式為Full MS/dd-MS2（TOP 8）；質(zhì)譜參數(shù)詳見表2。

表1 八寶丹梯度洗脫信息

表2 Thermo-Obritrap-QE 質(zhì)譜參數(shù)信息

1.2.3 八寶丹有效化學(xué)成分篩選策略

八寶丹 UPLC-MS 數(shù)據(jù)由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供，根據(jù)八寶丹化學(xué)成分在210 nm和 254 nm 波長下的紫外吸收圖初步確定其結(jié)構(gòu)類型。質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)Progenesis QI v3.0 軟件（Nonlinear Dynamics, Newcastle, 英國）處理（基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化）獲得八寶丹的質(zhì)譜峰表。

1.2.4 八寶丹有效成分鑒定方法

八寶丹的質(zhì)譜峰表中化合的鑒定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級碎片以及同位素分布，并結(jié)合TCM 數(shù)據(jù)庫（上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，中國）進行鑒定。在本研究中，質(zhì)譜峰表中對各鑒定物質(zhì)進行評分，滿分80 分，其中，一級質(zhì)譜精確分子量匹配，20 分；二級質(zhì)譜碎片匹配，20 分；同位素分布匹配，20 分；保留時間匹配，20 分。將化合物相對峰面積的總含量定為100%，得到定性定量結(jié)果數(shù)據(jù)矩陣，并規(guī)定峰面積的比值大于1%，總分大于55，一級分子量誤差在1.4×10-6以內(nèi)的化合物作為八寶丹的有效成分進行后續(xù)分析。

1.2.5 八寶丹中有效化學(xué)成分靶點的篩選

根據(jù)前期篩選出的有效化學(xué)成分導(dǎo)入 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫查找與有效活性成分相對應(yīng)的Smiles 號，并將Smiles 號導(dǎo)入 Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）和SuperPred（https://prediction.charite.de/subpa ges）數(shù)據(jù)庫進行有效活性成分對應(yīng)靶點的預(yù)測，保留結(jié)合可能性1%以上或文獻報道過與化合物相關(guān)的作用靶點。根據(jù)各成分相關(guān)基因富集情況，利用R（version 3.6.1）構(gòu)建各組分之間互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 HCC 相關(guān)靶點的篩選

使用 GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫、OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫和Therapeutic Target Database（https://db.idrblab.net/）篩選HCC 對應(yīng)靶點，以“Hepatocellular carcinoma”為關(guān)鍵詞進行篩選。并根據(jù)文獻比對，保留與HCC 相關(guān)的靶點用于后續(xù)研究。

1.2.7 有效成分與HCC 互作分析

根據(jù)前期有效成分相關(guān)靶點篩選和HCC 相關(guān)靶點的選擇，取交集進行后續(xù)分析。將共同靶點的數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，再利用Cytoscape3.9.0 軟件，以介數(shù)中心數(shù)為參考，篩選出關(guān)鍵調(diào)控蛋白。

1.2.8 GO 功能注釋及 KEGG 通路富集分析

將有效成分和HCC 之間的共有靶點導(dǎo)入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為人，P＜0.01，分別勾選 GO 分析中的生物過程、細胞組成 、分子功能以及Pathway 中的 KEGG 進行富集分析，提取結(jié)果后，應(yīng)用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）平臺將富集分析結(jié)果可視化。

1.2.9 TCGA 相關(guān)性分析

將有效成分和HCC 之間的共有靶點依次導(dǎo)入GEPIA2 （http://gepia2.cancer-pku.cn/）中，以182例TCGA 數(shù)據(jù)庫中保留的臨床HCC 患者的RNA 測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，分析共有靶點與患者生存期的相關(guān)性。

1.2.10 H&E 染色

大鼠被處死后，用磷酸鹽緩沖鹽水和 4% 多聚甲醛進行經(jīng)心灌注。取肝臟組織進行病理評估。石蠟包埋后肝臟切成 5 μm 厚的切片。染色時將HCC 組織石蠟切片，60 ℃烘烤固片30 min；脫蠟至水，并按照生產(chǎn)商的方案用蘇木精-伊紅染色，最后鏡下觀察各組織病理學(xué)情況。

1.2.11 統(tǒng)計學(xué)方法

使用 GraphPad Prism 9.0 軟件進行方差分析，每次實驗的定量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用t檢驗。Kaplan-Meier 分析用于進行生存期分析。采用對數(shù)秩檢驗比較各組存活時間。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 八寶丹延長原發(fā)HCC 大鼠生存期并減少腫瘤負荷

在實驗觀察期間，對照組和八寶丹組的大鼠均存活，而DEN 組平均生存期為17.1 周，DEN+八寶丹組平均生存期為23 周，是DEN 組的1.35 倍（圖1B）。同時觀察肝臟大體發(fā)現(xiàn)，對照組和八寶丹組肝臟組織未見異常；DEN 組肝臟組織中均出現(xiàn)大量肉眼可見腫瘤結(jié)節(jié)；而DEN+八寶丹組肝臟組織中雖然出現(xiàn)了部分肉眼可見的腫瘤結(jié)節(jié)，但大體形態(tài)上相較于DEN 組損傷較輕（圖1C）。通過對腫瘤結(jié)節(jié)的最大直徑和數(shù)量測量統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)DEN+八寶丹組腫瘤負荷和最大腫瘤直徑顯著小于DEN 組（圖1D）。同時，對各肝臟組織進行病理學(xué)評估和H&E 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，八寶丹組和正常肝臟組織組織排列緊密，未出現(xiàn)肝臟損傷，而DEN 組出現(xiàn)明顯的組織空泡化，組織間排列彌散，肝臟損傷嚴(yán)重。盡管DEN+八寶丹組大鼠肝臟組織相較于八寶丹組和正常對照大鼠出現(xiàn)了明顯的炎癥浸潤和肝纖維化，但是，相較于DEN 組的肝臟組織損傷較輕且組織排列較為緊密（圖1E）。H&E 染色結(jié)果表明，八寶丹對大鼠肝臟未發(fā)現(xiàn)實質(zhì)性病理損傷，并且緩解了同期DEN 大鼠的肝臟病理狀態(tài)。上述結(jié)果表明，八寶丹能延緩DEN 大鼠的生存期并減少腫瘤負荷，但是具體機制尚不明了。

2.2 八寶丹可能通過多種化合物和多靶點調(diào)控HCC的進展

為進一步探索八寶丹對HCC 的影響機制，本研究首先對八寶丹進行UPLC-MS 中藥化學(xué)成分檢測。中藥成分鑒定流程如圖2A 所示，將八寶丹顆粒進行溶解、研磨、過濾和提純后上機檢測。紫外吸收圖譜發(fā)現(xiàn)，210 nm 處皂苷類成分在該波長下有強吸收，254 nm 處含有苯環(huán)、雙鍵等結(jié)構(gòu)的成分在該波長下有強吸收。然后通過基峰色譜圖反應(yīng)樣品的整體信息，3 次重復(fù)性檢測結(jié)果可知該檢測方法離子相應(yīng)響度、保留時間重復(fù)性良好，由此說明本次實驗儀器穩(wěn)定、數(shù)據(jù)可靠。原始數(shù)據(jù)經(jīng)Progenesis QI 軟件處理和TCM 數(shù)據(jù)庫進行定性后，共發(fā)現(xiàn)851 個中藥成分，保留9 個主要活性成分供后續(xù)研究，分別是牛磺草膽酸鹽、12-酮脫氧膽酸、去氧膽酸、牛磺膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨膽酸、三七皂苷R1、環(huán)氧油酸和3α,7α-二羥基-12-羰基-5β-膽烷酸。將主要活性成分信息分別導(dǎo)入PubChem 和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，共獲得285 個潛在作用靶點，并繪制出化合物之間的互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)八寶丹中主要化學(xué)成分之間關(guān)系密切，相互存在多個共有靶點（圖2B）。在Therapeutic Target Database、GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫和文獻中共篩選出與HCC 相關(guān)的靶點637 個，保留八寶丹與HCC 共有相關(guān)性靶點16 個（圖2C）作為潛在調(diào)控分子。將潛在調(diào)控分子導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白與蛋白間互作網(wǎng)絡(luò)（圖2D），再利用Cytoscape3.9.0 軟件，以介數(shù)中心數(shù)（網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑中經(jīng)過該節(jié)點的路徑的數(shù)目占最短路徑數(shù)的比例）為參考，將潛在調(diào)控分子進行排序，介數(shù)中心數(shù)越大，圓形的直徑越大，顏色越藍，說明在該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)聯(lián)度就越高，反之圓形的直徑越小，顏色越綠（圖2E）。其中，潛在調(diào)控分子介數(shù)中心數(shù)排名前5 的分別是：白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、細胞腫瘤抗原p53（TP53）、過氧化酶增殖因子活化受體-γ（PPARG）和雌激素受體1（ESR1）。

2.3 八寶丹臨床上可能通過多途徑影響HCC

為探索八寶丹調(diào)控HCC 的潛在作用機制，本研究基于DAVID 數(shù)據(jù)庫將上述16 個共有相關(guān)靶點進行GO 及KEGG 富集分析。GO 富集分析顯示802 個生物過程、11 個細胞組成、43 個分子功能，KEGG 通路富集分析共90 條通路，展示排名前10 的富集條目。

圖3A 提示八寶丹在生物過程中通過沉默細胞中mRNA 的轉(zhuǎn)錄，抑制上皮樣細胞的增殖和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合調(diào)控HCC；圖3B 提示八寶丹有效化學(xué)成分在細胞層面上通過結(jié)合各種細胞器或細胞膜受體發(fā)揮作用；圖3C 提示八寶丹有效化學(xué)成分能調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、細胞因子的分泌及細胞核的狀態(tài)。圖3D 提示八寶丹調(diào)控HCC 是通過多通路、多靶點之間的相互作用。最后在TCGA 數(shù)據(jù)庫中查詢了共有相關(guān)靶點與HCC 患者的臨床相關(guān)性，在182 例臨床樣本的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，3 個基因的高表達提示著患者的總生存期較短，分別為ESR1（LogrankP=0.000 69）、PPARG（LogrankP=0.000 74）和COL18A1（LogrankP=0.006），詳見圖3E～G，P值由Kaplan-Meier 生存曲線和log-rank 檢驗確定。

3 討論

HCC 是一種典型的炎癥相關(guān)癌癥，近90%的HCC 與病毒性肝炎、過度酒精攝入、非酒精性脂肪肝或酒精性脂肪肝引起的長期炎癥相關(guān)。在HCC 慢性炎癥微環(huán)境中，先天免疫細胞和成纖維細胞被募集并激活至損傷部位分泌細胞因子和生長因子，有利于腫瘤細胞的增殖或抵消凋亡[6]。研究表明，NF-κB 和JAK-STAT 兩條經(jīng)典通路是促進HCC 的關(guān)鍵炎癥信號通路，抑制炎癥通路的激活能有效抑制住HCC 進一步進展[13]。八寶丹作為傳統(tǒng)中藥復(fù)方，臨床上已發(fā)現(xiàn)對HCC、胰腺癌、膽囊癌等消化系統(tǒng)腫瘤性疾病疾也有著積極的治療效果，但是具體機制尚不明了。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，八寶丹可以通過抑制炎癥細胞因子分泌和減少肝前體細胞上TRL4 的表達，從抑制肝前體細胞的腫瘤轉(zhuǎn)化，進而抑制腫瘤發(fā)生[11]。因此本研究團隊假設(shè)八寶丹減緩了原發(fā)性HCC 的腫瘤進展。

在本研究中，通過觀察八寶丹對DEN 誘癌大鼠的影響，發(fā)現(xiàn)八寶丹可以延長DEN 大鼠的生存期，并且緩解DEN 導(dǎo)致的肝臟腫瘤負荷。但是，目前尚未有具體的機制闡明這一現(xiàn)象。為探索是八寶丹中何種中藥成分發(fā)揮了作用，利用UPLCMS 技術(shù)檢測出化學(xué)成分851 個，鑒定出主要活性成分9 個，其中大部分是人體膽汁酸中主要成分，也發(fā)現(xiàn)具有強抗炎作用的三七皂苷R1[14]，主要活性成分之間關(guān)系密切。共篩選出285 個潛在作用靶點。在與HCC 相關(guān)靶點取交集后，篩選出八寶丹調(diào)控HCC 的16 個潛在靶點。利用上述靶點構(gòu)建了八寶丹“化學(xué)成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)模型以及PPI 網(wǎng)絡(luò)，將潛在作用靶點進行排序，發(fā)現(xiàn)了HCC 小鼠模型已驗證能加速HCC 的發(fā)展并影響腫瘤的侵襲性免疫信號IL-6 和TNF[15]；HCC 中的顯性突變驅(qū)動因子TP53 和RB1[16]；與HCC 炎癥相關(guān)的信號分子STAT3；與腫瘤細胞增殖相關(guān)的分子MTOR 和AFP[17]。

GO 富集分析結(jié)果提示，八寶丹調(diào)控HCC 在生物過程上參與miRNA 對基因的沉默負調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后miRNA 對基因的沉默負調(diào)控、RNA 對基因的沉默負調(diào)控等；在細胞組分上富集到RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子復(fù)合物、吞噬作用相關(guān)受體、細胞膜受體等詞條；在分子功能上富集到與轉(zhuǎn)錄起始因子結(jié)合，激活核受體，與配體結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子活性等。KEGG 信號通路提示，八寶丹參與了癌癥中的蛋白聚糖、乙型肝炎、HIF-1 信號通路、化學(xué)致癌受體激活、EGFR 絡(luò)氨酸激酶抑制劑耐藥等通路。TCGA 數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，ESR1、PPARG 和COL18A1 高表達與HCC 患者總生存期密切相關(guān)。據(jù)報道，PPARG 高表達可激活WNT/CTNNB1 信號通路，從而維持腫瘤細胞干性特征，促進癌癥進展[18]。人類HCC 臨床樣本調(diào)查和組織染色也證實，ESR1 可通調(diào)控miR-141-3p /GSN 信號影響原發(fā)性HCC 進展[19]；肌成纖維細胞分泌的膠原α-1（ⅩⅤⅢ）鏈（COL18A1）可促進腫瘤轉(zhuǎn)移，加速HCC 進展[20]。因此TCGA 結(jié)果提示，八寶丹可能是通過調(diào)控ESR1、PPARG 和COL18A1 來延長原發(fā)性HCC 患者的生存期。

綜上所述，本研究證實了八寶丹對治療原發(fā)性HCC 的積極影響，并且發(fā)現(xiàn)9 種八寶丹的有效活性成分。還利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，分析揭示八寶丹可能是通過多靶點、多通路來調(diào)控原發(fā)HCC，并結(jié)合已有的研究進行分析驗證，提出新的視角與思路，為后續(xù)的實驗研究提供參考。