徐 飛，陳瑾，李志勇

（1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥理教研室, 上海200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科, 上海200082）

METRNL（Metrn-like）蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)和證實的新的分泌蛋白[1-2]，其與METRN 構(gòu)成了一個兩蛋白的新蛋白家族。雖然最初的研究表明，該家族蛋白均可促進神經(jīng)細胞軸突的生長[2-4]，但兩者表達差異很大，METRN 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高特異性表達，而METRNL 則在全身較為廣泛地表達，提示其可能具有更廣泛的生理功能[1-2,5-6]。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，METRNL 對代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。其在脂肪組織中表達較高，特別是皮下脂肪，被認為是一種新的脂肪因子[1]。研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白可以調(diào)節(jié)脂肪細胞的分化，脂肪細胞中METRNL 過表達可提高全身胰島素敏感性，減少脂肪炎癥擴大脂肪細胞的體積等[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)，METRNL 可以在運動后由肌肉組織增加分泌，促進脂肪組織棕色化，從而提高代謝率，減輕體重和改善胰島素敏感性[8]。這些研究提示，METRNL可能與提高胰島素敏感性相關(guān)。

噻唑烷二酮類藥物，如羅格列酮，可以通過激動PPARγ 受體，提高胰島素增敏性，被稱為胰島素增敏劑。但是這類藥物與METRNL 蛋白之間的關(guān)系，至今尚不清楚。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，白色脂肪組織中METRNL 過表達可以提高PPARγ 的表達，促進脂肪重構(gòu)，降低白色脂肪炎癥，但是激動PPARγ 對METRNL 表達的影響尚未有報道。

本研究擬通過高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠模型，檢測血液METRNL 的濃度變化；通過給予胰島素增敏劑羅格列酮治療，構(gòu)建胰島素增敏動物模型，檢測血液中METRNL 的水平變化，從而明確激動PPARγ 對血液METRNL 水平影響，通過實時定量PCR 檢測不同組織中METRNL 的表達，明確PPARγ 通過何種組織調(diào)控METRNL 的表達與血液濃度。

1 材料和方法

1.1 動物處理

12 周齡的雄性C57BL/6 小鼠與小鼠飼料，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司。為檢測胰島素抵抗對METRNL 表達的影響，分兩組小鼠，每組8 只，分別給予正常飲食（NCD）和HFD，均飼養(yǎng)4 個月；為了檢測胰島素增敏對于METRNL 表達的影響，分兩組小鼠，每組8 只，兩組均先HFD 飼養(yǎng)3 個月，而后實驗組的飼料中加入藥物羅格列酮（胰島素增敏組），劑量為10 mg/kg·d，治療1 個月，對照組繼續(xù)HFD 飼養(yǎng)1 個月。

1.2 糖耐量實驗

小鼠禁食18 h，腹腔注射30%葡萄糖溶液（2 g/kg），分別在0、30、60、90、120 min 取尾靜脈血，采用強生血糖儀（OneTouch Ultra）檢測小鼠血糖水平。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

戊巴比妥鈉麻醉小鼠后（80 mg/kg），心臟取血收集血液，室溫靜置2 h，3 000 r/min 離心20 min，取上清液。采用小鼠METRNL ELISA 試劑盒（購自美國R&D biosystem 公司）檢測血清中METRNL濃度。操作步驟參照試劑盒說明書。

1.4 熒光實時定量PCR 實驗

取小鼠附睪周圍白色脂肪、肩胛骨間棕色脂肪、肝臟、腓腸肌、腦組織、腎臟、脾臟組織，采用TRIzol 試劑（購自美國Invitrogen 公司），按照說明書抽提組織總RNA，用RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自中國TARARA 公司）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。1 μg 的cDNA 用于檢測METRNL 的表達，GAPDH 作為內(nèi)參。采 用2-ΔΔCt法 與SYBR? Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）試劑，反應(yīng)條件為，95 ℃，5 min, 1 個循環(huán)；95 ℃, 15 s，60 ℃，30 s，72 ℃，30 s，40 個循環(huán)。相關(guān)引物序列見表1。

表1 相關(guān)引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胰島素增敏劑羅格列酮治療改善了高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗

對HFD 3 個月的小鼠采用羅格列酮治療1 個月后，葡萄糖耐量實驗檢測其糖耐量情況如圖1 所示，羅格列酮治療組給予葡萄糖后30、60、90、120 min 的血糖濃度均明顯低于單純HFD 組（P＜0.01），說明羅格列酮治療明顯改善了小鼠的糖耐量，提高了機體胰島素敏感性。

圖1 羅格列酮對全身葡萄糖耐量的影響

2.2 胰島素增敏劑羅格列酮治療升高了胰島素抵抗小鼠血液中METRNL 的水平

取正常對照組、HFD 組、HFD 羅格列酮治療組小鼠的血清，ELISA 檢測METRNL 的水平，結(jié)果如圖2 所示，羅格列酮組血清中METRNL 的濃度為（6 632±358） pg/ml，是單純HFD 組（4 271±310） pg/ml 的1.6 倍（P＜0.05）。

圖2 羅格列酮對血清METRNL 水平的影響

2.3 胰島素增敏劑羅格列酮治療增加棕色脂肪組織和腎臟METRNL 的表達

實時熒光定量PCR 檢測肌肉、肝臟、白色脂肪、棕色脂肪、腦、脾臟、腎臟等組織中METRNL的表達，結(jié)果如圖3 所示，與單純HFD 組相比，羅格列酮治療組棕色脂肪組織METRNL 表達升高1.6 倍，腎臟組織METRNL 表達升高1.3 倍。

圖3 羅格列酮對各組織METRNL 表達影響

2.4 羅格列酮治療促進了棕色脂肪代謝與棕色脂肪標記蛋白的表達

實時熒光定量PCR 檢測棕色脂肪組織代謝與棕色脂肪標記蛋白等mRNA 表達情況，結(jié)果如圖4所示，與單純HFD 組相比，羅格列酮治療組ERRα、UCP-1、clec10a、Mrc-1、Lipe、LPL、FABP4、CD36、PNPLA2 等因子表達顯著升高。

圖4 羅格列酮治療促進了棕色脂肪中代謝與棕色脂肪標記蛋白的表達

3 討論

本研究通過HFD 誘導(dǎo)胰島素抵抗的肥胖小鼠，發(fā)現(xiàn)HFD 可以導(dǎo)致METRNL 血液水平升高。對肥胖小鼠不同組織METRNL 表達的檢測顯示，脂肪組織METRNL 表達顯著升高。HFD 誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠，給予胰島素增敏劑羅格列酮治療后，小鼠糖耐量改善，同時，血清METRNL 的濃度也升高。這些結(jié)果說明，METRNL 并非胰島素敏感性的特異性指標，脂肪可能是使血液METRNL水平改變的主要組織之一。

Li 等研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠的脂肪組織METRNL表達增加[7]。本研究也表明，METRNL 的血液濃度在高脂誘導(dǎo)肥胖后升高。L?ffler 等研究發(fā)現(xiàn)，METRNL 與脂肪細胞的肥大相關(guān)，而脂肪細胞肥大被認為與PPARγ 活性的降低相關(guān)，是胰島素抵抗的重要標志之一，進而認為METRNL 是機體胰島素抵抗的標志[9]。然而，在本研究中，胰島素增敏劑羅格列酮治療后小鼠胰島素敏感性提高，同時METRNL 表達也顯著升高，可見METRNL 血液濃度的升高并不能代表胰島素抵抗的增加。

羅格列酮可以顯著提高胰島素的敏感性，故也稱為胰島素增敏劑。本研究表明，其可以顯著提高METRNL 的表達，而METRNL 又具有促進白色脂肪棕色化和提高胰島素敏感性的作用，所以METRNL 可能參與介導(dǎo)了羅格列酮的胰島素增敏作用。

我們前期的研究表明，增加白色脂肪表達可以提高血液中METRNL 的水平。本研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮未促進高脂條件下白色脂肪METRNL 的表達，在檢測的7 種組織中，羅格列酮顯著提高了棕色脂肪和腎臟METRNL 的表達，但是對脾臟、肝臟、肌肉、白色脂肪、腦組織METRNL 的表達沒有影響，說明羅格列酮可能主要通過棕色脂肪和腎臟提高血液METRNL 濃度。此外，進一步實驗發(fā)現(xiàn)，羅格列酮促進了棕色脂肪中代謝和棕色脂肪標記蛋白的表達，這與以往的研究結(jié)果一致[10]，既往研究表明，METRNL 可促進白色脂肪棕色化，提示羅格列酮促進棕色脂肪代謝的作用可能有METRNL蛋白參與。

本研究發(fā)現(xiàn)了胰島素增敏劑羅格利酮治療可能通過提高棕色脂肪和腎組織的METRNL 表達來升高血清METRNL 水平，提示METRNL 可能參與了羅格列酮對糖尿病的治療過程。