董舒超 張靜雯 凌嘉怡 洪駿 謝紫欣 張勝軍 宋劉霞 王銀磊 趙統(tǒng)敏 趙麗萍

摘要：果實光澤度是評價番茄外觀品質的重要指標之一。為挖掘高果實光澤度的番茄種質資源和調控番茄果實光澤度的關鍵基因，利用微孔光澤度儀NHG60M，于2023年春季對201份大果番茄、88份櫻桃番茄和8份醋栗番茄種質的第2穗成熟果實表面光澤度進行快速無損測定，并進行統(tǒng)計分析和全基因組關聯(lián)分析（Genome-Wide Association Studies，GWAS）。鑒定出果實光澤度在1.13～2.30之間的低光澤種質TS-21、TS-413、TS-270、TS-594、TS-604、TS-256、TS-258、TS-272、TS-643和TS-195，以及果實光澤度在11.90～18.70之間的高光澤種質 TS-203、TS-653、TS-543、TS-588、TS-592、TS-587、TS-539、TS-210、TS-519和TS-577。GWAS分析共檢測到2個與番茄果實光澤度顯著關聯(lián)的SNP位點：位于1號染色體63 041 874 bp位置的S01.1826715和位于5號染色體 8 787 996 bp 位置的S05.0271578，2個位點分別可以解釋15.67%和33.62%的表型變異。挖掘到2個調控番茄果實光澤度的候選基因，基因ID分別為Solyc05g014760和 Solyc05g014710，2個基因主要在番茄果實中表達，分別編碼細胞分裂蛋白激酶10和Remorin蛋白，與細胞壁形成、表皮角質積累的調控具有相關性。研究結果有助于解析番茄果實光澤度的遺傳基礎及其調控機制，為番茄外觀品質遺傳改良奠定基礎。

關鍵詞：番茄；果實；光澤度；全基因組關聯(lián)分析；候選基因

中圖分類號：S641.201? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）05-0036-06

果實光澤度是對果實表面反射光的能力進行衡量的一項指標，反射光能力越強則光澤度越高，反之則光澤度越低［1］。光澤度是評價果菜類蔬菜和水果外觀品質的重要農(nóng)藝性狀，也是影響其商品性的重要因素之一［2］。近年來，隨著我國社會經(jīng)濟水平的逐漸發(fā)展，大眾生活水平日益提高，人們在選擇消費蔬菜水果時，不僅考慮營養(yǎng)價值和風味，也對品種的外觀品質有了更高的要求。因此一些外觀整潔、表皮光滑、顏色鮮亮的品種深受人們的青睞［1，3-4］。

番茄（Solanum lycopersicum L.）是目前世界范圍種植最廣泛的蔬菜作物之一，富含番茄紅素、維生素C、葉酸、鉀等各類營養(yǎng)物質，商業(yè)價值高［5］。果實光澤度是番茄的重要外觀性狀之一，可以明顯提高番茄的商品品質，影響消費者的消費心理，提升消費者的購買欲。例如在市場上具有高果實光澤度的櫻桃番茄因其鮮艷和亮麗的外表，深受廣大消費者的喜愛，其市場價格遠比果實光澤度低的櫻桃番茄高。選育高果實光澤度的番茄品種符合當下市場需求，然而目前對調控番茄果實光澤度的基因了解甚少，番茄果實光澤度調控的機理還有待明確，因此挖掘高光澤番茄遺傳資源并選育高光澤番茄品種具有十分重要的科學與現(xiàn)實意義。

全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）是挖掘調控目標性狀基因的重要手段，利用GWAS可以快速獲得調控目標性狀表型變異的位點［6-7］。隨著各個物種基因組數(shù)據(jù)的逐漸完善，運用GWAS在不同物種中挖掘調控目標性狀的應用研究也越來越普遍，促進了作物遺傳改良和復雜農(nóng)藝性狀的研究［8-10］。例如Gai等通過多種GWAS模型鑒定出15個調控番茄蘋果酸含量的候選基因［11］。Wu等測定了擬南芥在不同生長條件下的代謝組，并將該數(shù)據(jù)作為表型與擬南芥群體基因型數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析，共鑒定出70個代謝調控關鍵基因［12］。GWAS在大豆、玉米、水稻等作物中挖掘并定位調控產(chǎn)量品質的基因及抗病基因也有廣泛應用［13-16］。

為了探究番茄品種風味上的馴化問題，Tieman等收集了包括現(xiàn)代、傳家寶以及野生型番茄在內的共398份番茄種質［17］。隨后，Zhu等在全世界范圍收集了610份番茄種質，用于多組學交叉分析，鑒定出5個影響番茄風味的主要位點，揭示了番茄風味馴化的進化途徑［18］。本研究以 Zhu等收集的番茄種質中的297份為材料，對果實光澤度進行檢測，并根據(jù)已發(fā)表的基因組重測序檢測到的SNP開展GWAS分析，挖掘與番茄果實光澤度關聯(lián)的遺傳位點和候選基因，為番茄果實光澤度調控基因的挖掘和高光澤番茄品種的選育提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料與田間種植

供試的297份番茄種質材料由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)基因組研究所黃三文課題組提供。2023年3月種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院位于南京市六合區(qū)的試驗基地。每份種質材料種植4株，株間距32 cm。整個生育期田間管理按照一般番茄溫室栽培生產(chǎn)管理措施進行。

1.2 番茄果實光澤度測定

番茄定植60 d后，選取第2穗完全成熟的果實，利用微孔光澤度儀（NHG60M，深圳市友利標準光源有限公司）測量果實光澤度，每份種質材料檢測3～8個果實，每個果實測定3次，取平均值。

1.3 表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

將297份供試材料的果實光澤度數(shù)據(jù)導入GraphPad Prism，進行方差分析、描述性統(tǒng)計分析和繪制柱狀分布圖。

1.4 全基因組關聯(lián)分析

番茄供試材料基因組序列來源于番茄重測序數(shù)據(jù)集［17-18］。從NCBI網(wǎng)站下載原始數(shù)據(jù)（PRJNA259308，PRJNA353161，PRJEB5235），用Trimmomatic 軟件進行過濾，去接頭和低質量位點，主要參數(shù)為：LEADING：15，TRAILING：15，SLIDINGWINDOW：4：20，MINLEN：50。使用BWA-MEM 將過濾好的測序數(shù)據(jù)fastq文件進行全基因組的比對，參考基因組為番茄SL2.50版本。經(jīng)過分析計算共篩選出1 048 575個SNP位點。

利用這些高質量的SNP和番茄群體果實光澤度統(tǒng)計數(shù)據(jù)，運用GAPIT Version 3（Genome Associated Prediction Integrated Tool）軟件選擇Fixed and random model Circulating Probability Unification （FarmCPU）和Bayesian-information and Linkage-disequilibrium Iteratively Nested Keyway （BLINK）進行關聯(lián)位點的檢測，并從軟件導出軟曼哈頓散點圖［19］。

1.5 候選基因分析

全基因組關聯(lián)分析得到與番茄抗旱性顯著關聯(lián)的SNP位點后，利用在線數(shù)據(jù)庫NCBI Genome Data Viewer和Sol Genomics Network（https：//solgenomics.net/）中番茄基因組信息SL2.50，找尋與番茄果實光澤度顯著關聯(lián) SNP 前后200 kb區(qū)間內調控番茄果實光澤度的基因，確定候選基因。

2 結果與分析

2.1 番茄群體果實光澤度評價

參考Zhu等的數(shù)據(jù)［18］，對本研究所用的297份番茄種質資源進行歸類統(tǒng)計。由圖1可見，供試群體材料包括201份大果番茄（BIG）、88份櫻桃番茄（CER）和8份醋栗番茄（PIM）。2023年春季材料定植60 d后，對第2穗完全成熟果實的光澤度進行評價分析，統(tǒng)計了平均值、標準差和變異系數(shù)等。結果表明，各種質果實光澤度在1.13～18.70之間，平均6.19，變異系數(shù)為43.60%，數(shù)據(jù)偏度為1.17，峰度為2.54，材料間的果實光澤度存在較大差異。對比不同類型種質材料的果實光澤度發(fā)現(xiàn)，大果番茄種質果實光澤度在1.40～18.70之間，平均6.71；櫻桃番茄種質果實光澤度在1.60～9.93之間，平均5.24；醋栗番茄種質果實光澤度在1.13～5.55之間，平均3.60。

大部分供試番茄材料的果實光澤度處于3～9之間，其中果實光澤度在3～5之間的87份，5～7之間的90份，7～9之間的62份，總計239份，占整個群體材料數(shù)量的80.47%（圖2）。果實光澤度最低的10份材料為TS-21、TS-413、TS-270、TS-594、TS-604、TS-256、TS-258、TS-272、TS-643和TS-195，包括6份大果番茄種質（TS-270、TS-604、TS-256、TS-272、TS-643和TS-195）、2份櫻桃番茄種質（TS-594和TS-258）、2份醋栗番茄種質（TS-21和TS-413）。這些種質的果實表皮暗淡無光，果實光澤度在1.13～2.30之間。果實光澤度最高的10份材料為TS-203、TS-653、TS-543、TS-588、TS-592、TS-587、TS-539、TS-210、TS-519和TS-577，均為大果型番茄。這些種質的果實表皮光亮，果實光澤度在11.90～18.70之間（圖3、圖4）。

2.2 番茄果實光澤度的GWAS分析

由圖5和圖6可見，運用GAPIT軟件的BLINK模型對番茄果實光澤度進行GWAS分析，共檢測到1個顯著關聯(lián)信號S01.1826715。該SNP位于1號染色體63 041 874 bp位置，基因型為G/A/R/-，處于基因Solyc01g057640的啟動子區(qū)域，可以解釋15.67%的表型變異（phenotype variance explained，PVE）（表1）。利用FarmCPU模型進行GWAS分析鑒定出1個與番茄果實光澤顯著關聯(lián)的SNP位點S05.0271578（圖7、圖8）。該SNP位于5號染色體 8 787 996 bp 位置， 基因型為G/R/-， 處于基因間區(qū)域，其表型變異解釋率更高，為33.62%（表1）。

2.3 番茄果實光澤度關聯(lián)候選基因預測

根據(jù)GWAS分析結果，參照番茄基因組 SL2.50，在1號染色體上SNP位點S01.1826715上下游200 kb的區(qū)域內共找到4個基因，基因ID分別為Solyc01g057610、Solyc01g057620、Solyc01g057630和Solyc01g057640。目前這些基因編碼的蛋白功能未知，還有待研究。第5號染色體的SNP位點S05.0271578上下游200 kb的區(qū)域內共包含17個基因，基因ID分別為Solyc05g014620、Solyc05g014630、Solyc05g014640、Solyc05g014650、Solyc05g014660、Solyc05g014670、Solyc05g014680、Solyc05g014690、Solyc05g014700、Solyc05g014710、Solyc05g014720、Solyc05g014730、Solyc05g014740、Solyc05g014750、Solyc05g014760、Solyc05g014780和Solyc05g014790。其中Solyc05g014620、Solyc05g014630、Solyc05g014660、Solyc05g014670、Solyc05g014680和Solyc05g014720編碼的蛋白功能未知；Solyc05g014730、Solyc05g014740和Solyc05g014750編碼DNA拓撲異構酶；Solyc05g014640編碼En/Spm亞類轉座子蛋白；Solyc05g014690編碼的蛋白為RNA解旋酶；Solyc05g014700編碼鹵素過氧化物酶；Solyc05g014650編碼的IOJAP蛋白在蛋白質翻譯過程中發(fā)揮作用；Solyc05g014790編碼脂氧合酶；Solyc05g014780編碼Ulp1蛋白酶。

多項研究表明植物細胞壁外側角質層的角質和蠟質含量與果實光澤度緊密相關［20-22］。結合基因注釋、遺傳變異以及番茄和其他物種中的研究報道情況，在第5號染色體SNP位點S05.0271578上下游200 kb的候選區(qū)間內篩選出2個可能參與調控番茄果實光澤度的候選基因：編碼細胞分裂蛋白激酶10的 Solyc05g014760和編碼Remorin蛋白的Solyc05g014710（表2）。據(jù)Tomato eFP Browser顯示，2個候選基因主要在番茄果實中表達［23］。另有研究指出細胞分裂蛋白激酶影響大麥細胞表層角質積累［24］；Remorin蛋白能調控植物細胞壁的形成［25-26］。這些研究數(shù)據(jù)結果說明了Solyc05g014760 和Solyc05g014710調控番茄果實光澤度的可能性。目前這些候選基因的生物學功能還有待驗證。

3 討論

目前關于番茄色澤的報道多數(shù)集中在顏色方面，較少涉及光澤方面［27-28］。且缺乏用于果皮光澤度測定的標準方法或專業(yè)器材，前期研究往往根據(jù)個人經(jīng)驗，用肉眼觀察的方法評價果實的光澤度，但是該方法主觀性太強，不能精確檢測出果實的光澤度。董邵云等利用HYD-09光澤度儀對黃瓜果皮表面的光澤度進行定量檢測，但方法對果實具有破壞性，且外界強自然光和角度都會影響測量結果［29］。分光測色計CM-700D測量口徑較大，用于測量番茄果實光澤度時要求果實表面能完全覆蓋測量口。由于櫻桃番茄果實較小，使用該儀器測量櫻桃番茄果實光澤度時，果實大小與測量口不能完全匹配，導致測量值重復性較差［30］。本研究采用微孔光澤度儀NHG60M，對297份番茄種質的果實光澤度進行快速無損測定。該儀器測量口徑小，適應于不同大小的番茄，操作便捷。鑒定出高果實光澤度和低果實光澤度的種質，這些種質可作為驗證候選基因功能的背景材料，有利于在遺傳進化水平上研究這些基因對于番茄果實光澤度的影響。

現(xiàn)有關于果實光澤度調控機理的研究主要集中在黃瓜上。多項研究表明黃瓜果皮光澤度由單基因控制，果皮暗淡（D）相對果皮光亮（d）為顯性［31-34］。Zhai等最新的研究通過圖位克隆首次定位了調控黃瓜果實光澤度的關鍵基因D，該基因編碼C2H2類型鋅指蛋白轉錄因子，通過直接促進靶基因CsGPAT4 和CsLTPG1的表達影響果實表皮角質和蠟質的生物合成及運輸，從而調控黃瓜果實表皮光澤度［3］。另有文獻報道，COPⅡ囊泡核心亞基CsSEC23通過影響蠟質和角質運輸至細胞壁外側調控黃瓜果皮光澤度［35］。目前與番茄果實光澤度相關的調控基因僅有少量報道，例如Liang等研究發(fā)現(xiàn)SlPP2C3基因沉默后能引起番茄果實外表皮結構變化從而導致果實光澤度顯著降低［36］。轉錄因子SlSHN2能夠影響角質和細胞壁形成相關的基因表達來調控番茄果實光澤度［37］。上述結果說明，調控果實光澤度的基因是通過影響細胞壁外側蠟質和角質的積累來發(fā)揮其功能。本研究通過GWAS分析獲得2個與番茄果實光澤度緊密連鎖的SNP位點：S01.1826715和S05.0271578，結合黃瓜和番茄中果實光澤度調控基因的研究，確定了2個可能調控番茄果實光澤度的候選基因，基因ID分別為Solyc05g014760和Solyc05g014710。2個基因主要在番茄果實中表達，且其同源基因能調節(jié)細胞壁形成、表皮角質積累［23-26］。

此外，本研究還在SNP位點S01.1826715和S05.0271578上下游200 kb區(qū)間內發(fā)現(xiàn)10了個功能未知的基因，基因ID分別為Solyc01g057610、Solyc01g057620、Solyc01g057630和Solyc01g057640、Solyc05g014620、Solyc05g014630、Solyc05g014660、Solyc05g014670、Solyc05g014680和Solyc05g014720。盡管這些基因的功能還有待研究，但不能排除它們參與調控番茄果實光澤度的可能性。

4 結論

綜上，本研究采用微孔光澤度儀NHG60M測定了297份番茄種質的果實光澤度，鑒定出果實光澤度最低的10份材料：TS-21、TS-413、TS-270、TS-594、TS-604、TS-256、TS-258、TS-272、TS-643 和TS-195；果實光澤度最高的10份材料：TS-203、TS-653、TS-543、TS-588、TS-592、TS-587、TS-539、TS-210、TS-519和TS-577。通過對番茄果實光澤度進行GWAS分析，共鑒定出2個與番茄果實光澤度緊密連鎖的SNP位點S01.1826715和S05.0271578；挖掘出2個調控番茄果實光澤度的候選基因，基因ID分別為Solyc05g014760和Solyc05g014710。已在其他研究中證明與2個候選基因與果實光澤度具有一定的相關性。本研究結果為番茄果實光澤度調控研究奠定了一定的理論基礎，將為高光澤番茄育種研究提供基因資源，具有潛在的應用價值。

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