朱子凡，王智聰，謝彬，柳潤(rùn)輝,

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué), 福建 福州 350122；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系, 上海 200433）

2 型糖尿病（T2DM）是一種以高血糖為特征的慢性代謝性疾病，主要是由于胰島素分泌不足而導(dǎo)致的空腹血糖升高[1]。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。–HD，簡(jiǎn)稱冠心?。┦且环N常見的心血管疾病，主要是由于冠狀動(dòng)脈的粥樣性硬化引起的血管阻塞或管腔狹窄，從而導(dǎo)致心肌缺血或缺氧性壞死，進(jìn)而影響心臟功能[2]。近年來，T2DM 的患病人數(shù)不斷增加。據(jù)相關(guān)不完全統(tǒng)計(jì)，預(yù)計(jì)到2045 年，全球T2DM 患病人數(shù)將增加至7.83 億，已成為全球關(guān)注的重要人類問題之一[3]。目前，我國(guó)60 歲以上的老年人中T2DM 患病率超過20%，其中心血管疾病是最常見的并發(fā)癥，而CHD 則是T2DM 患者最常見的致殘或致死原因[4,5]。有研究表明，T2DM患者發(fā)生心血管疾病的概率是非T2DM 人群的2～4 倍，葡萄糖耐受量受損是影響CHD 進(jìn)展的重要因素[6]。由此可見，T2DM 與CHD 相互影響，相互促進(jìn)。

中藥復(fù)方制劑麝香保心丸源于宋代《太平惠民和劑局方》中治療“寒閉證”的經(jīng)典名方蘇合香丸，由戴瑞鴻教授在1972 年改良而來。麝香保心丸已在臨床應(yīng)用40 余年，方中麝香通竅溫陽、活血化瘀為君藥；蘇合香辟穢通竅、人參扶正益氣為臣藥；牛黃開竅醒神、肉桂助陽通脈、蟾酥開竅止痛為佐藥；冰片開竅醒神為使藥。全方寒溫并用、通補(bǔ)兼施、益氣強(qiáng)心，主要用于治療氣滯血瘀所致的胸痹，癥見心前區(qū)疼痛固定不移，心肌缺血所致的心絞痛、心肌梗死等[7-9]。目前臨床上將麝香保心丸與基礎(chǔ)西藥中的降糖藥聯(lián)合應(yīng)用，表現(xiàn)出比單用降糖藥更好的血糖調(diào)節(jié)效果[10]，還可以降低患者血清膽固醇水平[11]，顯著降低心血管事件發(fā)生率[12]。但目前關(guān)于麝香保心丸“異病同治”T2DM 和CHD 共同作用機(jī)制的研究相對(duì)不足。本研究旨在通過運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索麝香保心丸“異病同治”T2DM 和CHD 的共同作用機(jī)制，為今后的研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 麝香保心丸化學(xué)成分與作用靶點(diǎn)篩選

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）、中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)（TCMID）、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（ETCM）和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“人工麝香、人參提取物、人工牛黃、蘇合香、蟾酥、肉桂、冰片”為關(guān)鍵詞，檢索麝香保心丸的化學(xué)成分。將口服生物利用度（OB）≥20%、類藥性（DL）≥0.1，同時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道具有確切活性的化合物，以及本課題組前期研究鑒定的入血成分，均視為麝香保心丸的活性化合物。取BATMAN-TCM中score≥48、 TCMID 中 score≥400、 ETCM 中score≥0.8 的靶點(diǎn)，同時(shí)將僅有1 個(gè)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)去除，篩選得到麝香保心丸的潛在作用靶點(diǎn)，然后通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范靶點(diǎn)蛋白的基因名。

1.2 T2DM 和CHD 靶點(diǎn)收集

在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中以“type 2 diabetes mellitus”和“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞篩選出T2DM 和CHD 的相關(guān)靶點(diǎn)，為獲得與疾病相關(guān)度更高的靶點(diǎn)，將GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中score≤10 的靶點(diǎn)去除。

1.3 麝香保心丸治療T2DM 和CHD 交集靶點(diǎn)獲取

繪制麝香保心丸組方中篩選出的化合物靶點(diǎn)、T2DM 相關(guān)靶點(diǎn)和CHD 相關(guān)靶點(diǎn)的Venn 圖，取三者交集，得到麝香保心丸同時(shí)治療T2DM 和CHD 的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建麝香保心丸發(fā)揮“異病同治”作用的“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用“Network Analyzer”功能進(jìn)行分析，其中節(jié)點(diǎn)代表藥物、成分、靶點(diǎn)，邊代表藥物與成分、成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.5 蛋白-蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)分析

運(yùn)用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，導(dǎo)入“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)，物種限制為“人”，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，然后將STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，依據(jù)度值篩選出核心靶點(diǎn)。

1.6 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

運(yùn)用DAVID 在線數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，研究麝香保心丸治療T2DM 和CHD 可能靶點(diǎn)的潛在關(guān)鍵生物學(xué)過程和相關(guān)通路。

2 結(jié)果

2.1 麝香保心丸化學(xué)成分和潛在靶點(diǎn)

通過TCMSP、TCMID、ETCM 和BATMANTCM 數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索得到2 535 個(gè)化學(xué)成分，以O(shè)B≥20%、DL≥0.1，文獻(xiàn)報(bào)道具有確切活性的化合物，以及本課題組前期研究鑒定的入血成分，并以BATMAN-TCM 中 取score≥48；TCMID 中 取score≥400；ETCM 中取score≥0.8，同時(shí)將僅有1 個(gè)成分對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)去除為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出七味中藥的108 個(gè)活性成分，對(duì)應(yīng)451 個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 藥物與疾病交集靶點(diǎn)Venn 圖

在DisGeNET 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索篩選得到T2DM 相關(guān)靶點(diǎn)5 777 個(gè)，CHD 相關(guān)靶點(diǎn)3 433 個(gè)。利用Venn 圖將麝香保心丸預(yù)測(cè)篩選出的活性成分潛在靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)作交集，得到麝香保心丸作用于T2DM 和CHD 的潛在共同靶點(diǎn)229 個(gè)（圖1）。

圖1 麝香保心丸治療T2DM 和CHD 的靶點(diǎn)Venn 圖

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)中共有337 個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中藥物7 個(gè)、活性成分101 個(gè)、靶點(diǎn)229 個(gè)。其中綠色代表麝香保心丸組方中的7 味中藥，藍(lán)色代表活性成分，紅色代表作用于疾病的靶點(diǎn)。根據(jù)度值大小篩選貢獻(xiàn)較大的活性成分，其中鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、肉桂醛、膽汁酸、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rb1、肉桂酸等活性成分排名靠前，可能是麝香保心丸發(fā)揮治療T2DM 和CHD 作用的主要貢獻(xiàn)成分（圖2）。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將麝香保心丸229 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，并利用Cytoscape 3.8.2 軟件對(duì)PPI 圖進(jìn)行可視化分析（圖3）。根據(jù)度值由大到小對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行篩選，選取排名前10 的潛在核心靶點(diǎn)，分別是胰島素（INS）、白蛋白（ALB）、蛋白激酶B（Akt1）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（CREB1）、白細(xì)胞介素-1（IL-1β）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG），這些靶點(diǎn)可能是麝香保心丸治療T2DM 和CHD 的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 功能富集分析

將麝香保心丸229 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 功能富集分析，以P≤0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出生物過程（BP）724 條、細(xì)胞成分（CC）112 條、分子功能（MF）208 條，分別選取前10 條繪制氣泡圖（圖4）。BP 主要涉及對(duì)外源性刺激的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控等過程；CC 主要涉及質(zhì)膜、電壓門控鈣通道復(fù)合物、神經(jīng)元細(xì)胞體等過程；MF 主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇結(jié)合、氧化還原酶活性等過程。

圖4 GO 功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析

通過KEGG 通路富集分析229 個(gè)交集靶點(diǎn)，以P≤0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到麝香保心丸治療T2DM 和CHD 的188 條信號(hào)通路，選取排名前20 的繪制氣泡圖（圖5）。cAMP 信號(hào)通路、cGMPPKG 信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、鈣信號(hào)傳導(dǎo)通路等可能在麝香保心丸治療T2DM 和CHD 中發(fā)揮重要作用。

圖5 KEGG 通路富集分析

3 討論

中醫(yī)將以多飲、多食、多尿、身體消瘦為主要特征的T2DM 歸結(jié)為“消渴癥”范疇，以氣陰兩虛和陰虛內(nèi)熱為主要病機(jī)[13]。CHD 以氣虛血瘀為主要病機(jī)，虛證多以陽虛、氣虛、氣陰兩虛為主，實(shí)證多以氣滯血瘀、痰凝寒濁為主[14]。中藥復(fù)方制劑麝香保心丸作為中醫(yī)經(jīng)典名方“蘇合香丸”的發(fā)展延續(xù)，是我國(guó)目前最常用的芳香溫通類藥物，為益氣活血?jiǎng)?，臨床上廣泛應(yīng)用于治療心血管疾病[15]。由于T2DM 與CHD 均有“氣陰兩虛”表型，故現(xiàn)臨床上將麝香保心丸用于治療T2DM 比單用西藥進(jìn)行基礎(chǔ)治療表現(xiàn)出更好的控制血糖、促進(jìn)心功能恢復(fù)、改善糖尿病患者微循環(huán)障礙、降低血液粘度等作用[15,16]。雖然麝香保心丸在治療T2DM 和CHD方面具有良好的臨床療效，但其“異病同治”的作用機(jī)制尚不明確。本研究主要運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討麝香保心丸“異病同治”T2DM 和CHD 的潛在作用機(jī)制。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法共篩選得到麝香保心丸的101 個(gè)活性成分和“異病同治”T2DM和CHD 的共同靶點(diǎn)229 個(gè)。其中人參總皂苷提取物是麝香保心丸的臣藥，文獻(xiàn)報(bào)道其具有抑制IL-1β等炎性因子的表達(dá)[17]，調(diào)節(jié)線粒體能量代謝和糖脂代謝，改善胰島素抵抗、抑制心肌細(xì)胞凋亡[18]的作用，人參皂苷Rg1、Rb1 可通過抑制IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)，減輕肝臟損傷和胰島素抵抗[19]，緩解心肌損傷[20]。已有研究表明，肉桂提取物可以減少氧化應(yīng)激，保護(hù)胰島β 細(xì)胞，增加胰島素分泌[21]，改善血脂異常[22]，減輕糖尿病心肌并發(fā)癥癥狀。肉桂中的有效成分肉桂醛[23]可通過自噬途徑減輕缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的H9C2 心肌細(xì)胞的損傷，抑制自噬水平，增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力。肉桂酸[24]則能通過激活PI3K/Akt/FoxO1 信號(hào)通路，降低db/db小鼠空腹血糖水平、調(diào)節(jié)血脂、改善胰島素抵抗。牛黃中的有效成分熊去氧膽酸可增加肝臟能量消耗、改善線粒體功能和膽汁酸代謝，減少甘油三酯（TG）和FFA，改善糖脂代謝[25]。由此可見，麝香保心丸治療T2DM 和CHD 可能是其多個(gè)活性成分共同發(fā)揮作用的結(jié)果。

繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)度值分析得到排名前10 的 核 心 靶 點(diǎn)，INS、ALB、Akt1、IL-6、TNF、CREB1、IL-1β、MAPK3、PPAGR、ACTB 是麝香保心丸“異病同治”T2DM 和CHD 的潛在核心靶點(diǎn)。研究表明，促炎細(xì)胞因子和炎癥相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子與胰島素分泌受損有關(guān)，可能會(huì)誘導(dǎo)T2DM 的發(fā)生[26]，例如，IL-6 被認(rèn)為可能與胰島素抵抗和β 細(xì)胞功能障礙有關(guān)[27]。此外，有研究表明，在血管生物學(xué)中，IL-6 還可能與動(dòng)脈粥樣硬化形成相關(guān)的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌有關(guān)[28]。因此，抑制IL-6 炎癥因子的激活能有效改善胰島素抵抗，緩解動(dòng)脈粥樣硬化。有研究表明，PPARG（即PPARγ）是一種過氧化物酶體增殖受體，是配體激活受體，參與能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，其在脂肪組織、脾臟和大腸中的表達(dá)最高，主要表現(xiàn)為調(diào)節(jié)脂肪生成、脂質(zhì)和葡萄糖代謝以及炎癥途徑，因此，激活PPARG 受體不僅可以改善胰島素敏感性，還可以調(diào)節(jié)血管生成[29]。ACTB是一種β-肌動(dòng)蛋白，是重要的細(xì)胞骨架蛋白，可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮NO 合酶活性改變NO 產(chǎn)生，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，這被認(rèn)為可能是導(dǎo)致CHD 的潛在作用機(jī)制[30]。同時(shí)有研究表明，ACTB 是與T2DM風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的一種可靠的基因蛋白[31]。由此可見，麝香保心丸通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮“異病同治”T2DM 和CHD 的治療作用。

GO 生物功能分析發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸“異病同治”T2DM 和CHD 的潛在調(diào)控生物過程，主要涉及炎癥反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、受體結(jié)合、電壓門控鈣通道復(fù)合物等生物過程。KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸治療T2DM 和CHD 的通路主要富集在脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路等信號(hào)通路。晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）是游離還原性糖和蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸之間非酶促糖化反應(yīng)的結(jié)果，主要發(fā)生于持續(xù)高血糖狀態(tài)的患者體內(nèi)，屬于有害分子，AGEs 會(huì)與其晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）發(fā)生非特異性作用[32]，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)，從而干擾細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，導(dǎo)致胰島素抵抗[33]。有研究表明，AGE 水平升高與動(dòng)脈壁硬度增加、冠狀動(dòng)脈疾病等心血管風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，與T2DM 患者冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度和心血管事件的發(fā)生有關(guān)，這主要是因?yàn)锳GE 誘導(dǎo)的血管和心肌蛋白交聯(lián)會(huì)降低血管彈性和心肌靈活性，導(dǎo)致血管壁柔韌性降低，血管和心肌僵硬以及影響細(xì)胞內(nèi)皮功能，最終導(dǎo)致CHD[34]。Toll 樣受體（TLRs）屬于炎癥小體，主要有2 個(gè)亞型：①在其外域中具有多個(gè)半胱氨酸簇的TLR（mccTLRs）；②在其外域中具有單個(gè)半胱氨酸簇的TLR（sccTLRs）[35]。動(dòng)脈粥樣硬化主要是由慢性炎癥引起的血管壁結(jié)構(gòu)和功能異常，TLR 信號(hào)通路的激活參與動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥過程，其中TLR2 和TLR4 在動(dòng)脈硬化過程中上調(diào)使CHD 進(jìn)一步加劇[36]。胰島素抵抗是T2DM 的主要癥狀之一，起因之一是肥胖，脂肪組織分泌各種激素和細(xì)胞因子，在代謝應(yīng)激的作用下，TLR4 信號(hào)傳導(dǎo)的激活會(huì)引起免疫細(xì)胞釋放促炎因子，使脂肪組織中的巨噬細(xì)胞聚集極化為M1 和M2 亞型，導(dǎo)致慢性低度炎癥，干擾代謝組織中的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而發(fā)展成T2DM[37]。cAMP 是一種單磷酸腺苷，由腺嘌呤、核糖以及磷酸基團(tuán)組成，是細(xì)胞內(nèi)的第二信使分子。cAMP 信號(hào)通路主要包括cAMP 合成環(huán)化酶、降解磷酸二酯酶（PDE）和cAMP 效應(yīng)，主要來源是細(xì)胞質(zhì)膜上的跨膜腺苷酸環(huán)化酶（tmACs）和細(xì)胞內(nèi)的可溶性腺苷酸環(huán)化酶（sAC），負(fù)責(zé)激素誘導(dǎo)的肝糖原分解[38]，可刺激胰島素分泌，是胰島素依賴性cAMP 信號(hào)通路[39]。蛋白激酶A（PKA）是主要的cAMP 效應(yīng)靶標(biāo)，cAMP 水平升高和PKA 激活可調(diào)節(jié)內(nèi)皮屏障穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)血管舒張[40]。上述分析結(jié)果表明，麝香保心丸發(fā)揮治療T2DM 和CHD 的作用是方中的多種化學(xué)成分作用于多個(gè)信號(hào)通路的結(jié)果，主要涉及氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

4 結(jié)論

“異病同治”治療思想是中醫(yī)對(duì)《黃帝內(nèi)經(jīng)》“同病異治”傳統(tǒng)理論的繼承與發(fā)展，目前臨床應(yīng)用廣泛，但相關(guān)作用機(jī)制尚不明確[41]。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸“異病同治”T2DM 和CHD 的靶點(diǎn)和信號(hào)通路主要涉及炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，與目前關(guān)于T2DM 和CHD 的相關(guān)作用機(jī)制研究相符，證實(shí)麝香保心丸通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮治療T2DM 和CHD 的共同作用。研究結(jié)果為麝香保心丸的臨床應(yīng)用及進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究提供了理論依據(jù)。