韓 蕾，仲 華，王欣榮，王 彥, （.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 福建 福州 350；.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系, 上海 00433；3.真菌感染性疾病教育部醫(yī)藥基礎(chǔ)研究創(chuàng)新中心, 上海 00433）

近年來，侵襲性真菌感染（IFD）的發(fā)病率和病死率逐年增高，臨床上常見的侵襲性真菌主要有以念珠菌為主的酵母樣真菌和以曲霉為主的絲狀真菌。而念珠菌引起的IFD 的總發(fā)病率達(dá)0.03%～0.50%，病死率可達(dá)35%～80%[1]，白念珠菌（Candida albicans）是侵襲性真菌感染中最常見的致病真菌，約占40.1%[2]。盡管目前已研發(fā)出有效的抗真菌藥物可供臨床治療，但仍存在著耐藥性、價格昂貴、毒性大等問題亟需解決[3]。隨著抗真菌藥物經(jīng)年累月使用，耐藥性問題越發(fā)突出。唑類藥物是臨床常用的抗真菌藥物，療效好、毒性低，但因應(yīng)用歷史較長，臨床上對其耐藥的真菌越來越多[4]。目前，臨床可選擇的藥物數(shù)量有限，解決真菌對藥物的耐藥性問題便成為一個必須攻克的難關(guān)。聯(lián)合用藥是一種有效的克服藥物耐藥性的方法，兩者的協(xié)同作用不僅可以克服藥物的耐藥性，還可以增強(qiáng)原有藥物的抗真菌作用[4]。

去甲澤拉木醛（DMZ）是從雷公藤根皮中提取的三萜類單體化合物，是雷公藤中含量較高的單體成分，其分子式是C29H36O6（圖1）。DMZ 具有抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗生育、雌激素代謝調(diào)節(jié)等藥理活性[5]，但其在抗真菌方面的研究尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，DMZ 具有良好的廣譜抗真菌活性，并且與氟康唑聯(lián)合使用具有協(xié)同抗耐藥真菌作用。

圖1 DMZ 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 實驗材料

1.1 實驗菌株及細(xì)胞

白念珠菌實驗株SC5314 來自美國Georgetown大學(xué)。白念珠菌（C.albicans）臨床株103、7 879、9 161、10 066、9 296、10 060、10 061、7 654、901、904、632，耳念珠菌（Candida auris）0029，克柔念珠菌（Candida krusei）62 588、4 996、10 153，熱帶念珠菌（Candida tropicalis） 8 915、 409， 煙 曲 霉（Aspergillus fumigatus） 7 544， 近 平 滑 念 珠 菌（Candida parapsilosis）22 019、90 018，須毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes）T5a、T5b 由海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH/3T3）來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1.2 實驗試劑

DMZ 購自陶術(shù)生物有限公司；氟康唑（FLC）購自Macklin 公司；二甲基亞砜（DMSO）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基及其配制

YPD 培養(yǎng)液：酵母浸膏10.0 g，蛋白胨20.0 g。D-葡萄糖20.0 g，加超純水800 ml 溶解，再以超純水定容至1 000 ml，經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121°C，15 min），自然冷卻至室溫后于4°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

PBS 緩沖溶液：NaCl 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 3.57 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.24 g，用三蒸水溶解并定容至1 000 ml，高溫高壓滅菌（121°C，15 min）后室溫保存。

RPMI 1 640 培養(yǎng)基：RPMI 1 640（Gibco BRL）10.0 g，NaHCO32.0 g，3-嗎啉丙磺酸（MOPS）34.5 g，NaOH 2.7 g，以超純水定容至1 000 ml，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜抽濾滅菌后于4°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

含藥SDA 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，D-葡萄糖40 g，瓊脂20 g，加超純水800 ml 溶解，調(diào)整PH 為7.0，以超純水定容至1 000 ml，高壓蒸汽滅菌（121 ℃，15 min）。待冷卻至50～55 ℃，將適當(dāng)藥物溶液加入液體狀態(tài)的SDA 培養(yǎng)液中，混合均勻，分倒入9 mm細(xì)菌培養(yǎng)皿中，自然冷卻凝固后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DMEM 完全培養(yǎng)基：45 ml DMEM 高糖培養(yǎng)基中加入5 ml 小牛血清，充分混勻后置于4 ℃保存。

1.4 儀器

生物安全柜（BSC-1004II A2，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；生物顯微鏡（LW100T，北京測維光電技術(shù)有限公司）；霉菌培養(yǎng)箱（MJ-150-I，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan FC，賽默飛世爾上海儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 待測菌株的活化及菌懸液的配制

于-80°C 低溫保存箱中取出凍存的待測菌株，吸取10 μl 菌液加入裝有1 ml YPD 培養(yǎng)液的15 ml玻璃搖菌管中，置于30°C 氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，200 r/min 振蕩培養(yǎng)。24 h 后從YPD 菌懸液中吸取10 μl 加入到新的1 ml YPD 培養(yǎng)液中，繼續(xù)30°C振蕩培養(yǎng)16 h，活化完成，此時的真菌即處于指數(shù)生長末期。

取處于指數(shù)生長末期的待測菌株置于1.5 ml離心管中，離心（3 000 r/min，1 min），吸棄上清液，用1 ml PBS 緩沖溶液洗滌菌株，離心（3 000 r/min，1 min），吸棄上清液，重復(fù)洗滌3 次。取10 μl 真菌原液稀釋100 倍后，使用血細(xì)胞計數(shù)板于生物顯微鏡下計數(shù)，計算出真菌原液的菌濃度，然后用RPMI 1 640 培養(yǎng)液稀釋配制成實驗所需濃度的菌懸液。

2.2 微量液基稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC）

根據(jù)CLSI 出版的微量液基稀釋法實驗手冊M27-A3 所推薦的標(biāo)準(zhǔn)實驗方法來測定[6]。取處于指數(shù)生長末期的待測菌株，用RPMI 1 640 培養(yǎng)基稀釋配置成1×103CFU/ml 的菌懸液。取96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于第1 列加入100 μl RPMI 1 640 培養(yǎng)基作為空白對照；第2 列加入200 μl 菌液，3～12 列加入100 μl 菌液，于第2 列每孔分別加入6.4 μl 藥液，依次2 倍倍比稀釋至11 列，最高藥物濃度為64 g/L，12 號孔菌液作為生長對照。96 孔板置于30°C 恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)（白念珠菌24 h，煙曲霉48 h），之后用酶標(biāo)儀測定630 nm 處A值。與生長對照孔比較，抑制80%以上真菌生長對應(yīng)的最低藥物濃度即為MIC80。實驗至少重復(fù)3 次，取較為穩(wěn)定的結(jié)果作為最終的測定結(jié)果。

2.3 棋盤式微量液基稀釋法考察兩藥合用的協(xié)同效果

取處于指數(shù)生長末期的待測菌株，用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋配置成1×103CFU/ml 的菌懸液。將配制好的菌懸液渦旋均勻后，轉(zhuǎn)移至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，第1 孔加入2.6 ml，第2～6 孔每孔加入1.3 ml。取83.2 μl 待測化合物溶液加入第1 孔中使其終濃度為64 g/L，依次進(jìn)行倍半稀釋，使得第1～6 孔中的化合物終濃度分別為64、32、16、8、4、2 g/L。將在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中配制好的含藥菌懸液按化合物濃度從高到低（64→2 g/L）依次對應(yīng)轉(zhuǎn)移至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的A～F 行中，第1 列每孔加入200 μl，第2～10 列每孔加入100 μl。第11 列的A11～F11 孔和第G 行的G1～G10 孔中加入未加藥的空白菌懸液100 μl/孔。將配制好的FLC 溶液分別加入第1 列的A1～G1 孔中，每孔加入6.4 μl使其終濃度為64 g/L。各列從左到右依次進(jìn)行倍半稀釋，使得第1～9 列的FLC 終濃度分別為64→0.25 g/L。96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板第11 列的A11～F11孔中為未加任何藥物作用的菌懸液，作為陰性對照組。第12 列和H 行各孔中分別加入100 μl 的RPMI 1640 培養(yǎng)液，作為空白對照組。將96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于30°C 恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，48 h后使用酶標(biāo)儀測定每孔真菌在630 nm 處的光密度值A(chǔ)630。以陰性對照組的A630值為100%，利用公式計算協(xié)同指數(shù)FICI。FICI 的計算公式為：FICI=MIC80化合物（聯(lián)用）/MIC80化合物（單用）+MIC80FLC（聯(lián)用）/MIC80FLC（單用）

2.4 紙片擴(kuò)散實驗

取己洗滌的待測真菌，用PBS 緩沖溶液稀釋配制成實驗所需濃度（1x106CFU/ml）的菌懸液，吸取100 μl 均勻涂布于含藥的SDA 培養(yǎng)基中（考察協(xié)同作用時培養(yǎng)基中應(yīng)加入適宜濃度的DMZ）。在培養(yǎng)基中等距放置7 枚滅菌紙片，向紙片中滴加藥液，使紙片載藥量分別為0、2、4、8、16、32 μg（載藥量視實驗情況而定），置于30°C 恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，觀察真菌生長情況并拍照記錄[7]。

2.5 CCK-8 法考察藥物的細(xì)胞毒性

取小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH/3T3），胰酶消化后，離心收集細(xì)胞并用DMEM 完全培養(yǎng)基重懸。血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至5x104個/ml。取96 孔板劃分出實驗區(qū)、對照區(qū)、無細(xì)胞區(qū)。實驗區(qū)、對照區(qū)每孔加入100 μl 細(xì)胞液，無細(xì)胞區(qū)加100 μl DMEM 完全培養(yǎng)基，注意盡量使孔內(nèi)細(xì)胞分布均勻。細(xì)胞于37°C 培養(yǎng)箱中貼壁過夜。第2 天，取無菌EP 管，用DMEM 完全培養(yǎng)基對待測藥物進(jìn)行倍比稀釋，隨后取出96 孔板，吸棄培養(yǎng)基。每孔加100 μl 含不同濃度藥物的DMEM 完全培養(yǎng)基，37°C 繼續(xù)孵育24 h。取出96 孔板，吸棄培養(yǎng)基，每孔加110 μl 含CCK-8 的DMEM 完全培養(yǎng)基（CCK-8∶DMEM 完全培養(yǎng)基=1∶10），37°C孵育2 h。測量各孔的A450。處理結(jié)果時用實驗區(qū)、對照區(qū)A值減去無細(xì)胞區(qū)的A值，以對照區(qū)細(xì)胞活力為1.0，計算各組細(xì)胞活力。重復(fù)3 次實驗，用GraphPad 作圖并統(tǒng)計分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 DMZ 的抗菌譜

測定DMZ 對臨床中常見的病原真菌的抗菌活性，共計23 株。實驗結(jié)果顯示，DMZ 對所試真菌都有一定的抑制效果（表1）。對白念珠菌（含11 株臨床株）的MIC 范圍為4～16 g/L，值得注意的是，其中有3 株臨床菌對FLC 顯示出較強(qiáng)的耐藥性（901、904、632），DMZ 對它們的MIC 穩(wěn)定在8 g/L，表現(xiàn)出與敏感菌類似的抗菌活性。對FLC 天然耐藥的耳念珠菌與克柔念珠菌，DMZ 也表現(xiàn)出較好的抗真菌活性，MIC 分別為32 g/L、2～8 g/L。對其他的念珠菌如熱帶念珠菌、近平滑念珠菌也有較強(qiáng)的抗菌活性，MIC 為4～16 g/L，對絲狀菌如煙曲霉菌、須毛癬菌有較好的抗菌活性，MIC 分別為32 g/L 和2 g/L。以上結(jié)果表明，DMZ 對常見的病原真菌均表現(xiàn)出較好的抗菌活性，抗菌譜較廣。

表1 DMZ 與FLC 單獨應(yīng)用于23 株真菌的MIC 值

3.2 DMZ 與FLC 協(xié)同抗耐藥白念珠菌作用

選取3 株對FLC 耐藥的白念珠菌901、904和632，采用棋盤微量液基稀釋法考察DMZ 與FLC 聯(lián)合使用是否存在協(xié)同作用。結(jié)果顯示，在與2 g/L DMZ 聯(lián)合使用的情況下，F(xiàn)LC 對上述3 株耐藥菌的有效濃度從64 g/L 降低至0.25 g/L（表2），是原抗菌濃度的1/256，兩藥聯(lián)合使用的FICI 為0.129～0.254，表明DMZ 與FLC 具有較強(qiáng)的協(xié)同抗耐藥菌作用。

表2 DMZ 與FLC 的協(xié)同抗氟康唑耐藥白念珠菌的作用

應(yīng)用瓊脂平板擴(kuò)散實驗更直觀地驗證了DMZ與FLC 的協(xié)同抗真菌作用。結(jié)果顯示，在單用DMZ的情況下，不同濃度的DMZ 均產(chǎn)生了明顯的抑菌圈，但抑菌圈直徑的大小并沒有顯示出劑量依賴性；單用FLC 能產(chǎn)生較大的抑菌圈，但抑菌作用較弱，抑菌圈內(nèi)部仍有少量真菌菌落生長（圖2A）。進(jìn)一步用抑菌圈實驗驗證兩藥聯(lián)用對耐藥菌的抗真菌效果。結(jié)果顯示，在含有一定濃度DMZ 的瓊脂中，真菌長得稀薄，DMZ 的濃度越高，真菌長得越稀薄，表現(xiàn)出劑量依賴性。在含有不同濃度FLC的紙片周圍都出現(xiàn)了直徑較大的抑菌圈（圖2B），抑菌圈的大小與FLC 的含量呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。上述實驗結(jié)果表明，DMZ 與FLC 聯(lián)合使用具有協(xié)同抗耐藥菌的作用。

圖2 單用DMZ 對白念珠菌SC5314 的抑菌作用以及DMZ 與FLC 聯(lián)用對耐藥菌904 的抑菌作用

3.3 DMZ 的細(xì)胞毒性

利用CCK-8 法考察DMZ 對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的毒性。CCK-8 試劑中含有WST-8，在電子載體的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此，可利用這一特性考察DMZ 對哺乳動物細(xì)胞的毒性。結(jié)果顯示，當(dāng)DMZ濃度為32 g/L 時，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的存活率下降到54%，顯示出一定毒性，而低于32 g/L 時DMZ 的毒性較低，沒有表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒作用（圖3）。實驗結(jié)果通過單因素方差分析（ANOVA），然后進(jìn)行事后Dunnett-t檢驗，標(biāo)準(zhǔn)偏差基于3 次獨立實驗。

圖3 DMZ 對小鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性*P＜0.05，***P＜0.001，與對照組比較。

4 討論

中藥作為我國傳統(tǒng)藥物，在抗真菌病方面有極佳的待研發(fā)前景，從中草藥中提取出療效佳、毒副作用小、不易耐藥、價格低廉的新型抗真菌藥物已成為目前的研究熱點[8]。DMZ 是從雷公藤樹皮中分離提取的酚性去甲基三萜化合物，是雷公藤中含量較高的單體，是一種結(jié)構(gòu)明確、易分離的天然產(chǎn)物[9]。本研究考察了DMZ 的抗真菌作用和協(xié)同F(xiàn)LC 抗真菌的作用。

IFD 每年的發(fā)病率為每6 萬人中約有100 例[10]。侵襲性念珠菌感染（IC）在IFD 中占主要地位，約有80%的IFD 是IC 引起的[11]。其中，白念珠菌是導(dǎo)致IC 的最主要的念珠菌種類[12]，但近年來，其他念珠菌的占比在逐漸升高[13]。DMZ 的抗菌譜很廣，對常見的念珠菌如白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌等均有較好的抗菌活性，MIC 在2～16 g/L，對其他IFD 中常見的病原菌如煙曲霉菌也有很好的抗菌活性。耳念珠菌是近年來新興的一種念珠菌，因其多重耐藥性而受到關(guān)注，又被稱為“超級真菌”，不到10 年的時間里已在全球范圍內(nèi)傳播，且發(fā)病率、病死率高[14]。有研究表明[15]，耳念珠菌中有高達(dá)90%的分離株對氟康唑產(chǎn)生耐藥。DMZ 對耳念珠菌也有一定的抗菌活性（MIC 值為32 g/L），為研發(fā)抗耳念珠菌的藥物提供了新的選擇。

FLC 是一種典型的唑類抗真菌藥物，已在臨床上使用近30 年。鑒于FLC 的抗真菌作用強(qiáng)且安全性高，長期以來都是一線抗真菌藥物。然而，唑類藥物的廣泛使用導(dǎo)致了真菌對其有嚴(yán)重的耐藥性，從而降低了治療效果。其耐藥機(jī)制主要包括：藥物靶點的突變、甾醇生物合成途徑的變化以及轉(zhuǎn)錄因子的功能突變導(dǎo)致麥角甾醇生物合成基因和多藥外排泵的組成性上調(diào)等[16]。DMZ 對氟康唑耐藥的念珠菌有類似于敏感菌的抗菌活性，這表明DMZ 的抗菌作用機(jī)制可能與FLC 不同，有潛力用于抗耐藥真菌。已有研究報道，DMZ 通過激活外源性細(xì)胞凋亡在體外抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞生長，并降低了癌細(xì)胞中的線粒體膜電位[17]，這將為DMZ 的抗真菌機(jī)制提供研究方向。

藥物聯(lián)合使用是應(yīng)對耐藥菌的一種常用策略。DMZ 與FLC 具有較強(qiáng)的協(xié)同抗菌效果，能有效抑制耐藥菌的生長。兩藥聯(lián)用可以將FLC 的有效濃度降低數(shù)百倍，DMZ 的療效也增加數(shù)倍。細(xì)胞毒性實驗結(jié)果表明，DMZ 在抗真菌作用濃度范圍時（特別是與FLC 聯(lián)合使用時），毒性相對較低。兩藥聯(lián)合使用時，DMZ 起效濃度僅有細(xì)胞毒濃度的幾十分之一。在增加藥物療效的同時，降低了藥物用量，從而減少了毒副作用。另外，DMZ 與FLC 作為兩種不同作用機(jī)制的抗真菌藥物聯(lián)合使用，還能起到預(yù)防真菌耐藥的作用?？傊?，DMZ 作為一種廣譜、高效的抗真菌天然產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的與FLC 協(xié)同抗真菌能力，有潛力成為抗真菌候選先導(dǎo)化合物。同時，還有潛力成為一種增效劑，與FLC 聯(lián)合使用應(yīng)對耐藥真菌。